CN109609433B - 从分离和培养生长细胞获得植物纤维的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从植物标本的木质组织分生组织细胞获得植物纤维的方法。该方法意味着从木质组织中鉴定和分离分生组织形成的细胞，它们的后期培养和增殖以及纤维样结构的诱导，以便最终产生纤维。本发明的方法令人惊讶地允许人们通过分离的木质组织形成细胞在实验室条件下获得植物纤维，从而提供从植物生产纤维的替代方案。

Description

从分离和培养生长细胞获得植物纤维的方法

发明领域

本发明涉及生物技术方法，特别是植物木质组织形成细胞的体外繁殖及其转化为工业上感兴趣的产物。具体地，本发明涉及植物木质部组织分生组织细胞的分离和培养以及随后从培养细胞中获得纤维。

背景技术

造纸行业是环境影响最大的行业之一，因为其过程的所有阶段都具有潜在危害。第一个环境影响始于原材料的连续性。随着纸张消耗的增加，需要更大量的树木来获得纸浆，这在许多情况下是在单一栽培中生产的，这通常会降低土壤的生产率。造纸业的另一个树木来源是天然林，这意味着森林砍伐和生态系统的干扰，大大减少了对温室效应气体的自然控制。

这些问题的替代方案可以是植物细胞的体外培养和可以满足造纸工业和与纤维素产品相关的工业的需要的纤维的实验室生产。这将避免森林砍伐问题，并部分减少用于将原木组织转变成纸浆的处理所产生的污染。同样，无论外部环境和气候因素如何，它都将有助于纤维的生产。

然而，到目前为止，在已建立的文献中没有关于培养植物木质组织分生组织细胞或从所述细胞产生纤维的方法的报导。开发这种技术的第一个限制是找到适当的培养细胞，这些细胞能够转化为纤维。

Ogita，S¹等公开了一种培养方法，该方法允许维持悬浮的植物细胞以研究木质化过程，特别是在竹子中。同样，Kumar²等人从来自印度黄檀(Dalbergiasissoo)树的悬浮细胞的再生幼苗。结果表明获得的枝条是分化的。

同样，文献US8,24,230显示了分离和获得衍生自可以分裂自身的形成层的同源细胞系的方法。这些细胞来自含有来自草本植物的形成层的组织，特别是草本植物的贮藏根。

然而，现有技术不包括关于木质标本细胞培养的任何报告，甚至不包括培养成纤维的这些细胞的转化。

除此之外，对纤维的体外发育的重要限制是缺乏与纤维形成的生物学相关的知识。纤维是属于韧皮部和木质部的单个细胞，具有扩大的形状，具有致密的木质化的次生细胞壁，并且具有由于每个细胞的每个边缘的末端处的弯曲(膝盖)而产生的尖锐或尖锐的边缘。在分化的第一阶段中鉴定纤维是困难的并且取决于它们在植物器官中的发育程度和特征，以及其它独特特征的存在，例如典型的原形成层细胞(pro-cambial)和形成层细胞(cambial cells)的纵向形式和那些直径的宽度。

同样地，现有技术尚未包括纤维过早发育的生物化学，遗传或分子标记的报告，因为在其起始过程中难以看到和获得纤维，因为当它们在早熟分化阶段仍被观察到时，指定光纤的蜂窝目的地的小区因子可能已经结束了它们的活动。

因此，在现有技术中需要一种从植物细胞中获得纤维的方法，鉴定待培养，增殖的适当细胞，并且随后允许获得可用于不同工业的纤维，例如纸张行业。

发明简述

本发明通过提供一种从植物标本的木质组织分生组织细胞(xylematic tissuemeristematic cambial cell)获得纤维的方法，以创新的方式解决了现有技术中的问题。本发明方法包括：

(a)鉴定和分离植物分生组织细胞；

(b)繁殖分离的分生组织细胞；

(c)从栽培的分生组织细胞诱导产生纤维样结构；

(d)从纤维状结构生产纤维。

以有利的方式，本发明的方法允许通过生物技术方法获得体外纤维，从这些细胞中诱导纤维状结构(在该描述性备忘录中将其命名为“原纤维”)，最后，获得具有工业应用的纤维。

本发明还涉及从植物物种的木质部组织中鉴定和分离分生组织细胞的方法，其包括用一种或多种染色试剂染色植物材料并在不同植物高度进行切向切割，通过显微镜鉴定感兴趣的细胞和获得外植体，将其引入包含酶的培养基中。

