CN111676188A - 一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液，制备方法为：首先称取0.0232g褪黑素溶解在1ml无水乙醇中制备成100mM的浓储液，将100mM的浓储液在IVM培养基中稀释至终浓度为10‑6mol/L,且无水乙醇的终浓度小于IVM培养基的0.01％，得到高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液。通过本发明，针对商品化的小鼠卵母细胞体外成熟培养液，其培养效率远远不能满足生产以及胚胎移植的需要，对商品化小鼠卵母细胞体外成熟培养液的改进，显著提高了高龄小鼠卵母细胞的成熟率(87.53±2.88％)和受精后的卵裂率(79.04±3.13％)、囊胚率(65.69±2.07％)，同时，还改善了线粒体的分布和活性，降低氧化应激水平和早期细胞凋亡来减弱衰老所引起的卵母细胞退化。

Description

一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液
技术领域
本发明涉及一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液，属于动物繁殖领域。
背景技术
针对高龄小鼠卵母细胞体外成熟培养的方法鲜有报道，目前对于市面上商品化的小鼠卵母细胞体外成熟培养液直接用于高龄小鼠的体外培养，成熟率只能达到77.64±2.13％，体外受精后的卵裂率为41.77±0.59％，囊胚率为35.55±2.22％，这些数值显著低于青年小鼠的培养效果。其原因可能是由于随着随着年龄的增长，体内激素水平的改变影响了卵巢的生殖功能，降低了卵母细胞的质量，因此有必要寻找一种能够优化商品化小鼠体外成熟的培养液，改善高龄小鼠卵母细胞的质量。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液。
本发明的目的是这样实现的，一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液，其特征在于，制备方法为：首先称取0.0232g褪黑素溶解在1ml无水乙醇中制备成100mM的浓储液，将100mM的浓储液在IVM培养基中稀释至终浓度为10-4mol/L或10-6mol/L或10-8mol/L,且无水乙醇的终浓度小于IVM培养基的0.01％，得到高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液。
利用一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液对高龄小鼠卵母细胞的评价，其特征在于，从高龄小鼠卵巢中剥离获取未成熟的卵母细胞放在高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液培养16-18h，通过第一极体率来评判卵母细胞成熟效果；将体外成熟后的卵母细胞进行体外受精，通过评判卵裂率和囊胚率来评估受精能力和早期胚胎的发育能力；最后通过检测线粒体分布、ROS水平和细胞早期凋亡水平，来判断体外培养卵母细胞的质量。
本发明方法先进科学，通过本发明，提供的一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液，针对商品化的小鼠卵母细胞体外成熟培养液，其培养效率远远不能满足生产以及胚胎移植的需要，对商品化小鼠卵母细胞体外成熟培养液的改进，显著提高了高龄小鼠卵母细胞的成熟率(87.53±2.88％)和受精后的卵裂率(79.04±3.13％)、囊胚率(65.69±2.07％)，同时，还改善了线粒体的分布和活性，降低氧化应激水平和早期细胞凋亡来减弱衰老所引起的卵母细胞退化。
本发明所述的一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液，首先称取0.0232g褪黑素溶解在1ml无水乙醇中制备成100mM的浓储液，在IVM培养基中稀释至终浓度为10-4mol/L,10-6mol/L,10-8mol/L,且无水乙醇的终浓度小于培养基的0.01％。制备IVM成熟培养滴并在在37℃，5％CO2培养箱中提前一天过夜平衡。
从高龄小鼠卵巢中剥离获取未成熟的卵母细胞放在IVM成熟培养滴培养16-18h，通过第一极体率来评判卵母细胞成熟效果。接下来进行体外受精，通过评判卵裂率和囊胚率来评估受精能力和早期胚胎的发育能力。最后通过检测线粒体分布、ROS水平和细胞早期凋亡水平，来判断体外培养卵母细胞的质量。
以商品化小鼠卵母细胞体外成熟夜为基准，其中含有10-8-10-4mol/L的褪黑素。所述体外成熟培养液为含有10-6mol/L褪黑素的小鼠体外成熟培养液。
