CN105532470B - 蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基及脱毒育苗方法 - Google Patents
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Abstract
一种蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基，包括不同培养时期的五种培养基：(1)超低温预培养基，(2)超低温保存脱毒培养基，(3)恢复培养基，(4)芽增殖诱导培养基，(5)生根壮苗培养基。这五种培养基均以WPM为基本培养基,附加蔗糖等原料，pH5.2。用上述五种培养基进行蓝莓干燥冷冻脱毒育苗方法经过如下六个步骤：一是蓝莓茎尖干燥脱水培养，二是茎尖分离剥取、超低温预培养及超低温培养，三是恢复培养，四是脱毒材料病毒检测，五是脱毒芽诱导增殖培养，六是生根培养。应用本方法脱毒，操作简便、成本低、茎尖成活率高、脱毒率高，再生植株能保持母本的优良性状，并能缩短育苗周期，利于满足社会需求。
Description
技术领域
本发明属于植物组培脱毒育苗技术，具体是涉及一种以蓝莓茎尖为外植体，干燥结合冷冻脱毒组培育苗培养基以及脱毒育苗方法。
背景技术
蓝莓原产北美，属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium spp.)为多年生落叶或常绿灌木，果实富含花色苷等抗氧化物质，具有改善视力、抗氧化、抗癌及延缓脑神经衰老等保健功能，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一，同时也被誉为“浆果之王”。
我国蓝莓引种栽培研究始于20世纪末,近年来栽培面积正快速增加，但果农对病毒病害的发生发展缺乏认知和防治经验，从而存在病毒病害快速传播而后严重暴发的巨大潜在危险。蓝莓病毒病害常引起叶片褪绿、畸形、脱落、黄化或斑驳，花瓣变红或枯萎，茎部畸形弯曲、表皮形成红色条纹或发生顶梢枯死，树体矮化、减产或死亡等症状，严重时减产，甚至绝产。目前，已发现10余种侵染蓝莓的病毒，尤其以蓝莓休克病毒(Blueberry shockvirus,BlShV)、蓝莓鞋带病毒(Blueberry shoestring virus，BBSSV)、蓝莓枯萎病毒(Blueberry scorch virus，BLSCV)等危害为主。其中，蓝莓休克病毒为目前危害蓝莓最严重的病毒之一。BlShV病毒可通过蜜蜂携带感染的花粉传播，几乎侵染所有的蓝莓品种，并表现相似的症状。据统计，BlShV侵染蓝莓造成的损失可高达34％～90％。截止目前，还没有任何针对病毒病的有效药物，只以预防为主，其中无病毒种苗培育为最关键的措施之一。
为避免病毒给生产带来的巨大危害，实现蓝莓的无病毒苗栽培是目前我国蓝莓产业快速发展的必经之路。目前，无病毒苗主要通过热处理脱毒法、茎尖脱毒法、花药培养法、微茎尖嫁接脱毒法、愈伤组织培养法和抗病毒剂法等生物技术方法获取，其中热处理结合茎尖脱毒法运用最为广泛，然而此法与新兴的茎尖低温结合超低温脱毒法相比，仍存在操作难度大、耗时长以及脱毒率偏低等明显缺点。茎尖超低温脱毒法是一种新型高效脱除植物病毒的新技术，已在马铃薯、柑桔、葡萄、樱桃、草莓、甘薯等植物上进行研究并取得了一定成果，被认为是目前最有效脱除植物病毒的方法之一，冷冻脱毒法中分为快速冷冻法、慢速冷冻法、分步冷冻法、干燥冷冻法等，其中快速冷冻法、慢速冷冻法需要昂贵精密的培养箱，且对梯度温度控制难度较大，干燥冷冻法仅需采用干燥器控制材料脱水速度和脱水程度，操作简便，周期短。
经检索，尚未发现有关蓝莓组培苗脱毒方面的资料报道。因此，研发蓝莓茎尖干燥冷冻脱毒组培育苗技术，不但为蓝莓，还为木本果树组培脱毒育苗开劈了一条新途径或借鉴之路。
发明内容
针对蓝莓的经济价值越来越被人们认识，发展蓝莓生产的热情高涨，依靠传统的扦插育苗和组培育苗，从数量和质量上均无法满足现实生产的需求，为此，本发明要解决的技术问题是提供一种以蓝莓茎尖为外植体，干燥冷冻组培脱毒育苗培养基及脱毒育苗方法。
