CN112063576B - 一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法 - Google Patents
一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法。该方法通过以下步骤实现：将种子培养至第一片真叶3‑5 mm长时，取出第一片真叶，使用玻璃针进行切割，将切割后的叶片进行酶解；酶解结束后，由水平方向向竖直方向甩；终止酶解反应，由水平方向向竖直方向甩，过滤后离心，将白色沉淀原生质体洗涤，离心；自然沉降后重悬即可。本发明首次利用完整叶片为材料提取原生质体，可以实现原生质体纯度大于95%，活率大于95%，用于研究表皮细胞分化具有重要意义，其次也可以用于亚细胞定位研究和原生质体转化等下游实验，如基因功能验证、亚细胞定位、细胞测序等。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法。
背景技术
二色补血草（Limonium bicolor (bag.) Kuntze）白花丹科，补血草属多年生草本植物，又名草原干枝梅、付氏矶松，野生分布在蒙古高原、内蒙古、新疆、西伯利亚地区，花色艳丽，形态自然，是一种特色干花资源植物，具有很好的观赏价值。
目前，关于提取植物原生质体的方法很多，通常对叶片切割后酶解的方法（Sun，Lang et al.2013，Shen，Fu et al.2014），比如拟南芥、烟草、玉米等，但提取出来的均为叶肉细胞，而对于植物表皮细胞原生质体的提取方法尚没有研究。本发明提供的方案能够在短时间内以完整的幼嫩叶片为材料提取出叶肉细胞和表皮细胞的原生质体，达到95%的纯度。叶肉细胞具有叶绿体为绿色，而表皮细胞没有叶绿体，而且二色补血草早期发育叶片的表皮细胞为红色或无色，通过颜色的就能够清楚的分辨出表皮细胞和叶肉细胞。叶片表皮有气孔、表皮毛、盐腺等特化细胞，是研究细胞分化机制模式材料。现有技术中，提取原生质体过程中，均采用手术刀等工具首先将叶片上层表皮细胞进行刮除，然后剪成细丝进行酶解等，且尚未有叶片表皮细胞原生质体提取方面的研究，尤其是对发育早期的小真叶，手术刀无法进行切割的操作，本发明提供了1 μm玻璃针切割的方法，可广泛适用于其他植物。
发明内容
针对现有技术中存在的问题及研究空白，本发明提供了一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法，该方法研究表皮细胞分化具有重要意义，其次也可以用于亚细胞定位研究和原生质体转化等下游实验。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法，包括以下步骤：
（1）将消毒后的植物种子均匀的撒播在MS培养基上，让其生长在正常条件下，培养无菌苗；
（2）播种后5-7天，待植物第一片真叶3-5 mm长时，准备取材；
（3）将植物放在解剖镜下用细头镊子取出第一片真叶，使用玻璃针对真叶进行切割，一片真叶切割2-3段，完全切割下来，每段1-2 mm长，将切割后的叶片立即放入装有20ml的酶解液的离心管中，将酶解液避光；
（4）富集叶片于酶解液中，放在摇床，避光，酶解；
（5）酶解结束后，由水平方向向竖直方向甩5-8下；
（6）加入等量的wash buffer，终止酶解反应，由水平方向向竖直方向甩1-2下；
（7）用40 μm 尼龙膜或滤网过滤，滤液放在50 ml 离心管中；
（8）4°C，离心力200 g，水平转子，离心5 min；离心后，冰上小心吸出上清液，保留下部白色沉淀；
（9）将白色沉淀原生质体用wash buffer洗涤，4°C，200 g，水平转子，再次离心5min；
（10）冰上，弃上清后，使原生质体在冰上自然沉降，吸走上清，保留原生质体，加重悬液1 ml重悬，冰上，轻摇晃；
（11）在显微镜下观察原生质体，其中红色或者无色的为表皮细胞，含有叶绿体的绿色细胞为叶肉细胞。
本发明所使用的玻璃针的直径为1 μm。
进一步的，步骤（4）具体操作过程中：富集200片叶片于酶解液中，放在70 rpm摇床，28°C，避光，酶解4-5 h。
本发明所使用的酶解液具体配方如下：
发明内容
针对现有技术中存在的问题及研究空白，本发明提供了一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法，该方法研究表皮细胞分化具有重要意义，其次也可以用于亚细胞定位研究和原生质体转化等下游实验。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法，包括以下步骤：
（1）将消毒后的植物种子均匀的撒播在MS培养基上，让其生长在正常条件下，培养无菌苗；
（2）播种后5-7天，待植物第一片真叶3-5 mm长时，准备取材；