本发明的另一个目的是一种增殖植物木质部组织的分生组织细胞的方法，该细胞将细胞保持在适合其后续分化的条件下。这种倍增分生细胞的方法包括将这些分离的分生组织细胞悬浮在培养基中，产生稳定的悬浮液并将悬浮液在新鲜培养基中继代培养。

本发明还涉及从培养的木质部组织的培养的分生组织细胞获得纤维样结构的方法，该方法包括将木质部组织的分生组织细胞悬浮在第一培养基中，随后在第二培养基中悬浮，在悬浮液中维持第一诱导期，随后分离细胞，最后加入第二培养基并在搅拌下维持悬浮液第二诱导期。

同样地，本发明的方法还包括分生组织形成细胞和纤维样结构(原纤维)的转录组学分析。

附图说明

图1显示了在茎顶部下方4mm处没有污渍的切口。A：横截面100X。B：切向纵向切割100X。

图2显示A的切向切口：用粉红色苯胺染色的木质部和B：用蓝色苯胺40X染色的木质部。

图3显示了用辅助木质素NBT标记物染色的茎尖下方的切口。A：横截面为100X。B：切向切割为100X。

图4显示了细胞可行性的观察结果。A：明确的领域。B：荧光滤光片。

图5对应于A：衍生自木质形成层的分生组织细胞：圆形，带芯和空泡形，透明黄色，在透明视野中观察到40X。B：源自血管形成层的分生组织细胞显示出FDA的可行性，40X。

图6显示了源自血管木质形成层的分生组织细胞。A：在DIC 40X中观察到的细胞。B：在偏振光下观察到的细胞40X。C-D：用钙荧光白(Calcoflour)染色的细胞并显示细胞分化的过早开始以产生“原纤维(Protofiber)”40X。

图7显示了来自血管形成层的分生细胞形成纤维的开始。A：明确的领域。B：DIC。C：偏光40X.

图8显示了起始纤维样结构的过程，“原纤维”起源于衍生自木质维管形成层的分生细胞。A：隔膜原纤维具有明确的腔室，至少有4个核心(在圆圈中突出显示)，从经历细胞扩增的分生细胞中出现。B：活跃且可行的FDA原纤维40X.

图9显示了以共生形式生长的原纤维。A：用钙荧光白染色显示纤维素的存在。B：DIC。C：偏光。在后者中，可以观察到高度折射的边缘，表明存在结晶纤维素，并且可能是肌原纤维的再次调节以进行侵入性生长，40X。

图10显示了具有共同生长的原纤维，边缘处开始放大。A：DIC。B：偏光40X。

图11显示了启动侵入式增长过程的原纤维。A：扩大的原纤维，墙壁经历外部增厚过程。B：扩大的原纤维在两个边缘显示出侵入性生长的开始，40X。

图12显示了原始纤维经历细胞壁的侵入和增厚，可能是在二次木质素壁沉积过程中，DIC为100X。

图13显示了原纤维培养基的差速离心。

图14显示了在温室条件下培养巨桉。

图15显示了根据本发明方法的巨桉染色的实例。

具体实施方式

本发明涉及一种从木质部分生细胞膜细胞中获得植物纤维的方法，包括以下步骤：

(a)从木质部中鉴定和分离植物分生组织细胞；

(b)增值从木质部分离的分生组织细胞；

(c)从木质部培养的分生组织细胞诱导纤维样细胞(原纤维)的产生；

(d)从纤维状细胞(原纤维)生产纤维。

因此，本发明的方法允许在实验室条件下从分离的木质部分生组织细胞获得纤维，所述纤维可用于需要纤维状纤维素原料的工业，例如造纸工业。

在本发明的一个优选实施方案中，该方法的步骤(a)通过细胞的选择性染色发生植物纤维。这种染色允许木质部分生组织细胞的精确和特异性定位，适合于增殖和它们在纤维样结构中的分化，“原纤维”。染色后，通过组织切割分离细胞，所述组织切割位于植物的适当的分生组织细胞所在的部分。