本发明的技术问题通过如下技术方案解决：
本蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基，包括不同诱导时期的五种培养基，各种培养基的原料及其附加量分别是：
(1)超低温预培养基：WPM培养基+20ml·L-1甘油+136.8g·L-1蔗糖，pH5.2；
(2)超低温培养基：WPM培养基+300ml·L-1甘油+150ml·L-1乙二醇+150ml·L-1二甲基亚枫即DMSO+136.8g·L-1蔗糖，pH5.2；
(3)恢复培养基：WPM培养基+0.1mg·L-1玉米素即ZT+0.1mg·L-11-萘乙酸即NAA+0.1mg·L-1赤霉素即GA3+8.0g·L-1琼脂粉+30g·L-1蔗糖，pH5.2；
(4)芽增殖诱导培养基：WPM培养基+0.5mg·L-1ZT+0.1mg·L-1NAA+0.1mg·L-1GA3+8.0g·L-1琼脂粉+30g·L-1蔗糖，pH5.2；
(5)生根壮苗培养基：WPM培养基+0.1mg·L-1NAA+8.0g·L-1琼脂粉+30g·L-1蔗糖，pH5.2。
用上述的培养基进行蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗方法经过下列步骤：
(1)蓝莓茎尖干燥培养：选取组培继代培养40±2d的蓝莓无菌苗形态学上端长为0.5～1.0cm的顶芽，置于无菌培养皿中，加盖，但不密封，将该培养皿置于真空干燥器中，于室温下干燥脱除鲜重重量10％～30％的水分；
(2)茎尖分离剥取及超低温培养：在体视显微镜下剥取经干燥脱水处理的顶芽茎尖，茎尖长为1.0～1.5mm，置于1.8ml冷冻管中，每管置10个茎尖，加入超低温预培养基2～5ml，在0℃条件下处理10～70min，用无菌枪头吸出超低温预培养基，加入2ml超低温培养基，并将冷冻管置于0℃冰水混合物中处理60min，将冷冻管放入自制纱布袋中，迅速投入液氮中，保存60～120min后，从液氮中迅速取出冷冻管，立即进行40℃水浴化冻处理0.2～1.5min，再送入0℃冰水混合物中处理10min；将茎尖用WPM培养基+410.4g·L-1蔗糖溶液清洗3次，每次10min，取出茎尖置于无菌滤纸上以吸去残留在茎尖表面的液体，待接种到恢复培养基；
(3)恢复培养：为了减少培养过程中温度和光照的抑制，将超低温培养的茎尖接种至恢复培养基中先在0℃条件下暗培养5～7d(这更有利于蓝莓茎尖离体材料恢复生长)，再转移至光暗周期为光16h/暗8h的条件下培养30d，培养温度为25±2℃；
(4)病毒检测：将以上通过干燥冷冻培养获得的试管离体材料通过RT-PCR反转录病毒检测，经检测确认不带病毒，即为蓝莓脱毒种苗；
(5)芽诱导增殖培养：病毒检测后确定脱毒的成活茎尖转接至芽增殖诱导培养基中培养增殖出不定芽；微电脑时控开关控制培养室每日光照时间，每日光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40～50μmol m-2s-1，培养温度为25±2℃；
(6)生根培养：将步骤(5)所述的不定芽在生根壮苗培养基中诱导生根，培养30～45d，生根率达95％，光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为30～40μmol m-2s-1，培养温度为25±2℃。
本发明的有益效果是：
应用本蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒法培育蓝莓脱毒组培苗，操作简便，无需昂贵精密的仪器设备，成本低，周期短，同时，再生植株能较好地保持母本的优良性状，长势强、遗传稳定性好，苗木健壮、有良好的抗逆性。与常规茎尖脱毒相比，本方法还具有成活率高、脱毒效率高等显著优点。
以蓝莓茎尖结合冷冻干燥脱除BlShV病毒为例，经对比试验，将脱毒芽增殖并进行RT-PCR病毒检测，其成活率为78.3％，脱毒率高达95.7％。
附图说明
附图为蓝莓脱毒种苗RT-PCR扩增结果凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明下面结合实施例作进一步详述：本蓝莓茎尖冷冻干燥组培脱毒方法,首先是选取组培继代培养40±2d的蓝莓无菌苗形态学上端长为0.5～1.0cm的顶芽，置于无菌培养皿中，加盖，但不密封，将该培养皿置于真空干燥器中，于室温下干燥脱除鲜重的10％～30％水分后在体视显微镜下剥取长为1.0～1.5mm的顶芽茎尖，置于1.8ml冷冻管中，每管置10个茎尖，加入超低温预培养基2～5ml，在0℃条件下处理10～70min，用无菌枪头吸出超低温预培养基，加入2ml超低温培养基，并将冷冻管置于0℃冰水混合物中处理60min，将冷冻管放入自制纱布袋中，迅速投入液氮中,保存60～120min后，从液氮中迅速取出冷冻管，立即进行40℃水浴化冻处理0.2～1.5min，再送入0℃冰水混合物中处理10min；将茎尖用WPM培养基+410.4g·L-1蔗糖溶液清洗3次，每次10min，取出茎尖置于无菌滤纸上以吸去残留在茎尖表面的液体，接种到恢复培养基中培养35d后进行病毒检测，将经检测确认不带病毒的蓝莓脱毒种苗进行芽诱导增殖及生根培养。本实验是在每组重复3次，每种基本培养基有20个外植体的对比试验得出的，经该干燥冷冻方法脱毒的茎尖，成活率、脱毒率高，再生苗健壮。
本发明所公开的五种在特定阶段配合应用的培养基及各相关参数、条件如温度、凝固剂等也可用诸如葡萄糖、水晶洋菜等替代，培养基各原料的配比值也可分别采用本发明最佳方案定值的接近值取代。
下面给出的是本发明的最佳实施例。
本蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基，包括不同诱导时期的五种培养基，各种培养基的原料及其附加量分别是：
(1)超低温预培养基：WPM培养基+20ml·L-1甘油+136.8g·L-1蔗糖，pH5.2；
(2)超低温培养基：WPM培养基+300ml·L-1甘油+150ml·L-1乙二醇+150ml·L-1二甲基亚枫即DMSO+136.8g·L-1蔗糖，pH5.2；
(3)恢复培养基：WPM培养基+0.1mg·L-1玉米素即ZT+0.1mg·L-11-萘乙酸即NAA+0.1mg·L-1赤霉素即GA3+8.0g·L-1琼脂粉+30g·L-1蔗糖，pH5.2；
(4)芽增殖诱导培养基：WPM培养基+0.5mg·L-1ZT+0.1mg·L-1NAA+0.1mg·L-1GA3+8.0g·L-1琼脂粉+30g·L-1蔗糖，pH5.2；
(5)生根壮苗培养基：WPM培养基+0.1mg·L-1NAA+8.0g·L-1琼脂粉+30g·L-1蔗糖，pH5.2。
应用本蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基进行组培脱毒育苗方法，经过下列步骤：
(1)蓝莓茎尖干燥培养：选取组培继代培养40±2d的蓝莓无菌苗形态学上端长为0.5～1.0cm的顶芽，置于无菌培养皿中，加盖，但不密封，将该培养皿置于真空干燥器中，于室温下干燥脱除鲜重重量10％～30％的水分；
(2)茎尖分离剥取及超低温培养：在体视显微镜下剥取经干燥脱水处理的顶芽茎尖，茎尖长为1.0～1.5mm，置于1.8ml冷冻管中，每管置10个茎尖，加入超低温预培养基2～5ml，在0℃条件下处理10～70min，用无菌枪头吸出超低温预培养基，加入2ml超低温培养基，并将冷冻管置于0℃冰水混合物中处理60min，将冷冻管放入自制纱布袋中，迅速投入液氮中，保存60～120min后，从液氮中迅速取出冷冻管，立即进行40℃水浴化冻处理0.2～1.5min，再送入0℃冰水混合物中处理10min；将茎尖用WPM培养基+410.4g·L-1蔗糖溶液清洗3次，每次10min，取出茎尖置于无菌滤纸上以吸去残留在茎尖表面的液体，待接种到恢复培养基；
(3)恢复培养：为了减少培养过程中温度和光照的抑制，将超低温培养的茎尖接种至恢复培养基中先在0℃条件下暗培养5～7d(这更有利于蓝莓茎尖离体材料恢复生长)，然后再转移至光暗周期为光16h/暗8h的条件下培养30d，培养温度为25±2℃；
(4)病毒检测：将以上通过干燥冷冻培养获得的试管离体材料通过RT-PCR反转录病毒检测，经检测确认不带病毒，即为蓝莓脱毒种苗；
(5)芽诱导增殖培养：病毒检测后确定脱毒的成活茎尖转接至芽增殖诱导培养基中培养增殖出不定芽；微电脑时控开关控制培养室每日光照时间，每日光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40～50μmol m-2s-1，培养温度为25±2℃；
(6)生根培养：将步骤(5)所述的不定芽在生根壮苗培养基中诱导生根，培养30～45d，生根率达95％，光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为30～40μmol m-2s-1，培养温度为25±2℃。
上述培养基中WPM培养基及其它相关化学品可市售获得，按商品说明书配用，为同行所公知。
本申请人下面对试验的情况介绍如下：
(1)蓝莓茎尖干燥培养：选取组培继代培养42d的蓝莓无菌苗形态学上端长为0.5～1.0cm的顶芽，置于无菌培养皿中，加盖，但不密封，将该培养皿置于真空干燥器中，于室温下干燥脱除鲜重20％的水分；
(2)茎尖分离剥取及超低温培养：在体视显微镜下剥取经干燥脱水处理长为1.0～1.5mm的顶芽茎尖，置于1.8ml冷冻管中，每管置10个茎尖，加入超低温预培养基2～5ml，在0℃条件下超低温预培养30min，用无菌枪头吸出超低温预培养基，加入2ml超低温培养基，并将冷冻管置于0℃冰水混合物中处理60min，将冷冻管放入自制纱布袋中，迅速投入液氮中,于-196℃超低温培养90min后，从液氮中迅速取出冷冻管，立即进行40℃水浴化冻处理0.5min，再送入0℃冰水混合物中处理10min；将茎尖用WPM培养基+410.4g·L-1蔗糖溶液清洗3次，每次10min，取出茎尖置于无菌滤纸上以吸去残留在茎尖表面的液体，待接种到恢复培养基中进行恢复培养；
(3)恢复培养：为了减少培养过程中温度和光照的抑制，将超低温培养的茎尖接种至恢复培养基中先在0℃条件下暗培养6d(这更有利于蓝莓茎尖离体材料恢复生长)，再转移至光暗周期为光16h/暗8h的条件下培养30d，培养温度为25℃；
(4)病毒检测：将以上通过干燥冷冻培养获得的试管离体材料通过RT-PCR反转录病毒检测，经检测确认不带病毒，即为蓝莓脱毒种苗；
检测方法采用“蓝莓休克病毒的RT-PCR快速检测方法”建立参阅《北方园艺》，，2015年，第20期，98-101页公开的检测方法，(谢丽雪等)，具体如下：提取脱毒苗总RNA，以cDNA第一链、BlShV外壳蛋白基因序列特异引物BlShV－f：5′－CCCCAAAGGATAAACAGGTCCA－3′，BlShV－r：5′－TCACCACGTACAAATCCCT－3′进行扩增，扩增条件为：94℃5min；94℃30s、56℃45s、72℃1min，35个循环，最后一轮循环后72℃延伸10min。PCR扩增产物经琼脂凝胶电泳后用凝胶成像系统记录结果，预期扩增的片段大小为450bp。
(5)芽诱导增殖培养：将病毒检测后确定脱毒的成活茎尖转接至芽增殖诱导培养基中培养增殖出不定芽；微电脑时控开关控制培养室每日光照时间，每日光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为45μmol m-2s-1，培养温度为25℃；
(6)生根培养：将步骤(5)所述的不定芽在生根壮苗培养基中诱导生根，培养38d，生根率达95％，光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为35μmol m-2s-1，培养温度为25℃。
下表为不同干燥冷冻处理对蓝莓茎尖成活率及脱毒效果对比表
由上表分析可以看出,干燥、低温预培养、超低温培养以及化冻处理时间对蓝莓脱毒培养成活率和脱毒率具显著影响。方差分析表明：在影响蓝莓干燥冷冻后成活的因素中,影响大小顺序为:茎尖干燥脱水率>超低温培养时间>化冻处理时间>超低温预处理时间；在影响蓝莓脱毒效果的因素中,影响大小顺序为:超低温处理时间>茎尖干燥脱水率>化冻处理时间>超低温预处理时间。从上表得出最佳组合方案为:茎尖干燥脱水率20％、0℃超低温预培养时间30min、-196℃超低温培养时间90min、40℃化冻处理0.5min，该处理下茎尖成活率和脱毒率分别为78.3％和95.7％。
利用设计的特异性引物对，以蓝莓脱毒样品提取的RNA为模板进行RT-PCR反应，由附图可知，从BlaShV病毒阳性对照样品中扩增到预期大小的目的片段，长度450bp，5个脱毒样品中未扩增获得特异性片段。
附图中M表示DNA Ladder 1500Marker；1表示阳性对照；2表示阴性对照；3～6为脱毒样品。
Claims (2)
1.一种蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基，其特征是包括不同诱导时期的五种培养基，各种培养基的原料及其附加量分别是：
（1） 超低温预培养基：WPM培养基+ 20ml·L-1甘油+136.8 g·L-1蔗糖，pH5.2；
（2） 超低温培养基：WPM培养基+300ml·L-1甘油+150 ml·L-1乙二醇+150ml·L-1二甲基亚枫即DMSO+136.8 g·L-1蔗糖，pH5.2；
（3）恢复培养基：WPM培养基+ 0.1mg·L-1 玉米素即ZT + 0.1 mg·L-1 1-萘乙酸即NAA+0.1 mg·L-1赤霉素即GA3+8.0 g·L-1琼脂粉+30 g·L-1蔗糖，pH5.2；
（4）芽增殖诱导培养基：WPM培养基+ 0.5mg·L-1 ZT + 0.1 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1GA3+8.0 g·L-1琼脂粉+30 g·L-1蔗糖，pH5.2；
（5）生根壮苗培养基：WPM培养基+ 0.1 mg·L-1NAA+8.0 g·L-1琼脂粉+30 g·L-1蔗糖，pH5.2。
2.一种用权利要求1所述的蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基进行组培脱毒育苗的方法，其特征是经过下列步骤：
（1）蓝莓茎尖干燥培养：选取组培继代培养40±2d的蓝莓无菌苗形态学上端长为0.5～1.0 cm的顶芽，置于无菌培养皿中，加盖，但不密封，将该培养皿置于真空干燥器中，于室温下干燥脱除鲜重重量10%~30%的水分；
（2）茎尖分离剥取及超低温培养：在体视显微镜下剥取经干燥脱水处理的顶芽茎尖，茎尖长为1.0~1.5mm，置于1.8ml冷冻管中，每管置10个茎尖，加入超低温预培养基2~5ml，在0℃条件下处理10~70min ，用无菌枪头吸出超低温预培养基，加入2ml超低温培养基，并将冷冻管置于0℃冰水混合物中处理60 min，将冷冻管放入自制纱布袋中，迅速投入液氮中，保存60~120 min后，从液氮中迅速取出冷冻管，立即进行40℃水浴化冻处理0.2~1.5 min，再送入0℃冰水混合物中处理10min；将茎尖用WPM培养基+ 410.4 g·L-1蔗糖溶液清洗3次，每次10 min，取出茎尖置于无菌滤纸上以吸去残留在茎尖表面的液体，待接种到恢复培养基；
（3）恢复培养：为了减少培养过程中温度和光照的抑制，将超低温培养的茎尖接种至恢复培养基中先在0℃条件下暗培养5~7ｄ，再转移至光暗周期为光16h/暗8h的条件下培养30d，培养温度为25±2℃；
（4）病毒检测：将以上通过干燥冷冻培养获得的试管离体材料通过RT-PCR反转录病毒检测，经检测确认不带病毒，即为蓝莓脱毒种苗；
（5）芽诱导增殖培养：病毒检测后确定脱毒的成活茎尖转接至芽增殖诱导培养基中培养增殖出不定芽；微电脑时控开关控制培养室每日光照时间，每日光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40~50µmol m-2s-1，培养温度为25±2℃；
（6）生根培养：将步骤（5）所述的不定芽在生根壮苗培养基中诱导生根，培养30~45d，生根率达95%，光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为30~40µmol m-2s-1，培养温度为25±2℃。
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