CN110205259B - 一种基于水培柑橘枝条和菟丝子的柑橘黄龙病菌快速富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于水培柑橘枝条和菟丝子的柑橘黄龙病菌快速富集方法，通过采集田间感染柑橘枝条并构建对应的柑橘枝条水培体系，再建立基于柑橘枝条‑菟丝子的“Ca.L.asiaticus”富集体系，使“Ca.L.asiaticus”在菟丝子中大量富集；本发明得到的菟丝子样品中的“Ca.L.asiaticus”浓度平均增加了53倍，且富集所需要的时间大大缩短，实现了对“Ca.L.asiaticus”的高浓度、快速富集，而且获得的“Ca.L.asiaticus”富集后的菟丝子总DNA中干扰少，“Ca.L.asiaticus”基因组质量大大提高。
Description
技术领域
本发明属于生物学、植物病理学和基因组学技术领域。具体地，涉及一种基于水培柑橘枝条和菟丝子的柑橘黄龙病菌快速富集方法。
背景技术
柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害，该病最早在我国广东的潮汕地区被发现，至今已有百年历史(林孔湘，1956)。柑橘感染黄龙病后形成均匀黄化型或斑驳型黄梢，后期则呈现缺素状花叶、红鼻子果等症状，导致果实产量低、果品质劣。随着病害的不断传播蔓延，至今在我国19个柑橘栽培省、区中已有11个遭受到黄龙病的危害，受害面积占柑橘总栽培面积的80％以上，对我国柑橘产业造成了巨大的经济损失；然而目前尚未见有能够有效的治疗柑橘黄龙病的药剂，也没有抗、耐黄龙病的柑橘品种可供生产应用。
普遍认为我国的柑橘黄龙病是由α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)韧皮杆菌属的细菌引起的，该病原仅存在于柑橘植株的韧皮部内。根据16S rRNA基因序列、传播媒介昆虫以及对热的敏感性等不同可将其分为亚洲种(“Candidatus Liberibacterasiaticus”)、非洲种(“Ca.L.africanus”)和美洲种(“Ca.L.americanus”)。目前我国出现的黄龙病主要由亚洲种引起。柑橘黄龙病病原至今还无法进行人工分离培养，尽管早期有研究报道对黄龙病菌进行了纯化培养，并完成了Koch’s法则，但这一试验结果无法重复。因此，目前关于“Ca.L.asiaticus”的研究主要基于分析含有“Ca.L.asiaticus”的寄主材料或寄主总DNA。但是早期的研究发现田间染病的柑橘植株内的病原菌的含量并不高，而且分布也不均匀，很难获得含有高病原浓度的寄主材料，这进一步限制了对病原的描述和研究，尤其是在病原形态学和基因组学等方面的研究。因此，获取含有高浓度病原材料是研究“Ca.L.asiaticus”的前提，这就亟需对“Ca.L.asiaticus”进行有效的富集以提高样本中“Ca.L.asiaticus”的浓度从而达到研究的要求。
菟丝子(Cuscuta spp.)作为一种寄生性植物，能通过产生吸盘吸附在寄主植株的韧皮部和木质部上吸取寄主的水分和营养来维持生存。在从寄主吸取营养的过程中，菟丝子也同时可将寄生于韧皮部的微生物(细菌、病毒)传递到菟丝子本身，并介导传递到其他寄主上。早期研究发现，菟丝子能够将“Ca.L.asiaticus”从柑橘植株成功转移到长春花植株上并在长春花上进行富集，但传递周期较长，通常为3～6个月，而且“Ca.L.asiaticus”传递到长春花体内是否发生变异也不得而知。此外，有研究发现虽然“Ca.L.asiaticus”可在长春花上进行富集，但提取的总DNA中“Ca.L.asiaticus”所占的比例仍不是很高(Zheng etal.,2014)，这主要是由于在总DNA提取过程中仍存在大量寄主DNA的干扰。同时，前期带菌病芽的嫁接保存与长春花的培养需要的时间较长，导致在短时间内不易获取大量的病原菌。
