CN102994553A - 一种以宽内径持卵管去除哺乳动物卵母细胞核的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种以宽内径持卵管去除哺乳动物卵母细胞核的方法，该方法采用宽内径(内径相当于卵母细胞直径1/5～1/4)持卵管吸持卵母细胞，辅助孵化针在第一极体处切开透明带，宽内径持卵管水平对准透明带裂隙加负压吸出第一极体和1/10～1/8的胞浆，辅助孵化针拨动或转动卵母细胞，使吸出的带核胞浆部分与卵母细胞脱离。本发明中持卵管同时起到了持卵和吸去核的作用，操作简便，减少了去核步骤，缩短了去核操作时间，提高了去核成功率，减少了卵母细胞的损害，有利于后续核移植过程中胚胎的发育。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域的一种去除卵母细胞核的方法，特别涉及一种以宽内径持卵管去除哺乳动物卵母细胞核的方法。
背景技术
哺乳动物体细胞核移植技术是指将去除核的卵母细胞作为受体，以体细胞核作为供体，通过人工手段使两者融合构建重构胚，如将该胚胎移植到代孕母体子宫内并产生个体，则称之为克隆动物；如将重构胚用于胚胎干细胞建系，则称之为体细胞核移植胚胎干细胞。
通过体细胞核移植技术已相继诞生了羊、牛、猪、鼠、兔等哺乳动物和各种核移植胚胎干细胞系。该技术为家畜繁殖、濒危动物拯救、人类器官移植等细胞组织工程开辟了广阔的应用前景。但是，目前体细胞核移植技术仍有一系列问题尚待解决，如重构胚发育阻滞、胚胎质量低下、流产、克隆动物异常、动物克隆效率低下等等，这些都制约了体细胞核移植技术的应用和发展。
哺乳动物卵母细胞去核获取核移植受体是体细胞核移植技术中的关键步骤，去核效率的高低和核移植受体的质量直接关系到所构建的重构胚体外发育和此后的胚胎种植率、妊娠率或胚胎干细胞建系的效率。哺乳动物卵母细胞外面包绕着透明带，卵母细胞胞核常靠近刚排除的第一极体附近。如要去除第一极体和卵母细胞核，则需要在透明带上开一小口或小裂隙。常规的方法是分两步进行，第一步是对透明带进行处理，第二步再换上吸管，在持卵管固定卵母细胞的情况下进行去核及去极体操作。该类方法增加了镜下操作步骤，延长了操作时间，获取的核移植受体质量会受影响，同时吸管如进入透明带内操作可过度损伤卵母细胞膜而难以恢复或卵母细胞破裂。也有方法是在对透明带处理后不更换吸管的情况下对卵母细胞进行去核，如采用显微切割针挤压卵母细胞使得第一极体及核从透明带开口处挤出。但挤压的力度等显微操作难以把握，去核效果常不理想，或需要一种特殊的持卵管，增加了实验的难度。
发明内容
针对背景技术中的问题，本发明提供一种操作简便、卵母细胞损伤小、去核效率高的哺乳动物卵母细胞去核方法。
一种以宽内径持卵管去除哺乳动物卵母细胞核的方法，所述方法采用辅助孵化针在卵母细胞第一极体处透明带切开一裂隙，再用持卵管负压除去第一极体及其附近的胞核。
作为本发明的优选技术方案，采用宽内径的持卵管，其内径为被去核卵母细胞直径的1/4～1/5。
作为本发明的优选技术方案，持卵管兼持卵和负压去核的功能。
作为本发明的优选技术方案，采用辅助孵化针转动或拨动卵母细胞，使吸出的带核胞浆部分与卵母细胞脱离，透明带裂隙的张力修复卵母细胞损伤处。
作为本发明的优选技术方案，所述卵母细胞来源于哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、兔、羊、狗、猫、牛等。
本发明所带来的有益效果是：本发明中持卵管同时起到了持卵和吸去核的作用，操作简便，减少了去核步骤，缩短了去核操作时间，提高了去核成功率，减少了卵母细胞的损害，提高核移植受体的质量，有利于后续核移植过程中胚胎的发育。
附图说明
图1是处于第二次减数分裂中期的哺乳动物卵母细胞基本结构示意图。
图2是宽内径持卵管前端结构示意图。
图3是宽内径持卵管吸持卵母细胞效果示意图，第一极体处于6点钟位置。
图4是辅助孵化针从第5点钟位置进入透明带，从第7点钟位置穿出透明带，对卵母细胞透明带进行切割示意图。
图5是宽内径持卵管水平对准第一极体和透明带裂隙负压吸出第一极体和卵母细胞核示意图。
图6是在辅助孵化针的拨动或转动下，是使吸出的带核胞浆部分与卵母细胞脱离示意图。
图中标号为：
1-透明带 2-卵母细胞 3-第一极体
4-宽内径持卵管 5-持卵管内径 6-持卵管外径
7-辅助孵化针 8-带核胞浆
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
参见图2，在拉针仪和锻针仪上制备宽内径(内径相当于卵母细胞直径1/5～1/4)持卵管。调试好显微操作系统。
将待拆除颗粒细胞的待去核的人卵母细胞(MII)转移HTF-HEPES微滴中，置于显微操作系统倒置显微镜上。参见图3，用宽内径持卵管吸持卵母细胞，将极体置于6点钟或12点钟的位置。
参见图4，辅助孵化针在第一极体处切开透明带，裂隙约为透明带周长的1/4(如第一极体处于6点钟的位置，则辅助孵化针从第5点钟位置进针，从第7点钟位置出针，避开卵母细胞膜，并在5点钟和7点钟之间切开透明带)。
参见图5，将宽内径持卵管水平对准透明带裂隙加负压吸出第一极体和1/10～1/8的胞浆。可采用气压，注意负压不要太大，压力变化要小，防止卵母细胞溃破。
参见图6，辅助孵化针拨动或转动卵母细胞，使吸出的带核胞浆部分与卵母细胞脱离(该过程类似从一大面团上捏下一小面团)，利用透明带裂隙的张力自动修复卵母细胞膜。此后可采用Hochest33342检测核的情况，如被去核的卵母细胞情况良好，则可应用于后续的核移植实验。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种以宽内径持卵管去除哺乳动物卵母细胞核的方法，其特征在于，所述方法采用辅助孵化针在卵母细胞第一极体处透明带切开一裂隙，再用持卵管负压除去第一极体及其附近的胞核。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用宽内径的持卵管，其内径为被去核卵母细胞直径的1/4～1/5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，持卵管兼持卵和负压去核的功能。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用辅助孵化针转动或拨动卵母细胞，使吸出的带核胞浆部分与卵母细胞脱离，透明带裂隙的张力修复卵母细胞损伤处。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞来源于哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、兔、羊、狗、猫、牛等。
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