（3）将植物放在解剖镜下用细头镊子取出第一片真叶，使用玻璃针对真叶进行切割，一片真叶切割2-3段，完全切割下来，每段1-2 mm长，将切割后的叶片立即放入装有20ml的酶解液的离心管中，将酶解液避光；
（4）富集叶片于酶解液中，放在摇床，避光，酶解；
（5）酶解结束后，由水平方向向竖直方向甩5-8下；
（6）加入等量的wash buffer，终止酶解反应，由水平方向向竖直方向甩1-2下；
（7）用40 μm 尼龙膜或滤网过滤，滤液放在50 ml 离心管中；
（8）4°C，离心力200 g，水平转子，离心5 min；离心后，冰上小心吸出上清液，保留下部白色沉淀；
（9）将白色沉淀原生质体用wash buffer洗涤，4°C，200 g，水平转子，再次离心5min；
（10）冰上，弃上清后，使原生质体在冰上自然沉降，吸走上清，保留原生质体，加重悬液1 ml重悬，冰上，轻摇晃；
（11）在显微镜下观察原生质体，其中红色或者无色的为表皮细胞，含有叶绿体的绿色细胞为叶肉细胞。
本发明所使用的玻璃针的直径为1 μm。
进一步的，步骤（4）具体操作过程中：富集200片叶片于酶解液中，放在70 rpm摇床，28°C，避光，酶解4-5 h。
本发明所使用的酶解液具体配方如下：
进一步的，步骤（7）中，所述尼龙膜或滤网提前放入4°C环境中，采用wash buffer提前润湿。
进一步的，步骤（10）中，所述自然沉降的时间为20 min。
本发明所使用的重悬液具体配方如下：
本发明所述的植物为二色补血草。
本发明的有益效果为：
（1）本发明首次利用完整叶片为材料提取原生质体，且包含表皮细胞及叶肉细胞；
（2）通过本发明提供的方法，可以实现原生质体纯度大于95%，活率大于95%，200个真叶可以获得超过30万个原生质体，用于研究表皮细胞分化具有重要意义，其次也可以用于亚细胞定位研究和原生质体转化等下游实验，如基因功能验证、亚细胞定位、细胞测序等。
附图说明
图1为二色补血草取样示意图；
其中：A为生长5-7天的幼苗；B为二色补血草第一片真叶的取材部位；C 为1 μm玻璃针；D 为玻璃针对真叶的切割。
图2为玻璃针切割真叶的演示图；
其中，1为子叶，2为真叶，3为玻璃针。
图3为酶解后获得的叶肉细胞和表皮细胞。
图4为二色补血草原生质体提取示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方式对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
本发明提供的技术方案，其提取示意图如图4所示。本发明所使用的玻璃针使用微电极拉制仪拉制。
本发明所使用的wash buffer（4℃保存）具体配方如表1所示。
表1
实施例1
1.将消毒后的二色补血草的种子均匀的撒播在MS培养基上，让其生长在正常条件下，培养无菌苗。
2. 待植物第一片真叶刚刚长出时（播种后5-7天），如图1A所示，准备取材图1B。
3.将植物放在解剖镜下用细头镊子取出第一片真叶，使用微电极拉制仪拉出的1μm植细的玻璃针（图1C）对真叶进行切割（图1D、图2），制造伤口，一片真叶切割2-3段，完全切割下来，每段1-2 mm长，将切割后的叶片立即放入装有20 ml的酶解液的离心管中，将酶解液避光。
酶解液（现配现用）配方如表2所示。
表2
4.富集200片叶片于酶解液中，放在70 rpm摇床，28°C，避光，酶解4-5 h。不同物种的植物叶片酶解时间不同，酶解过程中可用枪吸取少量酶液观察原生质体的释放情况。
5.酶解结束后，由水平方向向竖直方向甩5下，可根据叶片的硬度或大小控制甩的力度大小和次数，幼嫩的叶片甩的次数控制在5次。在酶解过程中，叶肉细胞先从伤口处脱落，由于表皮细胞有角质的保护，因此，使用用力甩酶解液会有大量的表皮细胞被冲击下来。
6.加入等量的wash buffer，终止酶解反应。稍有力用手水平甩10 s，再次释放原生质体；
7.用40 μm 尼龙膜或滤网（提前放4°C冰箱，提前用wash buffer润湿，过滤，滤液放在新的50 ml 离心管中。注意：冲洗管壁。
8.4°C，200 g，水平转子，离心5 min，注意“低加速度和低减速度”。
9.离心后，可看到管底有白色沉淀，冰上小心吸出上清液，保留下部原生质体。
10. 用wash buffer洗2次，尽量不重悬，4°C，200 g，水平转子，离心5 min。
11.冰上，弃上清后，使原生质体在冰上自然沉降20 min，再用枪头吸走上清，保留原生质体，剩余1 ml；
12.加重悬液1 ml重悬，冰上，轻摇晃。
重悬液配方如表3所示。
表3
13.在显微镜下即可看到原生质体（图3）。红色或者无色的为表皮细胞，含有叶绿体的绿色细胞为叶肉细胞。
实施例1中，血球计数板统计，获得原生质体数量为30万个，纯度95%以上。
对比例1
1.将消毒后的二色补血草的种子均匀的撒播在MS培养基上，让其生长在正常条件下，培养无菌苗。