因此，如何高效快速富集“Ca.L.asiaticus”，以获得含有高浓度的“Ca.L.asiaticus”的寄主材料，进而实现对“Ca.L.asiaticus”的研究是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服田间感染黄龙病的柑橘植株中“Ca.L.asiaticus”浓度较低且分布不均匀，且目前基于长春花的“Ca.L.asiaticus”富集方法周期长、效率低、病原变异率大，而导致“Ca.L.asiaticus”研究困难的缺陷和不足，提供一套快速、简易、高效地获取含有高浓度“Ca.L.asiaticus”寄主材料的方法。
本发明的目的在于提供一种基于水培柑橘枝条和菟丝子的柑橘黄龙病菌快速富集方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种基于水培柑橘枝条和菟丝子的柑橘黄龙病菌快速富集方法，包括以下步骤：
S1.感染“Ca.L.asiaticus”柑橘枝条的选取：采集田间感染了“Ca.L.asiaticus”的柑橘枝条，并将其置于无菌蒸馏水培养体系中；
S2.菟丝子的培养：将无菌菟丝子吸附于无菌寄主上，以获得大量的菟丝子卷须，菟丝子卷须长度应至少达到3cm且末端卷曲圈数至少1个；
S3.“Ca.L.asiaticus”的富集：将步骤S2的无菌菟丝子卷须缠绕在步骤S1水培的“Ca.L.asiaticus”柑橘枝条上，待菟丝子在柑橘枝条上形成稳固的吸盘后，立即截断菟丝子与无菌寄主之间的连接，菟丝子即可在吸取柑橘枝条养分的同时，吸取“Ca.L.asiaticus”，待菟丝子刚出现衰弱现象时，立即采集菟丝子，获得大量富集“Ca.L.asiaticus”的菟丝子。
本发明所述富集方法中，步骤S1采集田间感染了Ca.L.asiaticus”的柑橘枝条直接进行水培的目的在于能大大减少传统嫁接病芽获取病原材料所需的时间和带来的病原变异，由于不同地方的病枝条采集回来之后，长期的病芽保存、嫁接会使病原发生变异，这样就无法代表病样所在地区的病原；同时步骤S1采用无菌蒸馏水培养“Ca.L.asiaticus”柑橘枝条的目的是为了防止其它病原物侵染柑橘枝条，影响富集效果；通过直接水培含有“Ca.L.asiaticus”的柑橘枝条取代通过传统嫁接保存“Ca.L.asiaticus”的方法能避免经过多次柑橘枝条的嫁接而造成“Ca.L.asiaticus”发生变异；步骤S2是为了获得大量的菟丝子卷须，由于菟丝子属寄生性植物，需要寄生于对应的寄主上才能生存。因此，将种子萌发得到的菟丝子吸附在无菌健康寄主植物上进行培养以获取大量的菟丝子卷须；步骤S3中当菟丝子在柑橘枝条上形成稳固的吸盘时，此时截断菟丝子与无菌寄主之间的连接是因为此时菟丝子与柑橘枝条的寄生关系已经建立，菟丝子已经可以充分吸收柑橘枝条内的养分，而不需要无菌寄主再提供营养，若两者继续连接，菟丝子会继续从无菌寄主吸取养分而降低从柑橘枝条吸取养分和“Ca.L.asiaticus”的效率，削弱菟丝子对Ca.L.asiaticus的富集效果；当菟丝子开始出现衰弱现象时，立即采集菟丝子是因为此时柑橘枝条给予菟丝子的营养供应开始不足，菟丝子对于“Ca.L.asiaticus”的吸收速率也逐渐减慢，由于营养不足，菟丝子内的“Ca.L.asiaticus”也会开始消亡，因此此时采集菟丝子最好。以上步骤，均是是实现菟丝子高效、稳定、大量富集“Ca.L.asiaticus”的关键。
具体地，上述菟丝子吸附在柑橘枝条上形成稳固吸盘是指用棉签或其他物体轻轻触碰可明显感觉菟丝子吸盘无法被轻易挪动。
具体地，上述截断菟丝子与无菌寄主之间连接的时间点为菟丝子在柑橘枝条形成稳固吸盘时应立即截断，截断的部位应尽可能靠近菟丝子吸器的位置，让菟丝子以柑橘枝条作为唯一的养分来源，以吸取养分和“Ca.L.asiaticus”。
