CN103529037B - 一种黄连木植株性别鉴定方法 - Google Patents
一种黄连木植株性别鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种黄连木植株性别鉴定方法，步骤包括：利用黄连木植株分生组织进行染色体制片并染色标记，获得黄连木植株的核型，通过观察雌雄植株核型的差异，实现性别鉴定，解决了黄连木开花结果前没有稳定有效的性别鉴定方法的问题。本发明的重要应用前景是通过对黄连木不同性别植株的鉴定，特别是苗期雌雄鉴定，实现黄连木植株性别比例的调节，对培育性别比例合理的高产黄连木能源林、大幅提高黄连木的单位面积产量具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体是指一种黄连木植株的性别鉴定方法。
背景技术
黄连木（PistaciachinensisBunge)是一种重要的多年生木本油料植物，分布范围广，可在荒山荒地等边际性土地上种植，适宜大面积造林，而且种子含油率高达40%以上。黄连木种子油脂是生物柴油的优质原料，被认为是未来生态能源林建设和生物质柴油产业优先发展树种，因此提高黄连木产量对解决我国生物能源原料供应不足以及成本高等问题具有重要的意义。由于黄连木发展前景看好，目前针对黄连木的研究越来越多，但基本集中在资源调查、育苗、病虫害防治、栽培技术等宏观方面的研究，有关遗传基础、丰产技术等方面的研究较少。
黄连木为雌雄异株植物，天然次生林中的雌雄株的比例大约为1:1，而10%左右的雄株即可以保证充足的花粉供应，因而天然次生林中雄株过剩，能结果的雌株比例低，同时黄连木童期长，8～12年才能开花结果，而在开花结果前没有有效的雌雄株的鉴定方法，导致黄连木单位面积产量低。因而研究黄连木稳定实用的性别鉴定技术，特别是苗期雌雄鉴定技术，对于培育性别比例合理的高产黄连木能源林、大幅提高黄连木的单位面积产量具有重要意义。
发明内容
本发明是针对现有技术中的不足，提供一种黄连木植株性别鉴定的技术。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种黄连木植株性别鉴定方法，包括以下步骤：
（1）取黄连木植株分生组织进行染色体制片；
（2）对上述制片进行染色标记处理，镜检并采集图像；
（3）依据染色体特征利用染色体图像分析系统对上述采集图像中的染色体进行排序和编号，构建核型；
（4）观察雌雄植株染色体核型差异，实现性别鉴定，其中，由15对形状特征一致的染色体组成的染色体核型为雌株核型，由14对形状特征一致的常染色体和1对形状特征有差异的异型同源染色体组成的染色体核型为雄株核型。
所述步骤（1）的染色体制片，包括以下步骤：
1）、取黄连木植株分生组织在卡诺氏固定液中固定1～3天，然后移至体积分数为50～80%的酒精中保存备用，卡诺氏固定液为体积比为3：1的无水乙醇与冰醋酸的混合液；
2）、用镊子取小块组织，放在载玻片上，滴上一滴体积分数为30～60%的醋酸，盖上盖玻片，用解剖针轻压，使材料分散成一薄层，酒精灯火焰上烘烤，用拇指压平盖玻片；
3）、放置相差显微镜下观察，选择染色体清晰，数量完整，分散均匀，无断裂重叠现象的制片于-80℃冰箱中储存，冷冻12h以上备用。
所述步骤（1）的分生组织选自根尖、芽尖和花序分生组织中的一种。
所述步骤（2）的染色标记处理为吉姆萨（Giemsa）染色，包括以下步骤：
a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后，用100%酒精浸泡过夜，再用0.1～0.3M的HCl在40～70℃水浴中浸泡2～5分钟；
b、放在装有蒸馏水的染色缸中，流水中冲洗3～5次；
c、将制片转移至装有Ba(OH)2饱和液的染色缸中，30～40℃温箱中温浴3～20分钟，自来水冲洗1～5次；
d、再转移至2×SSC缓冲液的染色缸中浸泡10～60min，自来水冲洗1～5次；
e、用吉姆萨染色液染色30～60min，加盖玻片，镜检并采集图像。
所述步骤（2）的染色标记处理为DAPI（4，6-二脒基-2-苯基吲哚）染色，包括以下步骤：
a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后用体积分数为30～60%的醋酸溶液冲洗制片；
b、依次转移至体积分数为70%、95%、100%的酒精中梯度脱水，各1～10min，晾干；
