CN106818482A

CN106818482A - 一种杂交狼尾草微体繁殖的方法

Info

Publication number: CN106818482A
Application number: CN201710060993.5A
Authority: CN
Inventors: 李燕忠; 陈娟
Original assignee: Xiamen City Wei Ying Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Xiamen City Wei Ying Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2017-01-25
Publication date: 2017-06-13

Abstract

一种杂交狼尾草微体繁殖的方法，涉及狼尾草。提供可以获得大量的狼尾草愈伤组织及悬浮细胞，有助于狼尾草资源的充分开发和利用，并且有利于狼尾草悬浮细胞大规模工业化生产的一种杂交狼尾草微体繁殖的方法。1)对选用的狼尾草幼嫩叶片进行预处理；2)将预处理后的狼尾草幼嫩叶片切成小块，接种在愈伤组织诱导培养基的培养基中进行愈伤组织诱导培养；3)将步骤2)诱导培养出的愈伤组织接入WPM培养基上进行愈伤组织增殖培养，获得无异变之芽体，挑选嫩绿松散的愈伤组织接入到发根培养基改良，采用旋转通气式培养，即完成杂交狼尾草微体繁殖。

Description

一种杂交狼尾草微体繁殖的方法

技术领域

本发明涉及狼尾草，尤其是涉及一种杂交狼尾草微体繁殖的方法。

背景技术

杂交狼尾草是温带、亚热带种间杂交植物。是以美洲狼尾草Pennisetumamericanum(L.)Leeke雄性不育系Tift 23A基因做父本和非洲象草(P.purpureum Schu-mach.)N51基因做母本的杂交种。1996年由全国著名的中国农业大学的植保专家刘介卿教授从国外率先引入北纬40°以北种植，为北方牧区规模化开辟新的饲料供应做试探性研究，经种间杂交、组培繁育，抗性研究和生物技术改良，在多个区域试验和抗病虫害试验观察均表现良好。实验表明，杂交狼尾草与同类植物比较具有生长最快、分蘖最多、产量高、抗病虫强、根系发达、营养丰富、管理粗放、用途广泛、适应全面、光合效能好等显著特点。匡崇义等(匡崇义、奎嘉祥，东非狼尾草的引种应用研究，四川草原，2001(2)：9-12)指出东非狼尾草(Pennisetum clandestinum Hochst.ex Chiov)又名隐花狼尾草，英文名为“Kikuyugrass”，原产于东非。云南省通过中澳技术合作项目于1984年从澳大利亚引入威提特等品种；经在不同气候带种植观测，品种威提特在云南的广大亚热带和暖温带表现优良，通过种子自然繁殖和人工无性繁殖，现已在一定区域成为分布较广的单优群落。该草具有高消化率、高蛋白质、低纤维、适口性好、对氮肥反应敏感、耐重牧、耐干旱、竞争力强等优良特性，也是优良的水土保持植物和草坪等。通过种子繁殖和无性繁殖的成本比较，采用种子繁殖是较好经济的推广措施；在云南，威提特东非狼尾草的种子成熟较好，由于种子成熟被包子叶鞘中，收籽比较困难，限制了该草的大面积推广利用。因种子进口价格昂贵，故应加强“威提特东非狼尾草种子收种技术的研究”。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供可以获得大量的狼尾草愈伤组织及悬浮细胞，有助于狼尾草资源的充分开发和利用，并且有利于狼尾草悬浮细胞大规模工业化生产的一种杂交狼尾草微体繁殖的方法。

本发明的具体步骤如下：

1)对选用的狼尾草幼嫩叶片进行预处理；

2)将预处理后的狼尾草幼嫩叶片切成小块，接种在愈伤组织诱导培养基的培养基中进行愈伤组织诱导培养；

3)将步骤2)诱导培养出的愈伤组织接入WPM培养基上进行愈伤组织增殖培养，获得无异变之芽体，挑选嫩绿松散的愈伤组织接入到发根培养基改良，采用旋转通气式培养，即完成杂交狼尾草微体繁殖。

在步骤1)中，所述预处理可用漂白粉浸泡3min，再用水冲洗20min后，在超净工作台上用70％的乙醇消毒20s，再用0.1％的升汞消毒10min后，用无菌水冲洗5～6次。

在步骤2)中，所述小块可采用(0.8～1)cm×(0.8～1)cm小块；所述接种在愈伤组织诱导培养基的培养基中进行愈伤组织诱导可每瓶接种3块；所述培养基的组成可为洋菜8～10g/L、BA 0.3～0.8mg/L、IBA 0.1～0.4mg/L、活性炭1～2g/L、蔗糖50～60g/L，琼脂0.5％～0.65％；所述愈伤组织诱导培养的条件可为光照12001x，光期14，暗期10h，温度22±2℃，湿度70％。