具体地，上述截断菟丝子与无菌寄主之间的连接后，应将水培“柑橘枝条-菟丝子”组合放置于温度22～25℃，空气湿度60～70％的条件下进行生长培育，以维持植物材料，以免柑橘枝条干的太快导致落叶。
具体地，所述菟丝子开始出现衰弱是指菟丝子的生长点即卷须末端稍向下弯曲。
优选地，步骤S1中，所述柑橘为宽皮柑橘类、橙类、柠檬和杂柑类中的任意一种，但不包括柚子类以及化州橘红。
具体地，步骤S1中，所述含有无菌蒸馏水培养体系为装载不含任何营养成分且必须经过高温高压灭菌的蒸馏水的离心管，以防止“Ca.L.asiaticus”或其他微生物混入水中，进而被柑橘枝条吸收或造成柑橘枝条死亡，影响最终的试验结果。
步骤S1中，所述感染了“Ca.L.asiaticus”的柑橘枝条的宽度为0.5～1cm，长度为15～20cm。
具体地，本发明中感染“Ca.L.asiaticus”柑橘枝条的选取与水培体系的构建方法为：
在田间采集带有黄龙病症状的柑橘枝梢(柑橘品种为宽皮柑橘类、橙类、柠檬或杂柑类中的任意一种，但不包括柚子类以及化州橘红)，采集幼嫩的柑橘枝梢，枝条宽度为0.5～1cm，枝条长度为15～20cm，选取2～3片采集的柑橘枝梢上症状典型的叶片进行DNA提取和“Ca.L.asiaticus”检测，检测结果呈阳性的柑橘枝条用棉花固定水培于含有蒸馏水的15mL离心管中，作为菟丝子富集的寄主材料。其中，柑橘枝梢上症状典型是指柑橘枝梢上的叶片斑驳或者出现红鼻子果现象；所用的蒸馏水是指不含任何营养成分且经过高温高压灭菌的蒸馏水。
优选地，步骤S2中，所述无菌菟丝子通过种子萌发获得，以确保菟丝子是无菌的。
对于无菌寄主的选择可以根据实际需要进行选择，具体以使菟丝子能够吸附在无菌寄主植株上，最终获取大量的菟丝子为准。
优选地，步骤S2中，所述无菌寄主为长春花。
优选地，步骤S3中，所述菟丝子卷须的应至少达到5cm且末端产生的卷曲圈数至少1个。
具体地，通过以下方法实现“Ca.L.asiaticus”的富集：通过将3～5cm长度的无菌菟丝子卷须缠绕在水培的柑橘枝条上，待菟丝子成功在柑橘枝条上形成稳固的吸盘后，立即截断其与长春花之间的连接，使菟丝子从柑橘枝条中吸取营养和水分，同时吸取“Ca.L.asiaticus”，将水培柑橘枝条-菟丝子组合放置于温度22～25℃，空气湿度60～70％的条件下进行生长培育，待吸附一段时间后，菟丝子开始出现衰弱现象，这时立即采集菟丝子的卷须和吸盘部分及靠近菟丝子吸盘的3片柑橘叶片，用于DNA提取。
通过上述方法得到的“Ca.L.asiaticus”的富集效果可以通过对比菟丝子和柑橘中的“Ca.L.asiaticus”浓度来评估，菟丝子和柑橘中“Ca.L.asiaticus”的浓度可以通过定量Real-time PCR技术进行定量分析得到。
同时，还可以选取部分柑橘样本和对应的菟丝子样本进行切片观察，选取吸盘和近吸盘1～2cm内的菟丝子卷须作为观察材料，柑橘叶片选取叶片基部的叶中脉组织进行观察，通过观察柑橘和菟丝子切片中“Ca.L.asiaticus”的形态、数量以及难易程度评估富集的效果；
还可以选取部分柑橘样本和对应的菟丝子DNA总样本进行基因组测序，采用“Ca.L.asiaticus”A4菌株(Genebank ID:gb∣CP010804.1)基因组作为参考基因组进行测序拼接，分别对比以柑橘和菟丝子总DNA进行测序和拼接后得到的N50等基因组参数的大小、基因组的coverage、基因组的长度等参数来评估拼接的质量，从而进一步评估菟丝子富集后对“Ca.L.asiaticus”基因组测序与拼接的影响。
作为一种优选地实施方式，本发明基于水培柑橘枝条和菟丝子的柑橘黄龙病菌快速富集的方法包括如下步骤：
(1)感染“Ca.L.asiaticus”柑橘枝条的选取与水培体系的构建
