CN110361384A - 一种基于茎尖的辣木染色体核型分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于茎尖的辣木染色体核型分析方法，包括以下主要步骤：S1取材：在晴朗的上午采集健康辣木新枝茎尖为0.5‑1cm为试验材料；S2预处理:置于对二氯苯中预处理2.5h；S3:固定与保存；S4.染色体标本制备：采用酶解去壁低渗法，经前低渗、酶解、后低渗、涂片获得较佳的染色体标本，其中酶解采用4％纤维素酶和5％果胶酶混合物酶解4h；S5.染色:吉姆萨染色15min，S6:镜检。本发明提供了一种简单易操作，适用于原位PCR、FISH操作的辣木染色体核型分析方法，为辣木细胞学研究提供技术基础；本发明首次报道了辣木核型公式为2n＝2x＝2n＝28m，属于1B类型，核型不对称系数60.29％，属于较原始物种，为辣木的起源，演化及遗传育种提供一定理论依据。
Description
技术领域
本发明属于涉及一种染色体核型分析方法，具体涉及一种基于茎尖的辣木染 色体核型分析方法，属于树木细胞学研究技术的领域。
背景技术
辣木(Moringa oleifera Lam)，又称鼓槌树，属辣木科(Mofingaceae)、 辣木属(Mornga)多年生乔木，原产于印度和非洲，辣木科仅有一属14种。 辣木含有丰富的纤维、维生素、矿物质、蛋白质、氨基酸、多糖、辣木素、皂苷、 酚类和活性酶类等成分，具有消炎、抑菌、降血糖、降胆固醇、凝血、抗氧化、 抗肿瘤和癌症等功能，因此，辣木又被誉为“神奇之树”和“母亲最好的朋友”。 很多发展中国家利用其来改善儿童营养不良，具有食用、园艺植物、工业、药用 等多种用途。
染色体核型分析技术能明确识别各个染色体的特征，有助于基因定位的研究， 它是细胞遗传学的一项基本技术，也是染色体工程、细胞分类学和植物育种学的 一个不可缺少的手段。目前，辣木细胞学上的研究仅局限于辣木染色体数量和倍 性的研究。Puri等以印度多油辣木材料的小孢子发育，观察到二倍体染色体数 2n＝28。张洁等以多油辣木栽培品种PKM1的茎尖为材料，同样得出二倍体染色 体数2n＝28。Mendioro等以花蕾为材料，也得出二倍体染色体数2n＝28。魏静和 向素琼等均以辣木茎尖为材料，均确定辣木为二倍体，染色体数2n＝28，初步得 出染色体长度和染色体组总长度。但最后均未能得到臂比、着丝点位置、核型的 不对称程度和核型公式等核型指标，进而进行核型分析。至今，有关辣木染色体 核型分析的研究未见报道。
发明内容
针对辣木染色体数目已有报道，但由于受染色体小，且细胞不够清晰，得不 到具体的相关数据导致目前辣木染色体核型还未见报道的现状。本发明提供了一 种基于茎尖的辣木染色体核型分析方法，该方法不仅能得到清晰可利于核型分析 的染色体，还适用于后期原位PCR、FISH等基因定位的研究。为辣木的起源，演 化及遗传育种提供一定的理论依据和技术基础。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
S1:取材
在晴朗的上午9：00-11:00采集健康、快速生长期的辣木新枝茎尖、小叶或大 叶；
S2：预处理
把刚采集的茎尖进行预处理；
S3:固定与保存
倒掉预处理液，清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)，在 黑暗4℃环境下固定24h，移弃固定液，直接用来染色体制片，若需保存，把固 定过的茎尖依次在75％，90％，95％乙醇溶液各脱水3min，最后保存在75％乙醇 中保存备用；
S4:染色体标本制备
(1)前低渗:把S3固定的茎尖置于蒸馏水中进行前低渗30min；
(2)酶解:把步骤(1)的茎尖置于盛有5％纤维素酶和4％果胶酶混合液的 1ml离心管中，并置于37℃的恒温水浴锅中酶解3-5h；
(3)后低渗:吸取酶液，缓缓地沿着管壁加入蒸馏水，后低渗30min；
(4)后固定:吸取蒸馏水，滴加临时配制的固定液(3乙醇：1冰醋酸)， 后固定15min；
(5)涂片：把玻片、固定液均置于冰面上，取一张玻片，先滴3滴固定液， 再夹取1-2个根尖置于玻片上，用解剖针挑取白白的根尖分生组织，并迅速捣碎 再均匀涂抹在载玻片上，再从一端滴加一滴固定液使细胞扩散，接着在火焰上迅 速烘烤，自然风干；