c、加300～500ul的100ug/ml的DAPI染色液，染色2～5min；
d、DAPI缓冲液冲洗，晾干，加盖玻片，荧光显微镜下镜检并采集图像，其中，所述DAPI缓冲液为体积比为8：5的0.1mol/L柠檬酸溶液与0.1mol/L磷酸氢二钠溶液的混合液。
所述步骤（3）的染色体特征包括染色体的长度、着丝点位置、臂比和有无随体。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种黄连木植株性别鉴定方法，所述方法是利用雌雄植株核型差异进行性别鉴定，由于材料选自分生组织，因此在植株生长各个时期均可实现鉴定，解决了黄连木开花结果前没有稳定有效的性别鉴定问题。通过对黄连木植株性别的鉴定，可以按需要繁育和种植黄连木不同性别的植株，因而在品种等其他因素不变的情况下，使得黄连木能源林单位面积产量大幅提高。
附图说明
图1是雄株根尖细胞染色体吉姆萨染色核型图；
图2是雄株根尖细胞染色体DAPI染色核型图；
图3是雌株根尖细胞染色体吉姆萨染色核型图；
图4是雌株根尖细胞染色体DAPI染色核型图。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明做进一步详细说明，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明技术构思以及内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
实施例1
1、染色体制片：
1）、将根尖组织在卡诺氏固定液中固定2天，然后移至体积分数为75%酒精中保存备用；
2）、用镊子取小块组织，放在载玻片上，滴上一小滴体积分数为50%醋酸，盖上盖玻片，用解剖针轻压，使材料分散成一薄层，酒精灯火焰上烘烤，用拇指压平盖玻片；
3）、放置相差显微镜下观察，选择染色体清晰，数量完整，分散均匀，无断裂重叠现象的制片于-80℃冰箱中储存，冷冻12h以上备用。
2、吉姆萨染色：
a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片，用100%酒精浸泡过夜后用0.2M的HCl在60℃水浴中浸泡3分钟；
b、放在装有蒸馏水的染色缸中，流水中冲洗4次；
c、将制片转移至装有Ba(OH)2饱和液的染色缸中，37℃温箱中温浴10分钟，自来水冲洗4次；
d、再转移至装有2×SSC缓冲液（购于上海生工生物工程公司）的染色缸中浸泡20min，自来水冲洗3次；
e、吉姆萨染色液（购于上海科兴生物科技有限公司）中染色40min，加盖玻片，镜检并采集图像。
3、核型分析：
如图1和3所示，依据染色体长度、着丝点位置、臂比和有无随体等特征利用染色体图像分析系统对染色体进行排序和编号，构建核型。其中图1包含14对同型同源染色体和1对异型性染色体（位于右下角的1对染色体），为雄株核型图；图3包含15对同源染色体，为雌株核型图。
实施例2
1、染色体制片：
1）、将根尖组织在卡诺氏固定液中固定1天，然后移至体积分数为50%酒精中保存备用；
2）、用镊子取小块组织，放在载玻片上，滴上一小滴体积分数为30%醋酸，盖上盖玻片，用解剖针轻压，使材料分散成一薄层，酒精灯火焰上烘烤，用拇指压平盖玻片；
3）、放置相差显微镜下观察，选择染色体清晰，数量完整，分散均匀，无断裂重叠现象的制片于-80℃冰箱中储存，冷冻12h以上备用。
2、吉姆萨染色：
a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后，在100%酒精浸泡过夜后用0.1M的HCl在40℃水浴中浸泡2分钟；
b、放在装有蒸馏水的染色缸中，流水中冲洗3次；
c、将制片转移至装有Ba(OH)2饱和液的染色缸中，30℃温箱中温浴3分钟，自来水冲洗1次；
d、再转移至装有2×SSC缓冲液的染色缸中浸泡10min，自来水冲洗1次；
e、吉姆萨染色液中染色30min，加盖玻片，镜检并采集图像。
3、核型分析：
依据染色体长度、着丝点位置、臂比和有无随体等特征利用染色体图像分析系统对染色体进行排序和编号，构建核型；其中，由15对形状特征一致的染色体组成的核型为雌株核型，由14对形状特征一致的常染色体和1对形状特征有差异的异型同源染色体组成的核型为雄株核型。
实施例3
1、染色体制片：
1）、将芽尖组织在卡诺氏固定液中固定3天，然后移至体积分数为80%酒精中保存备用；