在步骤3)中，所述WPM培养基的组成可为BA 0.3～0.8mg/L、IBA 0.1～0.4mg/L、活性炭1g/L；所述发根培育基可采用添加NAA 0.8～1.0mg/L的1/2WPM培养基；所述发根培养基改良3周后，发根率可达98.97％。

采用本发明杂交狼尾草微体繁殖的杂交狼尾草制备的狼尾草悬浮细胞，生长速度快，能耗小，污染小，可以短期内获得大量的次生代谢产物。

本发明可以获得大量的狼尾草愈伤组织及悬浮细胞，有助于狼尾草资源的充分开发和利用，并且有利于狼尾草悬浮细胞的大规模工业化生产。

具体实施方式

实施例1

1)配制培养基

①用于配制培养基的水最好是三蒸水。

②所用的各种化学药品：分析纯级别的试剂，避免药品的交叉污染和混杂。

③配制培养基最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液，存放在2～4℃冰箱内，使用时按比例稀释配用即可。

培养基的组成为洋菜8～10g/L、BA 0.3～0.8mg/L、IBA 0.1～0.4mg/L、活性炭1～2g/L、蔗糖，琼脂0.5％～0.65％，pH值为5.8，所述蔗糖的含量按质量百分比为培养基总量的3％～5％。

3)灭菌放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，1.1kg·cm^-2，121℃保持15～20min即可。为保证灭菌彻底，在增压前应先将灭菌锅内的冷空气排尽，当灭菌完成后，应切断热源，待锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，将余气放尽，再打开灭菌锅。

4)培养基的存放经高压灭菌的培养基凝固后，放在培养室中预培养3～5天。

实施例2

取培育4周以上外观健康的植株，切取适当的部位作为培植体，每次试验各种浓度5瓶，每瓶有5个培植体，每试验进行3重复，胚芽培养于WPM培养基中，培养过程每周计算培植体之发根率。

WPM培养基的组成为BA 0.3～0.8mg/L、IBA 0.1～0.4mg/L、活性炭1g/L，获得无异变之芽体，发根培育基为添加NAA 0.8～1.0mg/L的1/2WPM培养基，3周后，发根率为98.97％。

以下给出从杂交狼尾草切取长约0.3～1cm含顶芽之茎节为培植体，培育于下列培养基的实施例。

(1)1/2WPM培养基。

(2)添加NAA 0.1～0.2mg/L之1/2WPM培养基。

(3)添加NAA 0.3～0.5mg/L之1/2WPM培养基。

(4)添加NAA 0.8～1.0mg/L之1/2WPM培养基。

(5)添加NAA 1.6～2.0mg/L之1/2WPM培养基。

在培养温度为22±2℃，光周期为14h光照、10h黑暗条件下，1号发芽率为45.22％，2号发芽率为67.31％，3号发芽率为85.54％，4号发芽率为95.32％，5号发芽率为98.87％。从以上分析结果表明，本发明可解决目前杂交狼尾草一致性大量繁殖中存在的问题。

Claims

1.一种杂交狼尾草微体繁殖的方法，其特征在于其具体步骤如下：

1)对选用的狼尾草幼嫩叶片进行预处理；

2.如权利要求1所述一种杂交狼尾草微体繁殖的方法，其特征在于在步骤1)中，所述预处理是用漂白粉浸泡3min，再用水冲洗20min后，在超净工作台上用70％的乙醇消毒20s，再用0.1％的升汞消毒10min后，用无菌水冲洗5～6次。

3.如权利要求1所述一种杂交狼尾草微体繁殖的方法，其特征在于在步骤2)中，所述小块采用(0.8～1)cm×(0.8～1)cm小块。

4.如权利要求1所述一种杂交狼尾草微体繁殖的方法，其特征在于在步骤2)中，所述接种在愈伤组织诱导培养基的培养基中进行愈伤组织诱导是每瓶接种3块。

5.如权利要求1所述一种杂交狼尾草微体繁殖的方法，其特征在于在步骤2)中，所述培养基的组成为洋菜8～10g/L、BA 0.3～0.8mg/L、IBA 0.1～0.4mg/L、活性炭1～2g/L、蔗糖50～60g/L，琼脂0.5％～0.65％。

6.如权利要求1所述一种杂交狼尾草微体繁殖的方法，其特征在于在步骤2)中，所述愈伤组织诱导培养的条件为光照12001x，光期14，暗期10h，温度22±2℃，湿度70％。

7.如权利要求1所述一种杂交狼尾草微体繁殖的方法，其特征在于在步骤3)中，所述WPM培养基的组成为BA 0.3～0.8mg/L、IBA 0.1～0.4mg/L、活性炭1g/L。

8.如权利要求1所述一种杂交狼尾草微体繁殖的方法，其特征在于在步骤3)中，所述发根培育基采用添加NAA 0.8～1.0mg/L的1/2WPM培养基。