田间采集表现黄龙病症状的柑橘枝梢(柑橘品种包括宽皮柑橘类、橙类、柠檬以及杂柑类品种，但不包括柚子类以及化州橘红)，采集的柑橘枝条应是幼嫩的枝梢，枝条宽度为0.5cm～1cm之间，枝条长度为15～20cm；选取采集的柑橘枝梢上症状典型的叶片(2～3片)进行DNA提取和“Ca.L.asiaticus”检测，检测结果呈阳性的柑橘枝条用棉花固定水培于含有蒸馏水(不含任何营养成分且必须经过高温高压灭菌)的15mL离心管中，作为菟丝子富集的寄主材料。
(2)健康菟丝子材料的培养
为确保菟丝子是无菌的，菟丝子由种子萌发获得；但菟丝子属寄生性植物需要寄生于对应的寄主上才能生存。因此，将种子萌发得到的菟丝子吸附在无菌健康的长春花植株上进行培养以获取大量的菟丝子卷须，用于吸附柑橘枝条的菟丝子卷须长度应至少达到3cm且具有良好的生长趋势/生长点，菟丝子卷须末端开始或已经形成卷曲形状为最佳。
(3)“Ca.L.asiaticus”富集体系的建立
通过将合适长度的无菌菟丝子卷须缠绕在水培的柑橘枝条上，待菟丝子成功在柑橘枝条上形成稳固的吸盘后(形成稳固吸盘的标准是用棉签轻轻触碰可明显感觉无法挪动菟丝子的吸盘为宜)，截断其与长春花之间的连接，使菟丝子从柑橘枝条中吸取营养和水分，同时吸取“Ca.L.asiaticus”。将水培柑橘枝条-菟丝子组合放置于温度22～25℃，空气湿度60～70％的条件下进行生长培育。吸附一段时间后，菟丝子开始出现衰弱现象(判断标准为菟丝子的生长点/卷须的末端开始出现稍向下弯曲呈萎蔫状)，此时立即采集菟丝子(包括菟丝子的卷须和吸盘部分)和采集靠近菟丝子吸盘的柑橘叶片(2～3片)用于DNA提取。
(4)“Ca.L.asiaticus”富集效果的评估
通过定量Real-time PCR技术分别对菟丝子和对应的柑橘叶片中的“Ca.L.asiaticus”进行定量分析，通过对比菟丝子和柑橘中的“Ca.L.asiaticus”浓度来评估“Ca.L.asiaticus”的富集效果；选取部分柑橘样本和对应的菟丝子样本进行电镜观察，对柑橘叶片与其对应的菟丝子材料进行固定、切片、电镜观察时，菟丝子材料选取吸盘以及靠近吸盘1-2cm内的卷须，柑橘叶片选取叶片基部的叶中脉组织进行观察，通过观察柑橘和菟丝子切片中“Ca.L.asiaticus”的形态、数量以及难易程度评估富集的效果；选取部分柑橘样本和对应的菟丝子DNA总样本进行基因组测序，测序拼接采用“Ca.L.asiaticus”A4菌株(Genebank ID:gb∣CP010804.1)基因组作为参考基因组进行拼接，分别对比以柑橘和菟丝子总DNA进行测序和拼接后得到“Ca.L.asiaticus”基因组的N50、相似性等基因组参数的大小来评估拼接的质量，从而进一步评估菟丝子富集后对“Ca.L.asiaticus”基因组质量的影响。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于水培柑橘枝条和菟丝子的柑橘黄龙病菌快速富集方法，通过采集田间感染柑橘枝条并构建对应的柑橘枝条水培体系，再利用菟丝子可以吸附“Ca.L.asiaticus”的特性，建立基于柑橘枝条-菟丝子的“Ca.L.asiaticus”富集体系，使“Ca.L.asiaticus”在菟丝子中大量富集；得到的菟丝子样品中的“Ca.L.asiaticus”浓度较柑橘叶片样品中平均增加了53倍，且富集所需要的时间缩短至7～20天，实现了对“Ca.L.asiaticus”的高浓度、快速富集，而且获得的“Ca.L.asiaticus”富集后的菟丝子总DNA中寄主DNA的干扰少，“Ca.L.asiaticus”基因组质量大大提高；利用本发明所述方法能够简易、高效地获得含有高浓度且未变异的“Ca.L.asiaticus”材料，解决了现有“Ca.L.asiaticus”富集方法中“Ca.L.asiaticus”富集周期长、效率低、DNA质量不高、易发生变异的问题，促进“Ca.L.asiaticus”形态学和基因组学研究的发展。
附图说明