2）、用镊子取小块组织，放在载玻片上，滴上一小滴体积分数为60%醋酸，盖上盖玻片，用解剖针轻压，使材料分散成一薄层，酒精灯火焰上烘烤，用拇指压平盖玻片；
3）、放置相差显微镜下观察，选择染色体清晰，数量完整，分散均匀，无断裂重叠现象的制片于-80℃冰箱中储存，冷冻12h以上备用。
2、吉姆萨染色：
a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后，在100%酒精浸泡过夜后用0.3M的HCl在70℃水浴中浸泡5分钟；
b、放在装有蒸馏水的染色缸中，流水中冲洗5次；
c、将制片转移至装有Ba(OH)2饱和液的染色缸中，40℃温箱中温浴20分钟，自来水冲洗5次；
d、再转移至装有2×SSC缓冲液的染色缸中浸泡60min，自来水冲洗5次；
e、吉姆萨染色液中染色30min，加盖玻片，镜检并采集图像。
3、核型分析：
依据染色体长度、着丝点位置、臂比和有无随体等特征利用染色体图像分析系统对染色体进行排序和编号，构建核型；其中，由15对形状特征一致的染色体组成的核型为雌株核型，由14对形状特征一致的常染色体和1对形状特征有差异的异型同源染色体组成的核型为雄株核型。
实施例4
1、染色体制片：
1）、将根尖组织在卡诺氏固定液中固定2天，然后移至体积分数为75%酒精中保存备用；
2）、用镊子取小块组织，放在载玻片上，滴上一小滴体积分数为50%醋酸，盖上盖玻片，用解剖针轻压，使材料分散成一薄层，酒精灯火焰上烘烤，用拇指压平盖玻片；
3）、放置相差显微镜下观察，选择染色体清晰，数量完整，分散均匀，无断裂重叠现象的制片于-80℃冰箱中储存，冷冻12h以上备用。
2、DAPI染色：
a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后用体积分数为40%的醋酸溶液冲洗制片；
b、依次转移至体积分数为70%、95%、100%的酒精中梯度脱水，各6min，晾干；
c、加400ul的100ug/ml的DAPI染色液（购于北京泛博生物化学有限公司），染色3min；
d、DAPI缓冲液冲洗，晾干，加盖玻片，荧光显微镜下镜检并采集图像，其中，所述DAPI缓冲液为体积比为8：5的0.1mol/L柠檬酸溶液与0.1mol/L磷酸氢二钠溶液的混合液。
3、核型分析：
如图2和4所示，依据染色体长度、着丝点位置、随体的有无以及臂比等特征利用染色体图像分析系统对染色体进行排序和编号，构建核型。其中图2包含14对同型同源染色体和1对异型性染色体（位于右下角的1对染色体），为雄株核型图；图4包含15对同源染色体，为雌株核型图。
实施例5
1、染色体制片：
1）、将根尖组织在卡诺氏固定液中固定1天，然后移至体积分数为50%酒精中保存备用；
2）、用镊子取小块组织，放在载玻片上，滴上一小滴体积分数为30%醋酸，盖上盖玻片，用解剖针轻压，使材料分散成一薄层，酒精灯火焰上烘烤，用拇指压平盖玻片；
3）、放置相差显微镜下观察，选择染色体清晰，数量完整，分散均匀，无断裂重叠现象的制片于-80℃冰箱中储存，冷冻12h以上备用。
2、DAPI染色：
a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后用体积分数为30%的醋酸溶液冲洗制片；
b、依次转移至体积分数为70%、95%、100%的酒精中梯度脱水，各1min，晾干；
c、加300ul的100ug/ml的DAPI染色液，染色5min；
d、DAPI缓冲液冲洗，晾干，加盖玻片，荧光显微镜下镜检并采集图像，其中，所述DAPI缓冲液为体积比为8：5的0.1mol/L柠檬酸溶液与0.1mol/L磷酸氢二钠溶液的混合液。
3、核型分析：
依据染色体长度、着丝点位置、臂比和有无随体等特征利用染色体图像分析系统对染色体进行排序和编号，构建核型；其中，由15对形状特征一致的染色体组成的核型为雌株核型，由14对形状特征一致的常染色体和1对形状特征有差异的异型同源染色体组成的核型为雄株核型。
实施例6
1、染色体制片：
1）、将芽尖组织在卡诺氏固定液中固定3天，然后移至体积分数为80%酒精中保存备用；
2）、用镊子取小块组织，放在载玻片上，滴上一小滴体积分数为60%醋酸，盖上盖玻片，用解剖针轻压，使材料分散成一薄层，酒精灯火焰上烘烤，用拇指压平盖玻片；
3）、放置相差显微镜下观察，选择染色体清晰，数量完整，分散均匀，无断裂重叠现象的制片于-80℃冰箱中储存，冷冻12h以上备用。
2、DAPI染色：