S5:染色
将缓冲液(甲液、乙液)与吉姆萨原液按比例制成工作液，再把干燥的制片 置于吉姆萨染色液中染色10-20min，清水冲洗干净，置于烘箱37℃烘干；
S6:镜检
用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照，在40X物 镜下对单位视野面积内处于分裂中期的细胞进行计数，选择30个染色体分散且 形态较好的细胞进行染色体数目统计，选取5个染色体形态清晰且无重叠的细胞 用Photoshop图像软件进行核型分析。
本发明通过对照实验证明了茎尖是最佳的染色体核型分析的材料，实验表明采用饱和对二甲苯作为预处理，且预处2h能取得较佳的制片效果。结合以往经验， 本发明采用的是酶解去壁低渗法来制片，比常规压片法得出的细胞要分散，清晰。 且该方法制得染色体标本有易保存、细胞紧贴玻片、不用盖玻片的特点，能直接 为后期原位PCR.FISH等基因定位等技术提供优质的染色体制片。实验证明采用 5％纤维素酶和4％果胶酶混合液酶解4h制片效果比较好。
优选的，S1所述的采集的新枝茎尖，长度为0.5-1cm。
优选的，S2所述的预处理为8-羟基喹啉液处理2-3h或对二氯苯液处理 1.5-2.5h，最佳预处理为对二氯苯液处理2h。
优选的，S4所述的染色体制片方法采用酶解去壁低渗法。
优选的，S4所述的步骤(2)采用纤维素酶和果胶酶酶解的最佳时间为4h。
优选的，S5所述的用吉姆萨染色最佳时间为15min。
优选的，步骤S5所述的甲液为PH＝6.8的KH2PO4缓冲液、乙液为PH＝6.8的 Na2HPO4缓冲液，甲液：乙液：吉姆萨原液的比例为22:27:1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.采用本发明提供的辣木染色体核型分析方法制片能获得清晰的核型分析 图，首次报道辣木核型公式为2n＝2x＝2n＝28m，属于1B类型，核型不对称系数 60.29％，为辣木的起源，演化及遗传育种提供一定理论依据。
2.本发明采用的是酶解去壁低渗法制备染色体标本，比常规压片法得出的细 胞要分散，清晰。且该方法制得染色体标本有易保存、细胞紧贴玻片、不用盖玻 片的特点，能直接为后期原位PCR.FISH等基因定位等技术提供优质的染色体制 片。
附图说明
图1为染色体核型分析图。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做 任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域 常规试剂、方法和设备。
实施例1
不同取材部位对中期细胞比率和形态的影响
于晴朗的上午9：00-11:00采集健康辣木的新枝茎尖，长度小于3mm的幼 叶(以下简称小叶)以及长度在3-8mm幼叶(以下简称大叶)，分别置于0.002mol/L 8-羟基喹啉处理2h。按照酶解去壁低渗法通过固定、前低渗、酶解、后低渗、 后固定和涂片制备染色体标本，再用吉姆萨染色，用POTIKA正立显微镜观察， Optika Vision pro拍照系统拍照。试验结果如表1。
从表1可知，不同取材部位对中期细胞数目和形态的影响均较大。三种材料 中期细胞所占比率分别为茎尖22.6％，小叶14.3％，大叶5.4％；适合核型分析的 中期细胞比率为茎尖18.2％，小叶7.8％，大叶1.3％。由此可见，茎尖所含的中 期细胞比率明显大于小叶和大叶的。由于茎尖是分生组织，新陈代谢快，细胞活 动最活跃，中期分裂相最多；小叶边缘组织的新陈代谢又比大叶的快，分裂相也 明显比大叶多。从中期细胞的形态来看，茎尖细胞大，细胞质稀薄，背景干净， 且染色体也较分散，更有利于细胞的核型分析。结合中期细胞的数量和细胞形态 可判断，茎尖可作为最佳的取材部位，辣木全年生长，新枝茎尖多，取材方便。
表1不同取材部位对中期细胞比率和形态的影响
实施例2
不同预处理方法对染色体制片效果的影响。
于晴朗的上午9：00-11:00采集健康辣木的新枝茎尖，采用以下预处理方法 (表2)，进行预处理梯度实验。清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸 ＝3∶1)，固定24h,70％乙醇4℃冰箱保存备用。按照酶解去壁低渗法通过固定、 前低渗、酶解、后低渗、后固定和涂片制备染色体标本，再用吉姆萨染色，用 POTIKA正立显微镜观察，Optika Visionpro拍照系统拍照。试验结果如表3。
表2茎尖预处理方法
6种不同预处理方法对辣木茎尖处理的结果(表3)表明，不同预处理方法 对中期细胞数目及染色体分散效果及清晰度都有一定的影响。饱和对二氯苯比 8-羟基喹啉所得的中期细胞比率要高，饱和对二氯苯处理处理2h的中期细胞比 率为24.5％，明显高于其他处理组。其相对应的处理效果也最好(表3，图1)， 染色体分散，聚缩，形态清晰，可见溢痕，很适合染色体核型分析。其次是8- 羟基喹啉预处理2.5h，染色体分散，聚缩，形态清晰。而饱和对二氯苯处理1.5 h，3h和8-羟基喹啉处理2h，3h，效果均不理想，染色体形态较模糊，不利 于核型分析。
表3不同预处理方法对辣木染色体的影响
实施例3
不同酶解时间对染色体制片效果的影响
于晴朗的上午9：00-11:00采集健康辣木的新枝茎尖，饱和对二甲苯预处2h 后，清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)，固定24h,70％乙醇 4℃冰箱保存备用。按照酶解去壁低渗法通过固定、前低渗、酶解、后低渗、后 固定和涂片制备染色体标本，其中对酶解时间做梯度实验，分别酶解2h,3h,4 h,5h。再用吉姆萨染色，用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照 系统拍照。试验结果如表4。
从不同酶解时间对制片效果的影响(表4)可知，酶解时间对辣木中期细胞 的比率影响不大，但对染色体分散效果及清晰度影响较大，特别是细胞背景的干 净程度。最适合的酶解时间是4h，此时细胞背景干净，染色体分散性良好，形 态清晰，最适合核型分析。酶解2h,3h的细胞背景和染色体形态不够理想； 酶解5h细胞极易破裂，造成染色体丢失。
表4不同酶解时间对制片效果的影响
实施例4
辣木的核型分析
于晴朗的上午9：00-11:00采集健康辣木的新枝茎尖，饱和对二甲苯预处2 h后，清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)，固定24h,70％ 乙醇4℃冰箱保存备用。按照酶解去壁低渗法通过固定、前低渗、酶解、后低渗、 后固定和涂片制备染色体标本。再用吉姆萨染色，用POTIKA正立显微镜观察， Optika Vision pro拍照系统拍照。
臂比(r)＝长臂(S)/短臂(L)
染色体相对长度(％)＝染色体长度/染色体组总度×100％
平均长度核型不对称系数(As.k，％)＝长臂总长/全组染色体总长× 100％。
辣木核型分析参数(表5)和染色体核型图(图1)分析结果表明：辣木染色 体没有随体，染色体绝对总长为22.9μm，绝对长度范围1.098～3.3μm，属于小型 染色体。染色体相对长度为3.96～14.35，相对长度组成为 2n＝28＝8L+2M2+6M1+12S；臂比值为1.27～1.66，且所有染色体为中部着丝粒染 色体(m)，其核型公式为2x＝2n＝28＝28m，核型类型属于1B型，核型不对称系 数为60.29％。
表5辣木染色体核型参数
实施例5
一种基于茎尖的辣木染色体核型分析方法，具体步骤如下：
S1:取材
在晴朗的上午9：00-11:00采集健康、快速生长期的辣木新枝茎尖0.5-1cm；
S2：预处理
把刚采集的茎尖迅速投入对二氯苯溶液中预处理2h；
S3:固定与保存
倒掉预处理液，清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)， 在黑暗4℃环境下固定24h，移弃固定液，直接用来染色体制片，若需保存，把 固定过的茎尖依次在75％，90％，95％乙醇溶液各脱水3min，最后保存在75％乙 醇中保存备用，
S4:染色体标本制备
(1)前低渗:把S3固定的茎尖置于蒸馏水中进行前低渗30min，
(2)酶解:把步骤(1)的茎尖置于盛有5％纤维素酶和4％果胶酶混合液的1ml 离心管中，并置于37℃的恒温水浴锅中酶解4h；
(3)后低渗:吸取酶液，缓缓地沿着管壁加入蒸馏水，后低渗30min；
