CN108918518B - 普通光学、荧光和扫描电子显微镜对同一细胞形态的观察方法 - Google Patents

普通光学、荧光和扫描电子显微镜对同一细胞形态的观察方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用普通光学显微镜、荧光显微镜和扫描电子显微镜对同一细胞进行观察的方法，其特征在于，利用石蜡对样品进行包埋，将包埋样品进行组织切片，根据初步观察来确定切片进度；所得切片，通过组织与荧光复合染料染色，在白光和不同波段的荧光激发下利用显微镜获得两种观察结果；然后将剩余包埋样品经处理后利用扫描电子显微镜观察，获得样品切面的扫描结果。本发明不仅对于同一个细胞通过普通光学显微镜获得细胞的基本形态、大小及基本组成结构，也可以在荧光显微镜获得细胞内的某些特殊结构，同时还可利用扫描电子显微镜获得细胞内部三维立体图像。这对研究细胞形态发育，及细胞内部结构尤其是细胞核的形态与功能将十分有利。

Description

普通光学、荧光和扫描电子显微镜对同一细胞形态的观察 方法
技术领域
本发明属于生物实验技术领域，具体涉及对同一细胞的普通光学显微镜，荧光显微镜和扫描电子显微镜这三种形态观察的方法。
背景技术
细胞是生物体的基本结构与功能单位，对于细胞的研究是生命科学的传统也是热点。然而对于同一个细胞，通常的手段是利用光学显微镜观察；近代以来开始利用透射电子显微镜和扫描电子显微镜进行观察，透射电子显微镜可以观察到细胞内部结构，扫描电子显微镜可以观察到细胞表面的形态；现在先进的技术是利用冷冻断裂或者激光共聚焦显微镜观察细胞内部结构。然而所有这些显微镜都只能对同一个细胞利用一种方法来进行观察，不能达到对于同一个细胞利用两种或两种以上的方法来观察和分析。
石蜡切片是通过将生物组织切成薄片，然后利用组织染色，在光学显微镜观察获得组织切面轮廓以及组织中各种细胞的大小与形态，所得的图像具有粗线条、大轮廓的特点，但是由于石蜡切片的图像为平面图像且光学显微镜放大的倍数有限(最大放大倍数1600倍)，很难对细胞的三维立体形态和亚细胞结构做观察。荧光染色，是在常规组织切片染色的基础上利用荧光染料对细胞进行标记，然后通过荧光显微镜进行观察，可以获得组织中某些特定的细胞，或者细胞中某些特定的细胞器。扫描电子显微镜技术通常是获得细胞的外部形态，其结果具有很强的立体感，能获得三维结构图像，且分辨率极高，对植物组织和亚细胞结构的准确分辨十分有利。然而扫描电子显微镜只能观察到组织细胞表面的形态。
现有的技术方案是寻找三个尽可能一致处理的细胞样品，分别用组织染色显微观察、荧光染色显微观察与扫描电子显微镜三种方法分别观察，以获得这三种不同的观察结果。这种方法的最大的缺点是，不能找到三个相同的细胞，即使非常相似也不能作为同一个细胞来看待。同时对于一些珍贵的样品，三种处理会使得样品浪费。再有就是三种处理三个样品，本身会增加工作量，也不是高效的方法。另一种方法是对已经做成石蜡切片的蜡带脱蜡处理后进行扫描电子显微镜观察。然而若是利用对蜡带脱蜡进行处理，只能获得切面的扫描图像，而不能看到石蜡切片的组织染色与荧光显微结果；同时因样片已经进行切片，所以无法获得细胞的三维轮廓。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种利用普通光学显微镜、荧光显微镜和扫描电子显微镜对同一细胞进行观察的方法。
本发明提供的利用普通光学显微镜、荧光显微镜和扫描电子显微镜对同一细胞进行观察的方法，其为对样品石蜡包埋后进行组织切片，切片进度根据在普通光学显微镜下初步观察组织切片的结果来确定，石蜡切片所得切片，通过组织与荧光复合染料染色，然后在白光和不同波段的荧光激发下进行观察，最后将剩余已经包埋好的样品蜡块经过脱蜡处理后再进行电镜扫描，获得样品切面的扫描电子显微镜结果。
植物组织经过染色在普通光学显微镜下，细胞核显示紫红色，核仁显示深紫色，细胞膜显示绿色，细胞壁不显色，导管细胞紫红色。在不同荧光的波段激发下，细胞中不同细胞器显示不同颜色，所述的荧光波段为B激发光波滤色组件：激发BP460-490，截止BA520，分色DM500，细胞壁为绿色，细胞核为红色，核仁为深红色，质体为亮黄色，细胞膜不显色；G激发光波滤色组件：激发BP510-550，截止BA590，分色DM570，细胞壁为红色，细胞核为红色，质体为黄色，细胞膜不显色；U激发光波滤色组件：激发BP330-385，截止 BA420，分色DM400，细胞壁，细胞质为不明显的灰色，细胞核红色，质体亮黄色。
其中，所述的脱蜡处理为：将剩余已经包埋好的样品蜡块置于二甲苯中，浸泡二甲苯的样品置于40℃的恒温箱中，3小时换新溶液，重复3次；将置于二甲苯中退蜡的样品转移到1/2二甲苯+1/2乙醇 (100％)混合液中在40℃的恒温箱浸泡3小时，之后样品需换成100％乙醇浸泡3小时，重复100％乙醇浸泡3小时，再将样品浸入乙酸异戊酯中；将处理完的材料置于临界点干燥仪中进行临界点干燥。
本发明不仅可以同普通光学显微镜观察到细胞的形态大小，以及基本的细胞结构，如细胞壁，细胞膜等。而且利用荧光染料将组织中不同的细胞器进行标记，对于同一个细胞内部一些结构也获得某些信息，比如细胞质里面的质体有非常亮的荧光反应。同时还可以获得同一个细胞的电镜扫描结果，可以观察到细胞的外部轮廓以及细胞内部细微结构的高倍率、高分辨的三维像，这对研究细胞形态和功能将十分有利。
附图说明
图1所示为玉兰胚珠在光学显微镜观察结果(100X)。
图2所示为玉兰胚珠在荧光显微镜紫外光激发观察结果(100X)。
图3所示为玉兰胚珠在扫描电子显微镜观察结果(1000X)。
图4所示为玉兰胚珠在光学显微镜观察结果(400X)。
图5所示为玉兰胚珠在荧光显微镜紫外光激发观察结果 (400X)。
图6所示为玉兰胚珠在扫描电子显微镜观察结果(400X)。
图7所示为侧柏胚珠普通显微镜观察结果(400X)。
图8所示为侧柏胚珠在荧光显微镜紫外光激发(400X)。
图9所示为侧柏胚珠在荧光显微镜红光激发(400X)。
图10所示为侧柏胚珠在荧光显微镜蓝光激发(400X)。
图11所示为侧柏胚珠在扫描电子显微镜观察结果(1000X)。
图12所示为侧柏胚珠在扫描电子显微镜观察结果(5000X)。
图13所示为侧柏胚珠在扫描电子显微镜观察结果(10000X)。
图14所示为侧柏胚珠利用细胞核特异性染料DAPI染色后在荧光显微镜紫外光激发观察结果(400X)。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
材料为玉兰胚珠与侧柏胚珠
1)固定：用FAA固定液(70％酒精：甲醛：冰乙酸＝90:5:5)，常温下固定24h。
2)脱水系列溶液浸泡，各试剂浸泡一天，按下表1-6的顺序。
表1
Figure BDA0001667726070000041
3)浸蜡
恒温箱温度调至60℃，将样品置于玻璃瓶内，加入适量蜡屑，少量叔丁醇，加盖，两天后开盖，使叔丁醇挥发，浸蜡一周。
4)包埋
将液体蜡倒入铝盒内，置于展片机上防止凝固，展片机温度设定为60℃，将浸蜡一周的材料放入液体蜡中，在室温下缓慢凝固时用烧热的镊子上下挑动，使样品位于蜡块中央，表面凝固后将其置于冰袋上，3～5min后置于与冰袋同盆的水中。
5)修块、粘块
用小刀划蜡块表面，用手掰开，保证每个蜡块中仅有一个样品，再用小刀将蜡块边缘修整齐。取少量蜡屑熔化后倾倒在小木块的一面，将蜡块粘贴于其上，待冷却后将其置于切片机上修蜡块为梯形。
6)切片
在载玻片毛玻璃部分做好标记，同面光滑部分均匀涂少量蛋白贴剂，再滴适量蒸馏水，在切片机上将蜡块切为8～10μm的蜡带，取适当长度将其排列在载玻片上。在展片机上展片后用吸水纸吸去蒸馏水，然后在光学显微镜下至于40倍放大情况下镜检，根据镜检结果来控制样片切片的进度，直到切面位于样品对称线时停止切片，然后将展好的片子置于40℃烘箱中经行干燥，时间最好两天后，确保样品完全黏附于载玻片上。
7)染色
采用组织与荧光复合染料对组织切片染色。所用的染料为番红 T+固绿。
8)封片
中性树脂封片。
9)石蜡切片的观察
将组织切片置于普通显微镜结果见附图1，图4，图7。荧光显微镜下观察结果见附图2，图5，图9(B激发光波滤色组件)，图8 (G激发光波滤色组件)，图10(U激发光波滤色组件)。
脱蜡方法与电镜扫描
浸泡式脱蜡：
1、脱蜡--试剂：二甲苯或叔丁醇
将石蜡切片剩余的样品分为2组，一组用二甲苯浸泡，置于40℃恒温箱内；另一组用叔丁醇浸泡，置于60℃恒温箱内，浸泡的时间设定为3小时，6小时和9小时，每个时间段两个样品重复三次。
2、过渡到乙酸异戊酯
表2
Figure BDA0001667726070000061
3、临界点干燥
将材料置于临界点干燥仪中进行临界点干燥
4、扫描电子显微镜结果
结果见附图3，图6，图11，图12，图13。
对比例1
材料为侧柏胚珠。
基本步骤同实施例1，荧光染料选用DAPI。
结果如图14所示。DAPI作为核酸的特异性燃料，只有在紫外光下细胞核显示蓝色，但细胞中其他结构不能显示染色，这与番红花T 除了细胞核显示红色外，细胞壁在蓝色荧光激发下可以显示绿色，细胞内的质体可以在紫外光和蓝色荧光激发显示亮黄色形成鲜明的对比。同时在普通光学显微镜下，DAPI染色是没有任何显色的，所以不适合作为普通光学显微镜的染色剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本专利在研究过程中得到了中央高校基本科研业务费(Z109021614) 和大学生科技创新项目(S201710712003)，(1201610712028)和(3201710712058)的支持。