a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后用体积分数为60%的醋酸溶液冲洗制片；
b、依次转移至体积分数为70%、95%、100%的酒精中梯度脱水，各10min，晾干；
c、加500ul的100ug/ml的DAPI染色液，染色2min；
d、DAPI缓冲液冲洗，晾干，加盖玻片，荧光显微镜下镜检并采集图像，其中，所述DAPI缓冲液为体积比为8：5的0.1mol/L柠檬酸溶液与0.1mol/L磷酸氢二钠溶液的混合液。
3、核型分析：
依据染色体长度、着丝点位置、臂比和有无随体等特征利用染色体图像分析系统对染色体进行排序和编号，构建核型；其中，由15对形状特征一致的染色体组成的核型为雌株核型，由14对形状特征一致的常染色体和1对形状特征有差异的异型同源染色体组成的核型为雄株核型。
Claims (5)
1.一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取黄连木植株分生组织进行染色体制片，具体为：
1)、取黄连木植株分生组织在卡诺氏固定液中固定1～3天，然后移至体积分数为50～80％的酒精中保存备用，卡诺氏固定液为体积比为3：1的无水乙醇与冰醋酸的混合液；
2)、用镊子取小块组织，放在载玻片上，滴上一滴体积分数为30～60％的醋酸，盖上盖玻片，用解剖针轻压，使材料分散成一薄层，酒精灯火焰上烘烤，用拇指压平盖玻片；
3)、放置相差显微镜下观察，选择染色体清晰，数量完整，分散均匀，无断裂重叠现象的制片于-80℃冰箱中储存，冷冻12h以上备用；
(2)对上述制片进行染色标记处理，镜检并采集图像，所述染色标记处理为吉姆萨染色或DAPI染色；
(3)依据染色体特征利用染色体图像分析系统对上述采集图像中的染色体进行排序和编号，构建获得植株染色体核型；
(4)观察雌雄植株染色体核型差异，实现性别鉴定，其中，由15对形状特征一致的染色体组成的染色体核型为雌株核型，由14对形状特征一致的常染色体和1对形状特征有差异的异型同源染色体组成的染色体核型为雄株核型。
2.根据权利要求1所述的一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)的分生组织选自根尖、芽尖和花序分生组织中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤(2)的吉姆萨染色，包括以下步骤：
a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后，用100％酒精浸泡过夜，再用0.1～0.3M的HCl在40～70℃水浴中浸泡2～5分钟；
b、放在装有蒸馏水的染色缸中，流水中冲洗3～5次；
c、将制片转移至装有Ba(OH)2饱和液的染色缸中，30～40℃温箱中温浴3～20分钟，自来水冲洗1～5次；
d、再转移至2×SSC缓冲液的染色缸中浸泡10～60min，自来水冲洗1～5次；
e、用吉姆萨染色液染色30～60min，加盖玻片，镜检并采集图像。
4.根据权利要求1所述的一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤(2)的DAPI染色，包括以下步骤：
a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后用体积分数为30～60％的醋酸溶液冲洗制片；
b、依次转移至体积分数为70％、95％、100％的酒精中梯度脱水，各1～10min，晾干；
c、加300～500ul的100ug/ml的DAPI染色液，染色2～5min；
d、DAPI缓冲液冲洗，晾干，加盖玻片，荧光显微镜下镜检并采集图像，其中，所述DAPI缓冲液为体积比为8：5的0.1mol/L柠檬酸溶液与0.1mol/L磷酸氢二钠溶液的混合液。
5.根据权利要求1所述的一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤(3)的染色体特征包括染色体的长度、着丝点位置、臂比和有无随体。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160316 Termination date: 20201009 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |