CN116004524B - 一种快速脱去卵母细胞透明带的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速脱去卵母细胞透明带的方法，所述方法包括以下步骤：制作普通移卵针和尖口移卵针；在进口皿中制作2排DPBS+0.3％PVP液滴和链酶蛋白酶液滴；用普通移卵针吸取一枚哺乳动物卵母细胞或胚胎置于第一排DPBS+0.3％PVP液滴中，按照液滴顺序洗涤，直到洗去细胞表面的残留液体，然后置于链酶蛋白酶液滴中进行消化，至透明带出现形变和扩张，移入第二排其中一个DPBS+0.3％PVP液滴中，用尖口移卵针摁住透明带扩张的地方，并进行缓慢反复的吸吹，直到透明带脱落，再转移到第二排剩下的两个DPBS+0.3％PVP液滴中洗净即可。本发明使用特制的尖口移卵针在蛋白酶消化的辅助下去掉透明带的方法，高效快速，且对卵母细胞质量影响更小。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种快速脱去卵母细胞透明带的方法。
背景技术
哺乳动物卵母细胞的发育在卵泡中进行，当第一层卵泡细胞完全包被住卵母细胞后，在卵母细胞的外面形成一层非细胞的膜，即透明带，其作用主要是保护卵子，防止异种精子进入。而在手工克隆、哺乳动物卵裂球分离以及对卵母细胞进行特殊抗体免疫荧光染色等情况下，需要去除卵母细胞透明带。传统观点一直认为透明带是核移植重编程和胚胎发育所必须的，所以传统克隆技术的应用与发展一直以透明带完整为基础，传统克隆也一直使用昂贵的显微操作仪，耗时久且克隆胚胎发育效率低，大大阻碍了核移植研究。直到后来研究发现透明带的去除并不会影响胚胎发育，Tatham、Peura和Vajta等多位科学家尝试无透明带核移植并成功得到克隆动物，这种无透明带核移植技术便是手工克隆技术，其优势在于经济高效、耗时短、操作简单且克隆效率有所提升。透明带的高效快速去除是手工克隆技术成功的重要基础，目前应用于去除透明带的主要方法有蛋白酶消化法、尖锐吸管吸出法以及酸化法，但是经实践验证这些方法仍存在一定的不足，如蛋白酶消化法，在时间的控制上非常重要，消化时间不足透明带难以去除，过分消化影响卵母细胞质量。在使用特殊抗体进行免疫荧光染色时，如果卵母细胞透明带未去除，抗体则无法进入细胞中与抗原表位结合，如果消化过度会导致卵母细胞胞质松散或胚胎卵裂球散开，染色效果大打折扣。同时卵母细胞质量会直接影响克隆胚胎发育效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速脱去卵母细胞透明带的方法，其使用特制的尖口移卵针在蛋白酶消化的辅助下去掉透明带的方法，高效快速，且对卵母细胞质量影响更小。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种快速脱去卵母细胞透明带的方法。根据本发明的实施例，包括以下步骤：
(1)制作普通移卵针；
(2)尖口移卵针的制作：利用磨针仪对普通移卵针进行磨针，得到尖口移卵针，磨好的尖口移卵针斜切口的角度为45°；
(3)制备DPBS+0.3％PVP和链酶蛋白酶，在进口皿中制作2排DPBS+0.3％PVP液滴，每排3滴，每滴50μL-100μL，在离心管中加入1mg/ml的链酶蛋白酶，再加DPBS+0.3％PVP溶液，吹打混匀并瞬时离心，取离心管中上层稀释过的链酶蛋白酶溶液，在进口皿中制作一个链酶蛋白酶液滴；
(4)卵母细胞透明带的去除：用普通移卵针吸取一枚哺乳动物卵母细胞或胚胎置于第一排DPBS+0.3％PVP液滴中，按照液滴顺序洗涤，直到洗去细胞表面的残留液体，然后置于链酶蛋白酶液滴中进行消化，至透明带出现形变和扩张，移入第二排其中一个DPBS+0.3％PVP液滴中，用尖口移卵针摁住透明带扩张的地方，并进行缓慢反复的吸吹，直到透明带脱落，再转移到第二排剩下的两个DPBS+0.3％PVP液滴中洗净即可。
另外，根据本发明上述实施例的一种快速脱去卵母细胞透明带的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中，普通移卵针的制备方法包括以下步骤，取一根BJ-40细玻管，手持细胞管两端，将细玻管中间部分置于酒精灯外焰中受热至细玻管发红，双手同时向两边用力拉，拉好的针中间细段部分的长度为18-24cm，用砂轮从中间截开，得到两根直径145-155μm、细段长度为9-12cm、粗细均匀的普通移卵针，截口尽量平整，将截口端置于酒精灯的蓝色火焰外部轻微灼烧至针口圆润即可。
