CN105385664B - 一种复活小麦矮缩病毒冰冻毒源的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复活小麦矮缩病毒冰冻毒源的方法，选用健康饱满的小麦种子播种到装满土的花盆中，表面覆盖一层细土后放置到盛有清水的塑料盒中吸足水分；将毒源从冰箱取出，插到吸足水分的花盆中；吸取一定量的无毒条沙叶蝉，放置到一端带有纱网的玻璃罩中；将玻璃罩罩到插好毒源的花盆上；条沙叶蝉因没有食物会取食冰冻毒源，待3‑4天后小麦芽萌动露出土表，叶蝉会自动取食新苗，从而将病毒传播到小麦上。本发明将新苗的萌发过程与叶蝉取食带毒的过程同时进行，且在同一个花盆中完成，待叶蝉带毒后不需要二次转移，直接取食新苗，使新苗带毒。本发明方法统筹安排了时间和空间，节约了时间，节省了空间，操作简单，易于掌握。
Description
技术领域
本发明属于农业生物学技术领域，具体地，涉及以较低的成本和简单的操作将小麦矮缩病毒复活的技术。
背景技术
小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)是双生病毒科(Geminiviridae)玉米线条病毒属(Mastrevirus)的成员，病毒粒体为孪生颗粒形态。该病毒拥有广泛的寄主，包括小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)，燕麦(Avena sativa)等禾本科作物以及一些杂草,引起植株的严重矮缩、黄化、条斑和分蘖增多等症状。按照寄主范围和基因组序列，目前可划分为3个不同株系，分别为小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV),燕麦矮缩病毒(Oat dwarf virus,ODV)和大麦矮缩病毒(Barley dwarf virus,BDV)。条沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)为该病毒的主要介体，以持久性非增殖方式传播。由小麦矮缩病毒引起的小麦矮缩病最早于1961年在前捷克斯洛伐克发现(Vacke，1961),近年来该病毒的危害逐年加剧。目前已经成为欧洲、非洲和亚洲等大、小麦生产上威胁性很大的病害之一。小麦在拔节之前受到WDV侵染会造成植株严重矮缩，株高通常仅为10-20cm，且植株不再增高，拔节之后，受侵染的小麦分蘖长短不一，根部产生许多的小分蘖，严重时病株在拔节前即死亡，轻病株虽能拔节，但多不抽穗，有的虽抽穗，但籽粒不实。在欧洲，小麦因该病害减产可高达40％-80％。2007年我国首次报道了小麦矮缩病的发生，经过对该病害的调查发现，小麦矮缩病害在我国的麦类产区分布极为普遍，在陕西、甘肃、河北、云南等12个省均有该病害的发生，而且该类病毒群体在我国还处在群体扩张时期。在陕西北部麦区已经引起严重的减产。如2007和2008年在陕西省韩城地区该病害发病面积超过10万亩，病株率20％以上重病田达1万亩，正成为威胁我国西北、华北和西南麦区重要的病毒病。
小麦矮缩病毒病的传播主要通过介体以持久循回方式传播，即病毒介体-条沙叶蝉取食后，病毒随着植物汁液由口针进入到肠道，病毒穿越细胞膜到达血腔后由唾液腺被传出。近年来本实验室采用免疫荧光标记法研究发现WDV在介体体内除由中肠进入血淋巴到达唾液腺这种途径外，滤室内的一部分病毒还能扩散到滤室肌肉层并释放到血淋巴，经血淋巴到达唾液腺；由于小麦矮缩病毒由叶蝉专化性传播，不能通过机械磨擦接种传毒，且病毒仅局限在韧皮部，使得抗病性及致病性等研究工作存在很大的困难。病毒的活体保存通常是将病株和介体常年饲养在特定的环境中，待毒源的长势不好时，采用介体条沙叶蝉在活体植株上饲喂继续传毒至新苗上，周而复始。这种方法存在周期长，费时费工，同时饲养条件不易掌握等缺点。
中国专利“水稻黑条矮缩病毒冰冻毒源的活化方法”(ZL200910241900.4)，把带有水稻黑条矮缩病毒的叶片冰冻保持活性再喂食介体昆虫使其带毒，再由介体昆虫将水稻黑条矮缩病毒传播给健康植株，使植物病毒冰冻毒源活化。该方法中的介体昆虫被转移两次，第一次被喂食冰冻毒源，带毒后又转移到健康植物中使其将病毒传播给植物；而且健康植株的种植和冰冻毒源的喂饲采用了两个地点、空间，操作起来很不方便。