图1为本发明“Ca.L.asiaticus”富集体系的建立图；A：水培感染黄龙病的柑橘枝条；B：在健康长春花上生长的健康的菟丝子；C：菟丝子卷须寄生在黄龙病的柑橘枝条上；D：菟丝子在柑橘枝条上产生吸器；E：菟丝子生长开始衰弱时，立即采集菟丝子样本(包括卷须和吸器部位)进行DNA提取；F：菟丝子吸器对柑橘枝条造成的伤口；G：采集三片靠近寄生位点的柑橘叶片进行DNA提取。
图2为柑橘叶中脉和对应菟丝子中“Ca.L.asiaticus”浓度的比值；横坐标编号为48组柑橘-菟丝子材料对应的编号，纵坐标为柑橘叶中脉中“Ca.L.asiaticus”浓度和对应菟丝子中“Ca.L.asiaticus”浓度的比值，比值大于1说明达到了富集的效果。
图3为电镜观察柑橘和对应菟丝子中的“Ca.L.asiaticus”；A：菟丝子材料，其中细胞内充满了多种形态结构的“Ca.L.asiaticus”；B：柑橘叶中脉材料，其中细胞中几乎很难找到“Ca.L.asiaticus”。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
一种基于水培柑橘枝条和菟丝子的柑橘黄龙病菌快速富集方法及富集效果评估，包括以下步骤：
(1)感染“Ca.L.asiaticus”柑橘枝条的采集与保存
柑橘黄龙病枝条在从田间带回实验室之前使之保持湿润。将采集的柑橘枝条统一截取，长度控制在30cm。柑橘枝条用棉花固定水培于含有灭菌蒸馏水的15mL离心管中，培养期间定期加水以保持柑橘枝条最底部下部一直处于水位下方。同时采集柑橘枝条的3片叶片进行叶中脉DNA的提取和“Ca.L.asiaticus”检测；检测结果呈阳性，并且能在蒸馏水中保持两天以上，无大量叶片脱落的枝条方可用于下一步实验(如附图1A所示)。
(2)样品DNA的提取
选择带有典型斑驳症状的柑橘叶片，剪取叶中脉100mg置于2.0mL离心管中，加入500mL提取液和1颗磁珠，置于MP FastPrep-24磨样机上打碎。利用OMEGA公司E.Z.N.A.TM植物基因组DNA试剂盒提取基因组DNA，用1％(质量体积比)的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
(3)健康菟丝子材料的培养
选取饱满的长春花种子和菟丝子种子，先播种长春花种子，半个月后在同一个盆子内播种菟丝子种子，每个盆子播3粒长春花种子和10粒菟丝子种子。半个月后，长春花出芽抽出新苗，此时菟丝子发芽抽丝，便可吸附在新苗上，使之寄生在健康长春花上并大量繁殖；7天左右，菟丝子便可在健康长春花上产生大量的卷须，并使卷须至少伸长至5cm以上且末端产生的卷曲圈数至少1个，备用(如附图1B所示)。
(4)“Ca.L.asiaticus”富集体系的建立
将步骤(2)中生长到适宜长度的菟丝子卷须缠绕在含有“Ca.L.asiaticus”柑橘枝条的幼嫩部位，来自同一棵长春花的菟丝子可缠绕在同一柑橘枝条上，但不同柑橘枝条需要使用不同长春花上的菟丝子进行吸附(如附图1C所示)。待菟丝子产生吸器并稳定吸附在柑橘枝条上后(形成稳固吸盘的标准是用棉签轻轻触碰可明显感觉无法挪动菟丝子的吸盘为宜)，切断菟丝子与长春花的连接，使菟丝子从柑橘枝条上吸取生长所需的营养并同时吸取“Ca.L.asiaticus”(如附图1D所示)。将水培柑橘枝条-菟丝子组合放置于温度22～25℃，空气湿度60～70％的条件下进行生长培育。吸附在柑橘枝条上的菟丝子在生长一段时间后，会出现衰弱(萎蔫)趋势(判断标准为菟丝子的生长点/卷须的末端开始出现稍向下弯曲呈萎蔫状)，在菟丝子吸附的时期内，每天观察菟丝子的生长情况，在菟丝子刚开始出现衰弱的时候，立即采集菟丝子的卷须和吸盘部分，同时采集靠近菟丝子吸盘的柑橘叶片3片用于DNA提取，DNA的提取采用OMEGA公司E.Z.N.A.TM植物基因组DNA试剂盒进行提取。
(5)利用Real-time PCR评估“Ca.L.asiaticus”的富集效果