在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中，磨针的具体操作包括以下步骤，将普通移卵针固定在磨针仪持针器上，转动粗调旋钮使普通移卵针缓慢下降，通过目镜注视，当普通移卵针接近磨盘时换用微调旋钮继续将普通移卵针下调，当普通移卵针出现倒吸现象时继续将微调旋钮旋转90°，磨盘转速为1200rpm，磨针过程中要一直通过目镜注视，当普通移卵针里液段处于相对稳定的状态时，即得到尖口移卵针。
在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中，DPBS+0.3％PVP的制备方法如下，按照体积比为1000:3的量加入DPBS和PVP，混匀充分溶解即得DPBS+0.3％PVP，其中，0.3％为体积百分数。
在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中，离心管中DPBS+0.3％PVP与链酶蛋白酶的体积比为2:1。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
卵母细胞在蛋白酶中浸泡时间过久会损害卵母细胞质量，使得胞质变得松散，卵裂球分离，不利于后续试验。用尖口移卵针在蛋白酶辅助下去掉透明带，可以减少卵母细胞在酶中浸泡时间，最大程度上减轻酶过度消化对卵母细胞质量造成的影响。此外，用移卵针去透明带比完全使用酶消化去透明带更容易，尖口的设计更容易摁住并扎穿透明带，再通过反复吸吹即可有效去除透明带。所以本发明的方法既能快速高效的去掉透明带，还将卵母细胞损害降到最低。
其次，发明所用试剂耗材易得，步骤简单易操作，该方法经济实用可广泛推广。
附图说明
图1为本发明实施例中普通移卵针制作图；
图2为本发明实施例中特制尖口移卵针的磨针仪；
图3为本发明实施例中制作好的尖口移卵针；
图4为本发明实施例中卵母细胞去透明带的流程图；
图5为本发明实施例中卵母细胞去透明带的操作流程图；
图中，1、粗调旋钮，2、目镜，3、磨盘，4、持针器，5、微调旋钮。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.材料
BJ-40细玻管(2.5×2.0×100)；200μL离心管(BBI life sciences)；50ml离心管(Cornig,430290)；直径35mm进口培养皿(Corning，USA)；离心机(eppendorf)；体视显微镜(Nikon，SMZ1000)；磨针仪(Narishige,EG-400)。
2.试剂
杜氏磷酸盐缓冲液DPBS(Gibco，14190-144)；聚乙烯吡咯烷酮PVP(Sigma,P0930)；链霉蛋白酶(AMRESCO，E629-1G)。
一种快速脱去卵母细胞透明带的方法，包括如下步骤：
(1)普通移卵针的制作
取一根BJ-40细玻管，手持细胞管两端，将细玻管中间部分置于酒精灯外焰中受热至玻璃发红，双手同时向两边用力拉，拉好的针中间有约18-24cm长度的细段部分，用砂轮从中间截开，得到两根直径145-155μm、细段长度为9-12cm、粗细均匀的普通移卵针，截口尽量平整，将截口端置于酒精灯的蓝色火焰外部轻微灼烧至针口圆润即可，如图1所示。
(2)尖口移卵针的制作
如图2所示，将制作好的普通移卵针固定在磨针仪持针器4上，转动粗调旋钮1使普通移卵针缓慢下降，通过目镜2注视，当普通移卵针接近磨盘3时换用微调旋钮5继续将普通移卵针下调，当移卵针出现倒吸现象时继续将微调旋钮5旋转90°，磨盘3转速约1200rpm，磨针过程中要一直通过目镜2注视，当普通移卵针里液段处于相对稳定的状态时，说明针已经磨好，即得到了尖口移卵针，如图3所示，磨好的尖口移卵针斜切口约45°。
(3)DPBS+0.3％PVP和链酶蛋白酶的准备