一旦切割完成，将细胞从含有它们的组织中分离，然后根据步骤(b)在体外条件下将其带到第一培养基中进行增殖。

优选地，该第一培养基包含常量营养素，微量营养素，维生素，抗氧化剂和植物激素。在本发明的一个优选实施方案中，作为该第一培养基一部分的植物激素选自类似于生长素，细胞因子，赤霉素，乙烯，茉莉酸及其混合物的化合物。

根据本发明的一个实施方案，本发明的第一培养基的常量营养素包含氮，钙，镁，钾和磷。同样，优选微量营养素包括硼，钴，铜，铁，锰，钾，钼和锌。优选地，维生素包含B复合物，多元醇和氨基酸。

根据本发明的方法，在步骤(b)的分生细胞增殖后，按照步骤(c)诱导原纤维的产生，其中诱导在第二培养基中进行。

优选地，本发明的该步骤(c)在第二培养基中制备，所述第二培养基包含常量营养素，微量营养素，维生素，抗氧化剂和植物激素。

根据本发明的一个实施方案，本发明的第二培养基的常量营养素包含氮，钙，镁，钾和磷。同样，优选微量营养素包括硼，钴，铜，铁，锰，钾，钼和锌。优选地，维生素包含B复合物，多元醇和氨基酸。

优选地，第二培养基的植物激素不同于步骤(b)的第一培养基中包含的植物激素。在优选的实施方案中，第二培养基包含选自下组的植物激素：生长素，细胞因子，赤霉素，油菜素类固醇，乙烯及其混合物。

之后，根据本发明，步骤(c)的原纤维通过培养原纤维并诱导它们的木质化转化成适当的植物纤维，用于后来的细胞凋亡，从而产生真正的木质部纤维。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(b)和(c)分两个阶段进行，第一阶段在受体中进行搅拌，第二阶段在泡罩柱型生物反应器中进行。

在本发明的另一个目的中，公开了一种用于鉴定和分离木质组织分生组织细胞的新方法，其特征在于它包括以下步骤：

(i)从植物材料中取出茎的顶端片段并将它们浸没在第一染色试剂的溶液中；

(ii)在植物的不同高度进行切向切割；

(iii)在显微镜下鉴定染色的细胞并鉴定木质组织的组分；

(iv)从植物材料中取出茎的顶端片段并将它们浸没在第二染色试剂的溶液中；

(v)在植物的不同高度进行横截面切向切割；

(vi)在显微镜下分析染色的细胞并鉴定感兴趣的木质分生组织(xylematicmeristematic cambial)细胞所在的高度；

(vii)在已确定感兴趣的木质分生组织(xylematic meristematic cambial)细胞的高度处对植物材料的细段进行新的切向切割；

(viii)在含有酶的液体培养基中引入外植体；和

(ix)验证游离细胞的存在。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(i)的第一染色试剂是活体染色试剂。根据本发明方法的另一个优选实施方案，该活体染色试剂选自粉红色苯胺和蓝色苯胺。

类似地，在本发明的一个优选实施方案中，步骤(i)的染色过程进行两次，一次用粉红色苯胺，另一次用蓝色苯胺。

如图1所示，在植物标本的茎顶下方没有污渍的切口允许区分存在的不同类型的细胞，但不能区分能够分化成原纤维的分生细胞。

根据本发明的一个目的，步骤(i)的染色，包括苯胺粉末和苯胺蓝，允许鉴定木质部细胞(图2)。因此，鉴定了遭受细胞凋亡并且不易增殖的细胞。

之后，根据本发明的方法，在步骤(iv)中进行第二次染色，从而允许确定适合培养的木质分生组织细胞。根据本发明的优选实施方案，第二染色试剂是化学标记物。

在本发明方法的一个优选实施方案中，步骤(iv)的化学标记物允许木质素的合成。在本发明的一个实施方案中，木质素标记物是硝基四唑蓝(NBT)。

如图3所示，根据本发明优选实施方案，在步骤(iv)之后，根据步骤(v)，在不同的植物高度进行横向和切向横截面，并且通过显微镜分析这些横截面和切向横截面，步骤(vi)，其中鉴定分生组织的细胞。在图3中，可以注意到根据本发明方法染色的分生组织细胞如何在内部呈现蓝色染色。