本发明与提供了一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液，用于解决高龄小鼠卵母细胞体外成熟、体外受精以及后续早期胚胎发育能力低下的缺陷，提高高龄小鼠卵母细胞体外培养的质量。本发明是在商品化的小鼠体外成熟培养液中添加不同浓度(0、10-4、10-6、10-8mol/L)的褪黑素，以第一极体排出率和受精后的卵裂率、囊胚率作为卵母细胞质量的评判依据筛选出最佳浓度，并通过线粒体分布检测、ROS水平检测和细胞早期凋亡水平检测，来判断卵母细胞的质量。本发明筛选得到10-6mol/L的褪黑素添加于体外成熟培养液，显著提高了高龄小鼠卵母细胞的成熟率(87.53±2.88％)、受精率(79.04±3.13％)和囊胚率(65.69±2.07％)，且该浓度褪黑素可以通过改善线粒体的分布和活性，降低氧化应激水平和早期细胞凋亡来减弱衰老所引起的卵母细胞退化。
本发明旨在寻找一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液，提高成熟、受精和早期胚胎发育能力，以期为优化动物卵母细胞体外培养系统以及人工辅助生殖技术(ART)提供参考。
有益效果：本发明是在商品化小鼠体外成熟培养液中添加了一种抗氧化剂—褪黑素，它可以改善线粒体的活性和分布，降低ROS水平和早期凋亡水平来提高高龄小鼠卵母细胞的质量，进而改善了体外成熟、体外受精和早期胚胎发育能力。且本发明操作简单明了，还可以为高龄的大型草食类动物的卵母细胞体外培养和人工辅助生殖技术提供借鉴和参考。
附图说明
图1为褪黑素对高龄小鼠卵母细胞体外成熟的影响。
其中，A为不同浓度褪黑素处理后卵母细胞形态，比例尺＝100μm；B为不同浓度梯度褪黑素对高龄小鼠卵母细胞第一极体排出率的影响(对照组：78.76±2.26％，n＝165；10-4mol/L组：77.64±2.13％，n＝196；10-6mol/L组：87.53±2.88％，n＝221；10-8mol/L组：82.44±1.60％，n＝214)。*P<0.05，数据以五次重复实验的Mean±SEM表示。
图2为褪黑素对高龄小鼠卵母细胞体外受精的影响。
其中，A为不同浓度褪黑素处理后2-cell形态，比例尺＝100μm；B为不同浓度梯度褪黑素对高龄小鼠卵母细胞体外受精后卵裂率的影响(对照组：41.77±0.59％，n＝82；10- 4mol/L：60.17±3.22％，n＝107；10-6mol/L：79.04±3.13％,n＝85；10-8mol/L：77.45±4.98％，n＝74)。**P<0.01，数据以三次重复实验的Mean±SEM表示。
图3为褪黑素对高龄小鼠卵母细胞体外胚胎发育的影响。
其中，A为不同浓度褪黑素处理后囊胚形态，比例尺＝100μm；B为不同浓度梯度褪黑素对高龄小鼠囊胚率的影响(对照组：35.55±2.22％,n＝34；10-4mol/L41.07±0.67％，n＝63；10-6mol/L 65.69±2.07％，n＝67；10-8mol/L 55.33±7.67％，n＝58)。*P<0.05,**P<0.01，数据以三次重复实验的Mean±SEM表示。
图4为褪黑素对高龄小鼠卵母细胞线粒体分布的影响。
其中，A为对照组和褪黑素处理组(1×10-6mol/L)卵母细胞线粒体分布的典型图像。比例尺＝50μm。B为对照组和褪黑素处理组(1×10-6mol/L)卵母细胞线粒体异常分布率(对照组：43.06±0.69％,n＝85；10-6mol/L：32.71±0.81％，n＝72)。**P<0.01，数据以三次重复实验的Mean±SEM表示。
图5为褪黑素对高龄小鼠卵母细胞内ROS水平的影响。
其中，A为对照组和褪黑素处理组(1×10-6mol/L)卵母细胞ROS水平代表性图像。比例尺＝100μm。B为对照组和褪黑素处理组(1×10-6mol/L)卵母细胞ROS的相对荧光强度(对照组：1.00±0.09，n＝61；10-6mol/L：0.45±0.07，n＝91)。*P<0.05，数据以三次重复实验的Mean±SEM表示。
图6为褪黑素对高龄小鼠卵母细胞的早期凋亡的影响。
其中，A为对照组和褪黑素处理组(1×10-6mol/L)卵母细胞早期凋亡典型图像。比例尺＝50μm。B为对照组和褪黑素处理组(1×10-6mol/L)卵母细胞的早期凋亡率(对照组：48.54±1.40％，n＝90；10-6mol/L组：30.14±2.89％，n＝93)。**P<0.01，数据以三次重复实验的Mean±SEM表示。
具体实施方式
材料与方法；
1.供试动物及饲养管理；
ICR雌性小鼠(10-12月龄)和雄鼠(8-12周龄)均购自扬州大学比较医学中心，饲养于20-25℃，12h明暗间隔的控温控光环境中，自由采食与饮水，经过3-5d的适应后进行实验,操作均符合实验动物福利的相关规定。
2.主要试剂及仪器；
孕马血清促性腺激素PMSG(宁波第二激素厂)，M2培养液、石蜡油、透明质酸酶、褪黑素(美国sigma公司)；IVM(体外成熟培养液)、TYH(精子获能液)、HTF(受精液)、KSOM(胚胎培养液)(南京爱贝生物技术公司)；活性氧检测试剂盒、Mito-Tracker Red CMXRos线粒体红色荧光探针、AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒(中国碧云天生物技术研究所)；DPBS(上海生工生物工程股份有限公司)、CO2培养箱(Heal Force，HF90/HE240)、倒置荧光显微镜(德国Leica，DMIRB)、倒置荧光显微镜(德国Leica，DMi8)。
3.卵母细胞的收集与培养；
选取健康的高龄母鼠(10-12月龄)，腹腔注射10IU孕马血清促性腺激素(PMSG)，46-48h后脱颈处死，打开腹腔，取出卵巢放在M2培养液中，在体式镜下用1ml注射器针头将卵巢戳破，用捡卵针收集COCs，洗涤三次后，转移至100μlIVM微滴中进行体外成熟，其中微滴覆盖有石蜡油且在37℃，5％CO2培养箱中提前过夜平衡，16-18h后在0.1％的透明质酸酶溶液中吹打以脱去卵丘，并以第一极体排出情况判断成熟率。
4.褪黑素处理；
称取0.0232g褪黑素溶解在1ml无水乙醇中制备成100mM的浓储液，在IVM培养基中稀释至终浓度为10-4mol/L,10-6mol/L,10-8mol/L,且无水乙醇的终浓度小于培养基的0.01％。
5.体外受精和胚胎发育；
1)微滴的准备：卵母细胞受精的前一天晚上在35mm的培养皿上制备一个体积为100μl和3个30μl(清洗滴)的TYH获能滴、HTF受精滴，同时也准备每皿含12个20μl的KSOM小液滴，整齐排列，盖上石蜡油，在37℃，5％CO2培养箱中过夜平衡。
2)精子的获能：选取具有成功交配史的雄鼠(8-10周龄)，脱颈处死，打开腹腔，剪去附睾尾，将其置于预先平衡的获能液滴中用1ml注射器在附睾尾划4-5下，用镊子挤压以释放出精子，并在培养箱中获能50分钟。
3)体外受精：将体外成熟16-18h的卵母细胞清洗三遍后转移至HTF微滴中，并将获能后的精子液同时加入(精子密度控制在1-3*106个/ml，加入体积为10-20μl)，置于培养箱中，共同孵育6h左右。
4)胚胎培养：受精完成后，将受精卵在预先平衡好的KSOM微滴中清洗三遍，每个微滴中放10-15枚受精卵，继续培养，然后观察胚胎发育的情况。
6.ROS含量的检测；
按照活性氧检测试剂盒说明书，将卵母细胞在含10μmol/L(1:1000)的M2培养液中，37℃，5％CO2培养箱内避光孵育30分钟，然后在DPBS中清洗三次后，将卵母细胞置于倒置荧光显微镜下观察拍照，并用ImageJ软件分析卵母细胞的平均荧光强度。
7.卵母细胞线粒体活性的检测；
按照Mito-Tracker Red CMXRos线粒体红色荧光探针试剂盒说明书，将卵母细胞在含200nmol/L的M2培养基中37℃，5％CO2培养箱内避光孵育30分钟，然后在M2培养基中洗涤3次后，活卵压片，并转移至倒置荧光显微镜下观察。
8.卵母细胞早期凋亡的检测；
按照AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒说明书，在避光条件下，用含5μlAnnexin-VFITC与195μl结合缓冲液在25℃下对卵母细胞染色15分钟。M2培养液洗涤3次后，活卵压片，在倒置荧光显微镜下观察卵母细胞，检测膜上的荧光信号。

Claims (2)

1.一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液，其特征在于，制备方法为：首先称取0.0232g褪黑素溶解在1ml无水乙醇中制备成100mM的浓储液，将100mM的浓储液在IVM培养基中稀释至终浓度为10-4mol/L或10-6mol/L或10-8mol/L,且无水乙醇的终浓度小于IVM培养基的0.01％，得到高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液。
2.利用权利要求1所述的一种高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液对高龄小鼠卵母细胞的评价，其特征在于，从高龄小鼠卵巢中剥离获取未成熟的卵母细胞放在高龄小鼠卵母细胞体外成熟的优化液培养16-18h，通过第一极体率来评判卵母细胞成熟效果；将体外成熟后的卵母细胞进行体外受精，通过评判卵裂率和囊胚率来评估受精能力和早期胚胎的发育能力；最后通过检测线粒体分布、ROS水平和细胞早期凋亡水平，来判断体外培养卵母细胞的质量。
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