DPBS+0.3％PVP：50ml离心管中倒入50mlDPBS，再加入0.15g的PVP粉末，颠倒混匀充分溶解即可。在进口皿中做2排DPBS+0.3％PVP液滴，每排3滴，每滴50μL-100μL。
链酶蛋白酶：在200μL离心管中加入30μL 1mg/ml的链酶蛋白酶，再加60μL的DPBS+0.3％PVP溶液，吹打混匀并瞬时离心。取离心管中上面60μL稀释过的链酶蛋白酶溶液，在进口皿中做一个液滴。
(4)卵母细胞透明带的去除
如图4所示，用普通移卵针吸取一枚哺乳动物卵母细胞或胚胎置于第一排DPBS+0.3％PVP液滴中，按照液滴顺序洗涤，直到洗去细胞表面的残留液体，置于链酶蛋白酶液滴中进行消化，至透明带出现形变和扩张，移入第二排DPBS+0.3％PVP液滴中，用尖口移卵针摁住透明带扩张的地方，并进行缓慢反复的吸吹，直到透明带脱落，再转移到剩下的两个DPBS+0.3％PVP液滴中洗净即可。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种快速脱去卵母细胞透明带的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制作普通移卵针；
(2)尖口移卵针的制作：利用磨针仪对普通移卵针进行磨针，得到尖口移卵针，磨好的尖口移卵针斜切口的角度为45°；
(3)制备DPBS+0.3％PVP和链酶蛋白酶，在进口皿中制作2排DPBS+0.3％PVP液滴，每排3滴，每滴50μL-100μL，在离心管中加入1mg/ml的链酶蛋白酶，再加DPBS+0.3％PVP溶液，吹打混匀并瞬时离心，取离心管中上层稀释过的链酶蛋白酶溶液，在进口皿中制作一个链酶蛋白酶液滴；
(4)卵母细胞透明带的去除：用普通移卵针吸取一枚哺乳动物卵母细胞或胚胎置于第一排DPBS+0.3％PVP液滴中，按照液滴顺序洗涤，直到洗去细胞表面的残留液体，然后置于链酶蛋白酶液滴中进行消化，至透明带出现形变和扩张，移入第二排其中一个DPBS+0.3％PVP液滴中，用尖口移卵针摁住透明带扩张的地方，并进行缓慢反复的吸吹，直到透明带脱落，再转移到第二排剩下的两个DPBS+0.3％PVP液滴中洗净即可。
2.根据权利要求1所述的一种快速脱去卵母细胞透明带的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，普通移卵针的制备方法包括以下步骤，取一根BJ-40细玻管，手持细胞管两端，将细玻管中间部分置于酒精灯外焰中受热至细玻管发红，双手同时向两边用力拉，拉好的针中间细段部分的长度为18-24cm，用砂轮从中间截开，得到两根直径145-155μm、细段长度为9-12cm、粗细均匀的普通移卵针，截口尽量平整，将截口端置于酒精灯的蓝色火焰外部轻微灼烧至针口圆润即可。
3.根据权利要求1所述的一种快速脱去卵母细胞透明带的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，磨针的具体操作包括以下步骤，将普通移卵针固定在磨针仪持针器上，转动粗调旋钮使普通移卵针缓慢下降，通过目镜注视，当普通移卵针接近磨盘时换用微调旋钮继续将普通移卵针下调，当普通移卵针出现倒吸现象时继续将微调旋钮旋转90°，磨盘转速为1200rpm，磨针过程中要一直通过目镜注视，当普通移卵针里液段处于相对稳定的状态时，即得到尖口移卵针。
4.根据权利要求1所述的一种快速脱去卵母细胞透明带的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，DPBS+0.3％PVP的制备方法如下，按照体积比为1000:3的量加入DPBS和PVP，混匀充分溶解即得DPBS+0.3％PVP，其中，0.3％为体积百分数。
5.根据权利要求1所述的一种快速脱去卵母细胞透明带的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，离心管中DPBS+0.3％PVP与链酶蛋白酶的体积比为2:1。
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| GR01 | Patent grant | ||
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