CN112284791B - 一种离析葡萄果实木质部导管的方法 - Google Patents

一种离析葡萄果实木质部导管的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种离析葡萄果实木质部导管的方法，属于植物显微观察技术领域。包括：葡萄果实木质部导管取样、葡萄果实木质部导管果肉细胞去除、葡萄果实木质部导管组织透明、葡萄果实木质部导管离析、葡萄果实木质部导管染色、葡萄果实木质部导管打碎与分离。本发明利用酶解、透明、染色与离析相结合，改良离析后木质部导管的捣碎处理方法，能够完整观察到葡萄果实木质部导管的结构，解决传统离析方法无法分离到完整的葡萄果实木质部导管片段的难题，为研究葡萄果实解剖结构和果实品质生理提供科学的实验方法。

Description

一种离析葡萄果实木质部导管的方法
技术领域
本发明涉及一种离析葡萄果实木质部导管的方法，属于植物显微观察技术领域。
背景技术
葡萄果实木质部导管是为果实运输水分和营养物质的通道，观察葡萄果实木质部导管结构是研究葡萄果实品质常用的实验方法，常用的方法为石蜡切片法，该方法能够观察到木质部导管的横切或纵切结构，但是针对葡萄果实木质部导管完整的细胞结构观察，还未有具体的实验方法。欲观察果实导管的完整细胞结构需要采用离析法，而在其他组织器官如茎、根、叶木质部导管结构观察采用的离析法针对性强，且对于具体的组织器官有不同的离析液。葡萄果实属浆果，柔软多汁，木质部导管贯穿于葡萄果肉中，且与果肉紧密连在一起，木质部导管取样时难免会将附着在木质部导管上的果肉一起取出，离析后的果肉与木质部导管混合在一起，影响了木质部导管结构的观察，而且葡萄果实木质部导管较其他组织中的木质部导管更柔软更细，且采用传统的方法进行离析后极易碎、易断，很难观察到完整的木质部导管片段。
发明内容
在葡萄果实木质部导管离析实验中利用植物根茎叶等器官的离析方法，往往会出现的以下问题：果肉细胞干扰；葡萄果实导管过细多缠在一起，离析液不能完全将单根导管分离；经离析后的葡萄果实木质部导管极易碎掉，传统的玻璃棒敲碎都影响观察效果。本发明针对现有技术中出现的以上问题，通过选取适当试剂优化实验方法，将酶解、透明、染色与离析相结合，开发出一种适合葡萄果实木质部导管的离析方法，且该发明取得了良好的实验效果。
观察植物组织结构的实验方法多样，对于植物组织的整体观察多需要将植物组织进行离析，获得完整的组织或细胞结构，再进行制样观察。现有的离析实验方法多适用于植物根、茎、叶等器官，对于葡萄果实这种柔软细小木质部导管没有合适的实验方法，且利用现有的离析方法，葡萄果实木质部导管往往出现离析不彻底、果肉细胞干扰、木质部导管碎断等现象，因此单纯的利用离析法无法取得良好的实验效果，必须将实验中出现的问题进行逐项排除，才能解决柔软细小木质部导管的离析难的问题。
本发明的技术方案包含葡萄果实木质部导管取样、酶解、透明、离析、染色、制片与观察等关键技术和方法，主要参数包含了：（1）酶解方法，酶液的浓度、温度与时间；（2）离析时间；（3）组织透明液的浓度与时间；（4）木质部导管离析后的处理方法，采用撕取法，不能捣碎。具体如下：
一种离析葡萄果实木质部导管的方法，其特征是，包括：
1）葡萄果实木质部导管取样，具体做法为：取葡萄果粒，用双面剃须刀片在果刷处横切，看到白色的木质部导管；选取其中一条木质部导管，用刀片小心去除木质部导管周围的果肉，取出木质部导管后，立即放入清水中浸泡。如在果实发育前期木质部导管不易辨别时可在实验前引入染料，提高取样效率。
2）葡萄果实木质部导管果肉细胞去除，具体做法为：将木质部导管用清水清洗2-3次后，放入配好的酶液中进行水浴酶解8-10小时，水浴温度为50摄氏度。所述酶液的配制方法为：分别取3.00g果胶酶和3.00g纤维素酶混合加入到100ml去离子水中，并搅拌加速溶解。
3）葡萄果实木质部导管组织透明，具体做法为：酶解完成的葡萄果实木质部导管清水冲洗2-3次，转入质量浓度为5%的NaOH溶液，进行透明，透明时间为3-5天，期间更换透明液1-2次。
4）葡萄果实木质部导管离析，具体做法为：透明好的木质部导管，放入配好的离析液中，离析7天。
5）葡萄果实木质部导管染色，具体做法为：将离析后的葡萄果实木质部导管染色，染色溶液为1%的苯胺蓝溶液，染色时间为5-10min。
6）葡萄果实木质部导管分离，具体做法为：将染色后的木质部导管放在透明玻璃培养皿中或载玻片上，加1滴清水，先在解剖镜下观察，用尖头镊子夹住整根导管束一端，同时用解剖针顺着导管束方向进行划动抽丝，注意保持木质部导管的完整性。
7）葡萄果实木质部导管分离后，用胶头滴管吸取分离好的葡萄果实木质部导管，在载玻片上进行酒精梯度脱水，脱水完成后，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。
本发明利用酶解、透明、染色与离析相结合，改良离析后木质部导管的捣碎处理方法，能够完整观察到葡萄果实木质部导管的结构，解决传统离析方法无法分离到完整的葡萄果实木质部导管片段的难题，为研究葡萄果实解剖结构和果实品质生理提供科学的实验方法。
附图说明
图1为具体实施方式中葡萄果实木质部导管样品图；
图2 为具体实施方式中酶解后葡萄果实木质部导管图；
图3 为具体实施方式中未酶解(A)和酶解(B)后葡萄果实木质部导管图；
图4为具体实施方式中经透明离析后葡萄果实木质部导管图；
图5为具体实施方式中染色后葡萄果实木质部导管图；
图6为具体实施方式中经撕取制片后葡萄果实木质部导管图；
图7为具体实施方式中显微镜下观察到葡萄果实木质部导管图。
具体实施方式
一种离析葡萄果实木质部导管的方法，包括：葡萄果实木质部导管取样、葡萄果实木质部导管果肉细胞去除、葡萄果实木质部导管组织透明、葡萄果实木质部导管离析、葡萄果实木质部导管染色、葡萄果实木质部导管打碎与分离。具体步骤如下：
（1）葡萄果实木质部导管取样：取葡萄果粒，用双面剃须刀片在果刷处横切，可看到白色的木质部导管。如在果实发育前期木质部导管不易辨别时可在实验前引入染料，具体方法为：将带果柄的果粒取下后，把果柄浸入质量浓度为3%的酸性品红溶液，3小时左右去除，可见染料进入到果实木质部导管中。选取其中一条木质部导管，用刀片小心去除木质部导管周围的果肉，取出木质部导管后，立即放入清水中浸泡（图1）。
（2）木质部导管果肉去除：将木质部导管用清水清洗2-3次后，放入配好的酶液中进行水浴酶解8-10小时，水浴温度为50摄氏度，酶解后葡萄果实木质部导管照片如图2。本实施例对比未酶解和酶解后效果，发现酶解后附着在葡萄果实木质部导管上的果肉被分解（图3）。酶液的配制方法为：分别取3.00g果胶酶和3.00g纤维素酶混合加入到100ml去离子水中，并搅拌加速溶解。
（3）葡萄果实木质部导管组织透明：酶解完成的葡萄果实木质部导管清水冲洗2-3次，转入质量浓度为5%的NaOH溶液，进行透明，透明时间为3-5天，期间更换透明液1-2次。
（4）葡萄果实木质部导管离析：透明好的木质部导管，放入配好的离析液中，离析7天左右，经透明离析后葡萄果实木质部导管照片如图4。离析液为乙酸-双氧水(体积比1：1)混合液。
（5）葡萄果实木质部导管染色：将离析后的葡萄果实木质部导管染色，染色溶液为质量浓度为1%的苯胺蓝溶液，染色时间为5-10min（图5）。
（6）葡萄果实木质部导管分离：由于葡萄果实木质部导管较细，采用传统的玻璃棒捣碎方法，无法看到完整的木质部导管片段，因此分离时采用解剖针进行撕取法。具体方法为：将染色后的木质部导管放在透明玻璃培养皿中或载玻片上，加1滴清水，先在解剖镜下观察，用解剖针小心撕去成细丝，注意保持木质部导管的完整性。
（7）制片：用胶头滴管吸取分离好的葡萄果实木质部导管，在载玻片上进行酒精梯度脱水，脱水完成后，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片(图6）。
观察：采用光学显微镜观察，在显微镜下可以观察到离析完整的葡萄果实木质部导管（图7）。