柑橘黄龙病菌Real-time PCR采用Li et al.(2006)报道的特异性引物HLBas/HLBr和探针HLBp，对提取的柑橘叶中脉和菟丝子的DNA进行TaqMan实时荧光定量PCR检测，体系的配制及后续操作均在冰盒上进行，同时将质粒按10倍浓度梯度稀释成8倍浓度梯度，每个浓度梯度各取1μL质粒DNA为模板，通过实时荧光定量PCR进行定量，生成扩增曲线，用于拷贝数的计算；荧光定量PCR反应体系共20μL，扩增体系为：ddH2O 8μL，Master mix 10μL，Primer HLBas 0.4μL，Primer HLBr 0.4μL，Probe HLBp 0.2μL，DNA模板1.0μL。反应条件为95℃，5min；95℃，10s，60℃，30s；重复40个循环；
以提取的柑橘叶中脉和菟丝子的DNA为模板，并以灭菌的ddH2O为空白对照，以健康的柑橘叶中脉DNA为阴性对照，以含柑橘黄龙病病原菌的柑橘叶中脉所提取的DNA为阳性对照，进行荧光定量PCR扩增；反应结束得到溶解曲线和CT值，同时也得到质粒扩增的线性标准曲线，根据标准曲线以及拷贝数与CT值的关系，计算出各个样品中“Ca.L.asiaticus”的数量，用Qubit对DNA浓度进行精确定量，最终以“Ca.L.asiaticus”细胞个数/ng总DNA来表示柑橘和菟丝子样本中“Ca.L.asiaticus”的浓度，对比柑橘枝条和菟丝子中的“Ca.L.asiaticus”浓度，来评价菟丝子的富集效果。
(6)通过形态学评估“Ca.L.asiaticus”的富集效果：
通过固定-脱水-透明-浸蜡-包埋-切片-贴片-脱蜡-染色进行柑橘叶中脉和菟丝子材料中“Ca.L.asiaticus”的观察，在显微镜下观察，对好的视野拍照，做好记录，比较柑橘叶中脉和对应菟丝子组织中“Ca.L.asiaticus”的数量、观察的难易程度进行比较评估分析。
(7)通过基因组学评估“Ca.L.asiaticus”的富集效果
通过选取部分上述提取的柑橘叶中脉总DNA和菟丝子总DNA分别进行建库和测序，建库和测序由测序公司完成，测序平台选用Illumina Hiseq测序平台，每个样本测序量控制在10G/clean data。测序得到的数据通过CLC Genomic Workbench或Bowtie 2.0以A4菌株(Genebank ID:gb∣CP010804.1)基因组作为参考基因组进行拼接，分别对比以柑橘和菟丝子总DNA进行测序和拼接后得到的N50等基因组参数的大小、基因组的coverage、基因组的长度等参数来评估拼接的质量。
应用例
本应用例为按照实施例1所述基于水培柑橘黄龙病枝条和菟丝子的“Ca.L.asiaticus”快速富集与效果评估方法进行的实际检测。
(1)2016年3月至2017年12月，在广东、云南和浙江三省的柑橘园采集表现黄龙病典型症状(斑驳、红鼻子果)的柑橘树新梢，其中包括砂糖橘、柠檬、贡柑和年橘4个品种，共55个枝条可用于实验，具体材料信息见表1。
(2)采用实施例1步骤(2)和(3)分别对柑橘枝条进行“Ca.L.asiaticus”的检测并构建水培柑橘枝条-菟丝子的富集体系，通过对上述55组柑橘-菟丝子富集组合进行观察发现，共有48组枝条上的菟丝子成功吸附并存活，存活率高达高达87％，其中菟丝子自截断后，可在柑橘枝条上存活5～24天(见表1)，富集时间缩短至7～20天。
(3)采用上述步骤(4)，通过实时荧光定量PCR得到了标准方程y＝-3.201x+42.7(R2＝0.999)，以定量每纳克总DNA中CLas细胞的个数，所有成功寄生的菟丝子经检测均呈阳性，其中“Ca.L.asiaticus”浓度在10～834,072个细菌/ng总DNA。定量分析结果表明，在48组成功吸附的菟丝子中，30个菟丝子样品中“Ca.L.asiaticus”浓度高于与其对应的柑橘叶中脉样品(如表1所示)，与柑橘叶片样品相比，这30个菟丝子样品中CLas浓度增加了2～419倍，平均增加了53倍(如附图2所示)。