发明内容
针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种复活小麦矮缩病毒冰冻毒源的方法，该方法操作简单，易于掌握。
一种复活小麦矮缩病毒冰冻毒源的方法，包括如下步骤：
(1)取装有土壤的种植容器，播种健康的寄主植物种子，让土壤吸足水分；
(2)将带有矮缩病毒的叶片毒源从冰箱取出，插入吸足水分的土壤内，并罩上顶端带纱网的玻璃罩；
(3)将条沙叶蝉置于玻璃罩内，所述毒源、条沙叶蝉和寄主植物种子均全部位于玻璃罩内，条沙叶蝉取食冰冻毒源；
(4)待3-4天后寄主植物种子芽萌动露出土表，条沙叶蝉会自动取食新苗，矮缩病毒传播到寄主植物上。
所述玻璃罩罩住整个种植容器土壤表面。
所述种植容器为底部带孔的花盆。
所述让土壤吸足水分的方法为将种植容器置于另一盛水容器内。
所述步骤(3)中的条沙叶蝉被饥饿处理过。
所述寄主植物为小麦(Triticum aestivum L.)。
优选高感品种扬麦12号。
所述小麦发芽为在22℃光照培养箱内进行，16h光照、8h黑暗，光照强度为20000Lx。
所述的毒源为采自陕西韩城或山西太原病害发生地，经PCR和血清学鉴定为阳性后，挑选症状明显的小麦病叶剪成7-8cm的小段，-20℃低温冰箱长期保存。
所述条沙叶蝉种群采自陕西韩城，常年在冬小麦幼苗上饲养。
本发明提供的方法是基于传统生物学技术建立的，具体的实施方法是选用健康饱满的小麦种子10-15粒左右分散播种到装满土的花盆中，表面覆盖一层细土后放置到盛有清水的塑料盒中吸足水分；将毒源从冰箱取出，均匀地插到吸足水分的花盆中；然后用吸虫器吸取一定量的无毒条沙叶蝉，放置到一端带有纱网的玻璃罩中；将玻璃罩罩到插好毒源的花盆上；条沙叶蝉因没有食物会取食冰冻毒源，冰冻毒源因插到吸足水分的土壤里而不会干掉，待3-4天后小麦芽萌动露出土表，叶蝉会自动取食新苗，从而将病毒传播到小麦上。本发明将新苗的萌发过程与叶蝉取食带毒的过程同时进行，且在同一个种植容器中完成，待叶蝉带毒后不需要二次转移，直接取食新苗，使新苗带毒。
本发明提供的WDV冰冻毒源复活的方法，可按需将冰冻后的病毒分离物通过饲喂条沙叶蝉而重新成功地活化出来，从而为利用WDV病毒研究植物病毒致病性或介体传播病毒以及寄主抗病性等提供简便有效的方法。变常年多次接种为需求性接种，节省了介体饲养的成本；还节省了病毒活体保存所需要的光照培养箱的成本，同时还避免了在长期的活体保存中病毒的变异及与其它病毒的混杂；另外没有季节依赖性，能够满足各个季节的需求，周年随时可以操作。本发明方法统筹安排了时间和空间，节约了时间，节省了空间，操作简单，易于掌握。
附图说明
图1.条沙叶蝉在冰冻毒源叶片上取食；
图2.条沙叶蝉从冰冻毒源转移至小麦幼苗上取食；
图3.具有典型症状的小麦矮缩病毒发病株；
图4.条沙叶蝉的带毒率检测的PCR电泳图；
其中：M代表DL2000 DNA Marker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp；1-23泳道依次为条沙叶蝉的1-23号样品。
图5.接种小麦植株的PCR检测的电泳图；
其中：M代表DL2000 DNA Marker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp；1-10泳道依次为接种植株的1-10号样品。
图6.获毒植株的介体传毒检测:左为未接种小麦健康对照，右为冰冻毒源获毒植株经叶蝉再传毒发病植株。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
需特别指出的是，尽管本发明是针对小麦矮缩病毒冰冻毒源的复活技术，但应用本发明对任何引起小麦矮缩病的相近株系如大麦矮缩病毒、燕麦矮缩病毒的冰冻毒源复活方法均也包括在本发明所要求的权利范围之内。
实施例1.植物样品与介体材料准备