2.待播种后5周叶龄的健康嫩叶。
3.将嫩叶采用手术刀切成1mm宽的细条，制造伤口，将切割后的叶片立即放入装有20 ml的酶解液的离心管中，将酶解液避光。
其他步骤同实施例1。
该对比例得到的原生质体数量少，且纯度低。同时，由于生长5-7天的第一片真叶非常小，长度在3-5 mm，现有技术是用的手术刀或细针来切割，手术刀或细针的刀口和针头直径都太大，无法实现对叶片的切割，切后叶片被完全损坏，无法分离出原生质体，本发明采用自制玻璃针，针头1 头拉，可以在制造切割获得1-2 mm切段的同时，保护叶片的其他部分。
对比例2
步骤（1）-（4）同实施例1；
5.酶解结束后，采用枪头收集含原生质体的酶解液，然后进行加入等量的washbuffer，终止酶解反应，用枪轻轻吹打清洗细胞；
6.其他步骤同实施例1。
该对比例中，只能得到叶肉细胞，且原生质体数量少。
Claims (4)
1.一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将消毒后的植物种子均匀的撒播在MS培养基上，让其生长在正常条件下，培养无菌苗；
（2）播种后5-7天，待植物第一片真叶3-5 mm长时，准备取材；
（3）将植物放在解剖镜下用细头镊子取出第一片真叶，使用玻璃针对真叶进行切割，一片真叶切割2-3段，完全切割下来，每段1-2 mm长，将切割后的叶片立即放入装有20 ml的酶解液的离心管中，将酶解液避光；
（4）富集200片叶片于酶解液中，放在70 rpm摇床，28℃，避光，酶解4-5 h；
所述酶解液具体配方如下：
（5）酶解结束后，由水平方向向竖直方向甩5-8下；
（6）加入等量的wash buffer，终止酶解反应，由水平方向向竖直方向甩1-2下；
（7）用40 μm 尼龙膜或滤网过滤，滤液放在50 ml 离心管中；
所述尼龙膜或滤网提前放入4°C环境中，采用wash buffer提前润湿；
所述wash buffer具体配方如下：
（8）4°C，离心力200 g，水平转子，离心5 min；离心后，冰上小心吸出上清液，保留下部白色沉淀；
（9）将白色沉淀原生质体用wash buffer洗涤，4°C，200 g，水平转子，再次离心5 min；
（10）冰上，弃上清后，使原生质体在冰上自然沉降，吸走上清，保留原生质体，加重悬液1 ml重悬，冰上，轻摇晃；
（11）在显微镜下观察原生质体，其中红色或者无色的为表皮细胞，含有叶绿体的绿色细胞为叶肉细胞；
所述植物为二色补血草。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述玻璃针的直径为1 μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（10）中，所述自然沉降的时间为20min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重悬液具体配方如下：
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Families Citing this family (2)
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (5)
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN109628376A (zh) * | 2019-01-20 | 2019-04-16 | 华中农业大学 | 一种香石竹叶片原生质体的制备方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 卡特兰叶片原生质体分离条件的研究;陈泽雄等;《西南大学学报(自然科学版)》;20070815(第08期);第97-101页 * |
| 埃塞俄比亚芥的原生质体培养及植株再生;杨美珠等;《Journal of Integrative Plant Biology》;19891231(第02期);第89-94,169页 * |
| 大麦叶肉原生质体的分离与培养初报;黄培铭等;《上海农业学报》;19911231(第04期);第17-20页 * |
| 小麦叶肉细胞原生质体制备参数解析及在基因瞬时表达上的应用;杜晓敏等;《华北农学报》;20151228(第06期);第52-60页 * |
| 矮牵牛叶肉原生质体分离条件的优化;王鹏等;《上海交通大学学报(农业科学版)》;20160721(第06期);第55-60,67页 * |
| 罗勒(Ocimum basilieum)原生质体的分离和纯化;蔡汉权等;《江西农业大学学报》;20060830(第04期);第529-533页 * |
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