表1富集的柑橘材料与菟丝子中“Ca.L.asiaticus”的浓度比较
(4)采用上述步骤(5)分别选取柑橘叶中脉样本和对应的菟丝子样本进行固定、切片和电镜观察。电镜观察发现(如附图2所示)，柑橘叶中脉样本中几乎很少或很难找到含有大量“Ca.L.asiaticus”的细胞，但菟丝子的卷须材料中可以明显发现含有大量的“Ca.L.asiaticus”，并充满了整个细胞，验证了菟丝子富集后的材料更合适用于“Ca.L.asiaticus”的形态学观察和后续的研究。
(5)采用上述步骤(6)分别选取三组柑橘总DNA和菟丝子总DNA进行测序与序列的拼接。通过对拼接结果进行统计发现(如表2所示)，使用“Ca.L.asiaticus”富集后的菟丝子DNA作为模板进行测序可提高测序结果中“Ca.L.asiaticus”reads所占的比例，同时通过denovo assembly发现，相比于柑橘测序数据拼接结果，菟丝子的测序数据拼接能得到的“Ca.L.asiaticus”基因组具有更长的N50，且contigs的数量要少，说明采用“Ca.L.asiaticus”富集后的菟丝子总DNA进行测序与拼接可以显著提高“Ca.L.asiaticus”基因组的质量，也再一次验证了菟丝子富集“Ca.L.asiaticus”的益处。
表2基于菟丝子和柑橘/柠檬寄主总DNA测序和“Ca.L.asiaticus”的拼接结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种基于水培柑橘枝条和菟丝子的柑橘黄龙病菌快速富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.感染“Ca. L. asiaticus”柑橘枝条的选取：采集田间感染了“Ca. L. asiaticus”的柑橘枝条，将其置于无菌蒸馏水培养体系中；
S2.菟丝子的培养：将无菌菟丝子吸附于无菌寄主上，以获得大量的菟丝子卷须，菟丝子卷须长度不小于3cm且末端卷曲圈数至少1个；
S3.“Ca. L. asiaticus”的富集：将步骤S2的无菌菟丝子卷须缠绕在步骤S1水培的“Ca. L. asiaticus”柑橘枝条上，待菟丝子在柑橘枝条上形成稳固的吸盘后，立即截断菟丝子与无菌寄主之间的连接，菟丝子即可在吸取柑橘枝条养分的同时，吸取“Ca. L.asiaticus”，待菟丝子刚出现衰弱现象时，立即采集菟丝子，获得大量富集“Ca. L.asiaticus”的菟丝子；
所述柑橘为砂糖橘、柠檬或年橘；
步骤S1中，所述感染了“Ca. L. asiaticus”的柑橘枝条的宽度为0.5～1 cm，长度为15～20 cm。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述无菌菟丝子为通过无菌种子萌发获得。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述无菌寄主为长春花。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述菟丝子卷须的长度为不小于5cm且末端卷曲圈数至少1个。
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| CN105830749A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-08-10 | 福建省农业科学院果树研究所 | 利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法 |
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