一旦鉴定了这些细胞，根据本发明方法的步骤(vii)，在显微镜下鉴定感兴趣的目的细胞时，制备植物材料的薄片段的切向切割，获得外植体。根据本发明的优选实施方案，将如此获得的外植体引入含有酶的培养基中。

优选地，步骤(viii)的液体培养基中包含的酶选自包含果胶酶，纤维素酶，半纤维素和其混合物的组。

在本发明的一个实施方案中，顶端茎的区段是从最接近顶端区域的部分发芽后两个月至一年半之间的植物上切下的。按照本发明方法的步骤(i)将这些片段浸入第一染色试剂的溶液中。根据本发明的优选实施方案，第一染色试剂的浓度为20mg/mL至250mg/mL。

根据该实施方案，将顶端茎段浸没在第一染色试剂的溶液中并使其静置第一段时间。在本发明的一个优选实施方案中，第一段时间为1至6小时，优选2至8小时。

优选地，在步骤(i)的染色之后，步骤(ii)的切割在茎顶部下方1mm至8cm的高度处进行。

另一方面，在本发明的该实施方案中，顶端茎的片段以与步骤(i)类似的方式进行步骤(iv)，并浸没在第二染色试剂的溶液中。优选地，该第二染色试剂的浓度为1mg/mL至10mg/mL。与步骤(i)和(ii)类似，使茎静置第二段时间，其中该第二段持续1至8小时，优选2至5小时，并且步骤(v)的切割在茎尖下方1毫米至8厘米的高度制作。

根据本发明的该实施方案，在鉴定分生细胞可以分化成原纤维的区段中，根据步骤(vii)进行切割，并且在无菌条件下对由此获得的外植体进行消毒和处理，然后在步骤(viii)中引入。在含有酶的液体培养基中。优选地，该酶在该培养基中的浓度为0.01％至1.5％。

优选地，将外植体搅拌第三段时间。优选地，该第三段时间持续4至30天，但优选5至8天。之后，步骤(ix)在无菌条件下执行。如图4所示，在步骤(ix)中，可以验证分离细胞的存在和可行性。

根据本发明的实施例，步骤(viii)和(ix)被实践不止一次。

本发明的另一个目的是增殖分离的分生细胞的方法。本发明的这种方法的特征在于它包括以下步骤：

(i)建立源自血管木质(xylematic)形成层的分生细胞的悬浮液，在液体培养基中游离；

(ii)在干重的细胞中保持2g/L至20g/L之间的稳定悬浮液；和

(iii)进行步骤(iii)的稳定悬浮液的传代培养，在新鲜培养基中加入1g/L至20g/L干重的细胞，并在永久搅拌下维持传代培养。

在本发明的一个优选实施方案中，将衍生自木质组织的维管形成层的分生细胞繁殖的方法，在发光照射下通过发光二极管系统培养。图5显示来源于木质组织的维管形成层的分生细胞，培养和可行，如用荧光素二乙酸酯(FDA)染色所示。

在另一个目的中，本发明显示了从分离和培养的来自血管形成层的分生细胞获得纤维样结构“原纤维”的方法。本发明方法包括：

(i)将分生组织的细胞悬浮于第一培养基中，该培养基包含常量营养素，微量营养素，维生素，抗氧化剂和植物激素；

(ii)从步骤(i)中取出分生组织的细胞并将它们再次悬浮在含有常量营养素，微量营养素，维生素，抗氧化剂和植物激素的第二种培养基中；

(iii)将悬浮液搅拌第一诱导期；

(iv)将细胞与培养基分离并再次加入第二种新鲜培养基；

(v)将悬浮液搅拌第二诱导期；其中第二培养基包含不同于第一培养基的植物激素。

在本发明的一个实施方案中，获得本发明的原纤维的方法分两步进行，第一步在受体中进行搅拌，第二步在泡罩塔生物反应器中进行。

根据本发明的一个实施方案，本发明的第一培养基的常量营养素包含氮，钙，镁，钾和磷。同样，优选微量营养素包括硼，钴，铜，铁，锰，钾，钼和锌。优选地，维生素包括B-络合物，多元醇和氨基酸。