Claims (4)

1.一种离析葡萄果实木质部导管的方法，其特征是，包括葡萄果实木质部导管取样、葡萄果实木质部导管果肉细胞去除、葡萄果实木质部导管组织透明、葡萄果实木质部导管离析、葡萄果实木质部导管染色、葡萄果实木质部导管分离；
所述葡萄果实木质部导管取样，具体做法为：取葡萄果粒，用刀片在果刷处横切，看到白色的木质部导管；选取其中一条木质部导管，用刀片小心去除木质部导管周围的果肉，取出木质部导管后，立即放入清水中浸泡；
所述葡萄果实木质部导管果肉细胞去除，具体做法为：将木质部导管用清水清洗2-3次后，放入配好的酶液中进行水浴酶解8-10小时，水浴温度为50摄氏度；
所述酶液的配制方法为：分别取3.00g果胶酶和3.00g纤维素酶混合加入到100ml去离子水中，并搅拌加速溶解；
所述葡萄果实木质部导管组织透明，具体做法为：酶解完成的葡萄果实木质部导管清水冲洗2-3次，转入浓度为5%的NaOH溶液，进行透明，透明时间为3-5天，期间更换透明液1-2次；
所述葡萄果实木质部导管离析，具体做法为：透明好的木质部导管，放入配好的离析液中，离析7天；离析液为乙酸-双氧水混合液，乙酸-双氧水体积比为1：1；
所述葡萄果实木质部导管染色，具体做法为：将离析后的葡萄果实木质部导管染色，染色溶液为1%的苯胺蓝溶液，染色时间为5-10min。
2.根据权利要求1所述的一种离析葡萄果实木质部导管的方法，其特征是，如在果实发育前期木质部导管过细不易辨别时可在实验前引入染料，提高取样效率。
3.根据权利要求1所述的一种离析葡萄果实木质部导管的方法，其特征是，所述葡萄果实木质部导管分离，具体做法为：将染色后的木质部导管放在透明玻璃培养皿中或载玻片上，加1滴清水，先在解剖镜下观察，用尖头镊子夹住整根导管束一端，同时用解剖针顺着导管束方向进行划动抽丝，注意保持木质部导管的完整性。
4.根据权利要求3所述的一种离析葡萄果实木质部导管的方法，其特征是，葡萄果实木质部导管分离后，用胶头滴管吸取分离好的葡萄果实木质部导管，在载玻片上进行酒精梯度脱水，脱水完成后，用二甲苯透明，中性树胶封片。
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