(4)后固定:吸取蒸馏水，滴加临时配制的固定液(3乙醇：1冰醋酸)，后固 定15min；
(5)涂片
把玻片、固定液均置于冰面上，取一张玻片，先滴3滴固定液，再夹取1-2 个茎尖组织置于玻片上，用解剖针挑取少量顶端组织，并迅速捣碎再均匀涂抹在 载玻片上。再从一端滴加一滴固定液使细胞扩散，接着在火焰上迅速烘烤，自然 风干；
S5:染色
先把甲液PH＝6.8的KH2PO4缓冲液、乙液为PH＝6.8的Na2HPO4缓冲液和吉姆 萨原液按比例22:27:1配制成工作液，再把干燥的制片置于吉姆萨染色液中染色 10-20min，清水冲洗干净，置于烘箱37度烘干；
S6:镜检
用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照，在40X物 镜下对单位视野面积内处于分裂中期的细胞进行计数[i]。选择30个染色体分散 且形态较好的细胞进行染色体数目统计，选取5个染色体形态清晰且无重叠的细 胞用Photoshop图像软件进行核型分析。
Claims (9)
1.一种基于茎尖的辣木染色体核型分析方法，其特征在于：该分析方法具体步骤如下：
S1:取材
在晴朗的上午采集健康、快速生长期的辣木新枝茎尖、小叶或大叶；
S2：预处理
把刚采集的材料进行预处理；
S3:固定与保存
倒掉预处理液，清水冲洗后转入卡诺固定液，在黑暗4℃环境下固定24h，移弃固定液，直接用来染色体制片；
S4:染色体标本制备
(1)前低渗:把S3固定的茎尖置于蒸馏水中进行前低渗30min；
(2)酶解:把步骤(1)的茎尖置于盛有5％纤维素酶和4％果胶酶混合液的1ml离心管中，并置于37℃的恒温水浴锅中酶解3-5h；
(3)后低渗:吸取酶液，缓缓地沿着管壁加入蒸馏水，后低渗30min；
(4)后固定:吸取蒸馏水，滴加临时配制的固定液，后固定15min；
(5)涂片：把玻片、固定液均置于冰面上，取一张玻片，先滴固定液，再夹取茎尖组织置于玻片上，用解剖针挑取少量顶端组织，并迅速捣碎再均匀涂抹在载玻片上，再从一端滴加固定液使细胞扩散，接着在火焰上迅速烘烤，自然风干；
S5:染色
将缓冲液(甲液、乙液)与吉姆萨原液按比例配制成工作液，再把干燥的制片置于吉姆萨染色液中染色10-20min，清水冲洗干净，置烘箱37℃烘干；
S6:镜检
用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照，在40X物镜下对单位视野面积内处于分裂中期的细胞进行计数，选择30个染色体分散且形态较好的细胞进行染色体数目统计，选取5个染色体形态清晰且无重叠的细胞用Photoshop图像软件进行核型分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1所述的新枝茎尖最佳，长度为0.5-1cm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2所述的预处理为：8-羟基喹啉液处理2-3h或对二氯苯液处理1.5-2.5h，最佳预处理为对二氯苯液处理2h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4所述的染色体制片方法采用酶解去壁低渗法。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4所述的酶解采用纤维素酶和果胶酶酶解的最佳时间为4h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5所述的采用吉姆萨染色的最佳时间为15min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S3所述的卡诺固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4所述的固定液为乙醇：冰醋酸＝3∶1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5所述的甲液为PH＝6.8的KH2PO4缓冲液、乙液为PH＝6.8的Na2HPO4缓冲液，甲液：乙液：吉姆萨原液的比例为22:27:1。
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