优选地，包含在第一培养基中的植物激素选自生长素，细胞因子，赤霉素，乙烯，脱落酸及其混合物。

在本发明的一个实施方案中，第二培养基包含常量营养素，包括氮，钙，镁，钾和磷。同样，优选微量营养素包括硼，钴，铜，铁，锰，钾，钼和锌。优选地，维生素包括B-络合物，多元醇和氨基酸。另一方面，所述第二培养基包含植物激素，其选自生长素，赤霉素，细胞因子，脱落酸及其混合物。

根据本发明的一个实施方案，为了从衍生自交换的分生细胞获得原纤维，根据步骤(i)进行这种细胞的悬浮液，干重为3-20g/L，并且证实细胞活力大于或等于75％。

对于本发明该实施方案中的步骤(ii)，将步骤(i)的悬浮液在第二培养基中稀释至1.5至6.5g/L的浓度。

根据步骤(iii)将由此获得的悬浮液在搅拌容器中保持第一诱导期，然后根据步骤(iv)从其中分离并再次悬浮在第二新鲜培养基中以根据步骤(v)重新搅拌。

如上所述，在本发明的一个实施方案中，生产原纤维的方法分两步进行，其中第二步在泡罩柱型生物反应器中进行。在该实施方案中，反应器进料空气流保持在0.25L/min和0.9L/min之间。

图6显示了原纤维中分生组织细胞分化的开始，同样地，图7显示了从木质部分生组织细胞形成这种原始纤维的开始。

另一方面，图8显示已经具有至少四个核(在图中以圆圈标记)的已经隔离的原始纤维，其在细胞扩增过程中从木质部分生组织细胞中出现。

图9显示了以共生形式生长的原纤维，其中可以证明高折射边缘。反过来，图10显示了原纤维如何产生和在共同生长中如何引发其边缘的扩大。

图11显示了原纤维如何在其壁上开始侵入性生长和外部增厚过程，以及在两个边缘开始侵入性生长。类似地，图12显示了细胞壁侵入和增稠的后期过程中的原纤维。

另一方面，根据获得本发明的原纤维的方法，在步骤(iv)和(v)期间进行悬浮液的差速离心以分离从木质部组织的分生组织形成细胞获得的原纤维，但没有区分，这允许原纤维培养基的富集。图13显示了通过本发明的方法获得的原纤维的差速离心的实例。

另一方面，根据本发明，本文公开的方法包括另外的步骤，其中进行分离的分生组织细胞和所获得的原纤维的转录组学分析。该分析通常用已知的RNA提取和测序方案进行。

例子

作为参考植物材料，巨桉(Eucalyptus grandis)(E.grandis)是世界上种植最多的木材之一，其木材的质量和短纤维的存在使其适合作为工业纸张的原料。

在温室条件下培养巨桉种子以获得从其中提取分生组织细胞的幼苗。图14显示了在温室条件下发芽的幼苗。

实施例1：分生细胞的鉴定和分离

在水溶液中制备苯胺粉(约50mg/mL)和苯胺蓝(约90mg/mL)的水溶液，其中收集的大约8cm长的顶端茎段被浸没(图15)。将片段在室温下在溶液中放置3-8小时。随后，在茎尖下方4mm，1cm，2cm和4cm处进行切割，在显微镜下观察。

另一方面，制备硝基四唑蓝(N6876-SIGMA-ALDRICH)的水溶液约3.0-5.0g/L，收集约8cm长的顶端茎段并在在室温下将其在溶液中保持3-8小时。随后，在茎尖下方4mm，1cm，2cm和4cm处进行切割，在显微镜下观察。

在鉴定含有适于分化成原纤维的木质部组织的可交换的分生组织细胞的部分后，获得茎外植体，将其引入无菌水中，随后引入具有培养基的溶液中，所述培养基补充有酶，例如果胶酶，纤维素酶，半纤维素或其混合物，浓度为3-10％。

通过在显微镜下观察分析游离细胞的存在及其存活力。

实施例2：分生(Meristematic)细胞增殖

在无菌条件下在培养基中进行源自木质部组织的血管交换的分生细胞的悬浮液，直至其在约6g/L的干重浓度下保持稳定。

然后在新鲜培养基中接种2至10g/L的该悬浮液的传代培养物。

实施例3：使用发光辐射的分生细胞的增殖

通过发光二极管暴露于垂直辐射的约6g/L的悬浮液以2W/m2至10W/m2的强度进行。进行24小时光照循环。

实施例4：原纤维诱导

将活力百分比大于75％的分离的分生细胞悬浮，以提供干重6至9g/L的浓度。引入原纤维诱导培养基直至获得1.5和4g/L的稀释度。分析细胞活力的百分比，并且悬浮液的浓度保持稳定。