所述的小麦矮缩病毒(WDV)毒源是采自陕西韩城，山西太原等地，经PCR和血清学鉴定为阳性后，挑选症状明显的病叶剪成7-8cm的小段，-20℃低温冰箱长期保存。传毒介体-条沙叶蝉[Psammotettix striatus(Linnaeus)]采自陕西韩城，经脱毒纯化后在健康小麦上常年扣罩饲养繁殖。经PCR检测,该种群对本实验室保存的活体WDV毒源的传毒效率为70-80％。所述的介体饲养和作为饲料及传毒寄主的小麦均饲养在22℃光照培养箱内，16h光照、8h黑暗，光照强度为20000Lx。每六周将叶蝉转移到新种的幼苗上，以此方法来保存叶蝉。
实施例2.冰冻毒源的活化
挑选健康饱满的小麦(如扬麦12号)种子10-15粒左右分散播种到装满土的花盆中，表面覆盖一层细土后将花盆放置到盛有清水的塑料盒中吸足水分；将冰冻毒源叶片从冰箱取出，取4至5个叶片分散地插到上一步吸足水分的花盆里；然后用吸虫器吸取一定量的无毒条沙叶蝉，放置到一端带有纱网的玻璃罩中，将玻璃罩罩到插好毒源的花盆上；条沙叶蝉因没有新鲜小麦做为食物会取食冰冻毒源(图1)，冰冻毒源因插到吸足水分的土壤里而不会干掉，待3-4天后小麦芽萌动露出土表，叶蝉会自动取食新苗，从而可能将病毒传播到小麦上(图2)；将花盆放置到22℃光照培养箱内(16h光照、8h黑暗，光照强度为20000Lx)，定期浇水；8天后将叶蝉用吸虫器取出，植株继续培养。两周后观察发病情况，通常情况下3-4周小麦会出现明显病症(图3)。
实施例3.PCR检测条沙叶蝉带毒率
1.条沙叶蝉DNA的提取
将饲毒过的叶蝉用吸虫器取出，单头提取叶蝉的总DNA。采用Promega公司的Wizard Genomic DNA提取试剂盒，提取方法参考说明书略作改动。取冷冻保存的单头叶蝉经乙醇消毒清洗后置于1.5mL离心管，加入液氮后用玻璃研棒充分研磨并加入50μL NucleiLysis Solution匀浆，直至组织完全破裂，再用100μL Nuclei Lysis Solution冲洗研棒，混匀后65℃温浴20min。室温冷却，加入1μL RNase，37℃温浴20min，加入80μL Proteinprecipitation Solution，震荡混匀后冰浴5min，13000-16000r/min常温离心6min。取上清于1.5mL离心管中，加入300mL常温异丙醇，轻柔颠倒混匀，13000-16000r/min常温离心3min，弃上清，加入75％乙醇，13000-16000r/min常温离2min，再加75％乙醇重复1次，超净台干燥后加入25μL ddH2O，65℃温浴溶解1h，-20℃保存备用。
2.PCR检测带毒情况
2.1引物设计
将GenBank上登录的WDV陕西韩城分离物与其它地区分离物进行序列比对，结果表明外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因较为保守，故选取该基因作为靶基因。应用Vector NT10.0软件设计CP基因特异性引物，具体序列为CP/F:5‘-ATGGTGACCAACAAGGACTCC-3’；CP/R:5‘-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.2 PCR扩增与电泳结果
以总体系50μL为例，PCR扩增体系如下：rTaq 0.25μL；10×PCR Buffer 5μL；dNTPMixture(各2.5mmol/L)4μL；上游引物和下游引物(10μmol/L)各2μL；DNA(10ng/μL)2μL，ddH2O 34.75μL。PCR扩增程序：94℃5min；(94℃1min，退火温度50sec，72℃30sec)，35个循环；72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明：在检测的50头叶蝉中有26头扩增出阳性条带(部分电泳图片见图4)，带毒率为52％。PCR结果说明了叶蝉可以因取食冰冻毒源而获毒。
实施例4.PCR检测接种植株发病率
1.小麦总DNA提取方法
采用buffer“S”法提取小麦总DNA。取新鲜叶片0.2g左右放入研钵，用液氮研成粉末后装入1.5mL离心管中；加入700μL的Buffer“S”(成分：100mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)；100mmol/L NaCl；50mmol/L EDTA(pH 8.0)；2％SDS(W/V)(65℃提前预热)，混匀后于65℃水浴1h，并不时震荡混匀。加入2μL RNaseA(10mg/mL)于37℃消化2h以去除RNA。冷却后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，上下颠倒混匀，4℃，8000rpm离心10min；取上清600μL转移至新管中，加入等体积的氯仿，轻柔混匀后4℃，8000rpm离心10min。将上清转移至新管中，加2/3体积预冷的异丙醇，轻轻混匀后于-20℃放置30min以上。4℃，8000rpm离心25min。弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次。洗涤完成后真空干燥仪约5min，溶于100μLddH2O中。-20℃冰箱暂时保存备用。
2.接种植株的PCR鉴定
2.1引物设计
引物设计同实施例3。
2.2 PCR扩增与电泳结果
将冰冻毒源活化接种小麦4周后，观察发现部分小麦出现明显的小麦矮缩病毒症状，典型症状表现为：叶片僵直，叶尖发黄、并逐步向下蔓延，植株明显表现矮化，出现分蘖。分别将获得的小麦植株提取DNA做以PCR检测，PCR扩增条件同实施例3。电泳结果显示以冰冻毒源饲喂接种所获得的48颗植株中25株为阳性，阳性率为52.1％(部分电泳结果见图5)，结果表明一半以上的接种植株成功获得毒性。
实施例5.获毒植株的介体传毒检测
将实施例4得到的1株获毒植株用条沙叶蝉扣罩活体饲毒3d后，用吸虫器吸取带毒的条沙叶蝉放置到龄期为一叶一心的扬麦12健康小麦苗上，每株3头扣罩接种，共接种12株。4d后去虫，植株放置于22℃，光照16h、黑暗8h，光照强度为20 000LX的培养箱中培养，10d后观察并记录症状。生物学实验结果表明，接种植株中有8株小麦在第15d开始显现病症，植株发育明显迟缓，叶片增厚而且可见黄绿色。21d后显现矮化、黄化、新叶生长受限等明显发病症状，与正常经叶蝉传毒的WDV分离物的表型基本一致(图6)。传毒实验表明：冰冻毒源接种而获毒的小麦植株上的后代病毒能够通过条沙叶蝉正常传播侵染小麦，并与正常经叶蝉传毒的WDV分离物致病特性基本相同。
Claims (10)
1.一种复活小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)冰冻毒源的方法，包括如下步骤：
(1)取装有土壤的种植容器，播种健康的寄主植物种子，让土壤吸足水分；
(2)将带有矮缩病毒的叶片毒源从冰箱取出，插入吸足水分的土壤内，并罩上顶端带纱网的玻璃罩；
(3)将条沙叶蝉置于玻璃罩内，所述毒源、条沙叶蝉和寄主植物种子均全部位于玻璃罩内，条沙叶蝉取食冰冻毒源；
(4)待3-4天后寄主植物种子芽萌动露出土表，条沙叶蝉会自动取食新苗，矮缩病毒传播到寄主植物上。
2.根据权利要求1所述的方法，所述玻璃罩罩住整个种植容器土壤表面。
3.根据权利要求1所述的方法，所述种植容器为底部带孔的花盆。
4.根据权利要求3所述的方法，所述让土壤吸足水分的方法为将种植容器置于另一盛水容器内。
5.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(3)中的条沙叶蝉被饥饿处理过。
6.根据权利要求1所述的方法，所述寄主植物为小麦(Triticum aestivum L.)。
7.根据权利要求6所述的方法，所述寄主植物为高感品种扬麦12号。
8.根据权利要求1所述的方法，所述寄主植物种子芽萌动露出土表的过程为在22℃光照培养箱内进行，16h光照、8h黑暗，光照强度为20000Lx。
9.根据权利要求1所述的方法，所述的毒源经PCR和血清学鉴定为阳性后，挑选症状明显的小麦病叶剪成7-8cm的小段，-20℃低温冰箱长期保存。
10.根据权利要求1所述的方法，所述条沙叶蝉种群常年在冬小麦幼苗上饲养。
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