Claims (2)

1.利用普通光学显微镜、荧光显微镜和扫描电子显微镜对同一细胞进行观察的方法，其特征在于，对样品石蜡包埋后进行组织切片，切片进度根据在普通显微镜下初步观察组织切片的结果来确定，石蜡切片所得切片，通过组织与荧光复合染料染色，然后在白光和不同波段的荧光激发下利用普通光学显微镜和荧光显微镜进行观察，最后将剩余已经包埋好的样品蜡块经过脱蜡处理后再进行电镜扫描，获得样品切面的扫描电子显微镜结果，
其中，在普通光学显微镜下，细胞壁不显色，细胞膜显示绿色，细胞质显示蓝色，细胞核显示紫红色，核仁显示深紫色，导管细胞紫红色，在不同荧光的波段激发下，细胞中不同结构显示不同颜色，所述的荧光波段为B激发光波滤色组件：激发BP460-490，截止BA520，分色DM500，细胞壁为绿色，细胞膜不显色，细胞质不显色，细胞核为红色，核仁为深红色，质体为亮黄色；G激发光波滤色组件：激发BP510-550，截止BA590，分色DM570，细胞壁为红色，细胞膜不显色，细胞质不显色，细胞核为红色，质体为黄色；U激发光波滤色组件：激发BP330-385，截止BA420，分色DM400，细胞壁，细胞膜和细胞质不显色，细胞核红色，质体亮黄色，其中，所用的荧光复合染料为番红T+固绿。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脱蜡处理为：将剩余已经包埋好的样品蜡块置于二甲苯中，浸泡二甲苯的样品置于40℃的恒温箱中，3小时换新溶液，重复3次；将置于二甲苯中退蜡的样品转移到1/2二甲苯+1/2乙醇100%混合液中在40℃的恒温箱浸泡3小时，之后样品需换成100%乙醇浸泡3小时，重复100%乙醇浸泡3小时，再将样品浸入乙酸异戊酯中；将处理完的材料置于临界点干燥仪中进行临界点干燥，之后进行扫描电子显微镜观察。
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