将悬浮液送至轨道振荡器，转速为80-100rpm。随后，取样进行可行性百分比分析，原纤维诱导的浓度和百分比。

Claims (13)

1.一种从植物物种巨桉的木质分生组织细胞中获得纤维的体外方法，其特征在于它包括以下步骤：

(a)鉴定和分离木质分生组织细胞；

其中木质分生组织细胞的分离包括：

从植物材料中取出茎的顶端片段并将它们浸没在第一染色试剂的溶液中；

在植物的不同高度进行切向切割；

在显微镜下鉴定染色细胞并鉴定木质组织的组分；

从植物材料中取出茎的顶端片段并将它们浸没在第二染色试剂的溶液中；

在植物的不同高度进行横截面切向切割；

在显微镜下分析染色的细胞并鉴定目的木质分生组织细胞所处于的高度；

在已确定目的木质分生组织细胞的高度处进行植物材料的细切片的新切向切割以获得外植体；

将外植体导入含有选自果胶酶，纤维素酶，半纤维素酶及其混合物的酶的液体培养基中；和

验证游离细胞的存在；

(b)通过在稳定悬浮液中悬浮分离的木质分生组织细胞并在第一培养基中传代培养，在体外条件下增殖木质分离分生组织细胞；

其中所述第一培养基在悬浮中维持第一诱导期，其包含选自生长素，细胞因子，赤霉素，乙烯，茉莉酸，脱落酸及其混合物的植物激素；

(c)在原纤维诱导培养基中诱导培养的木质分生组织细胞产生纤维样结构；

其中所述原纤维诱导培养基在悬浮中维持第二诱导期，其包含选自生长素，细胞因子，赤霉素，油菜素类固醇，乙烯，脱落酸及其混合物的植物激素；和

(d)从纤维样细胞生产纤维，

其中步骤(a)的分生组织细胞的鉴定是通过两个阶段中细胞的选择性染色进行的。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的纤维样结构的诱导分两步进行，第一步在搅拌容器中进行，第二步在鼓泡塔型生物反应器中进行。

3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的第一染色试剂是活体染色试剂。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述活体染色试剂选自粉红色苯胺和蓝色苯胺。

5.如权利要求4所述的方法，其中步骤(i)在两种染色试剂上进行，一种是粉红色苯胺，另一种是蓝色苯胺。

6.权利要求1所述的方法，其中第二染色试剂是化学标记物。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述化学标记物允许确定木质素合成。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述木质素标记物是硝基四唑(NBT)。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(b)包括：

(i)建立游离的木质分生组织细胞悬浮液至液体培养基；

(ii)在干重的细胞中保持2g/L至15g/L的稳定悬浮液；和

(iii)通过在新鲜培养基中加入1g/L至15g/L干重的细胞并在永久搅拌下保持所述传代培养物进行步骤(iii)的稳定悬浮液的传代培养，

其中所述方法通过发光二极管系统结合所述悬浮液的光照射来执行。

10.如权利要求9所述的方法，其中步骤(i)分两步进行，第一步是搅拌容器，第二步是鼓泡塔型生物反应器。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤(b)和(c)进一步包括：

(i)将木质分生细胞悬浮于包含常量营养素，微量营养素，维生素，抗氧化剂和植物激素的第一培养基中；

(ii)从步骤(i)中取出木质分生细胞并将它们再次悬浮在含有常量营养素，微量营养素，维生素，抗氧化剂和植物激素的第二种培养基中；

(iii)将悬浮液搅拌第一诱导期；

(iv)将细胞与培养基分离并再次加入第二种新鲜培养基；

(v)将悬浮液搅拌至第二诱导期；

其中第二培养基包含不同于第一培养基的植物激素。

12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中另外进行分生组织细胞和纤维样结构的转录组学分析。

13.如权利要求11所述的方法，其中另外进行分生组织细胞和纤维样结构的转录组学分析。