CN113621552A - 一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法 - Google Patents

一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113621552A
CN113621552A CN202110823048.2A CN202110823048A CN113621552A CN 113621552 A CN113621552 A CN 113621552A CN 202110823048 A CN202110823048 A CN 202110823048A CN 113621552 A CN113621552 A CN 113621552A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alfalfa
enzymolysis
protoplast
protoplasts
mannitol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110823048.2A
Other languages
English (en)
Inventor
杨国锋
闫振飞
王增裕
孙娟
马利超
丛丽丽
赵怡然
张永柏
马越
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Agricultural University
Original Assignee
Qingdao Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Agricultural University filed Critical Qingdao Agricultural University
Priority to CN202110823048.2A priority Critical patent/CN113621552A/zh
Publication of CN113621552A publication Critical patent/CN113621552A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体悬浮液制备方法，所述方法，步骤如下：步骤1，紫花苜蓿种子的清洗，取紫花苜蓿种子，经消毒处理，养育4‑5天，长出幼根；步骤2，紫花苜蓿幼根的预处理，将养育好的紫花苜蓿幼根浸泡在CPW溶液，浸泡1‑2个小时；步骤3，酶解，取浸泡后紫花苜蓿幼根加入酶解液进行酶解，酶解时间为4‑8小时；步骤4，分离，酶解液过滤，离心分离得到原生质体。

Description

一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取 方法
技术领域
本发明涉及植物原生质体的提取方法，特别涉及一种紫花苜蓿根部原生质体的提取方法。
背景技术
脱去细胞壁的细胞叫原生质体，植物原生质体常常用于DNA转化，因为细胞壁会阻止DNA进入细胞。除了在DNA和蛋白质转染中使用外，原生质体还用于再生整个植物，原生质体融合制备杂交体，膜片钳实验等。原生质体可用于研究生物膜，包括高分子和病毒的摄取。也用于体细胞的变异克隆。使用原生质体融合技术可让原生质体也用于植物育种。此外，在某些细胞中表达荧光蛋白的植物的原生质体可用于荧光活化细胞分选(FACS)，方便保留特定波长发荧光的细胞。植物原生质体的提取分离技术有大量报道，其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
紫花苜蓿号称“牧草之王”，不仅适应性强、产草量高，而且营养丰富，还能形成根瘤进行固氮，是全世界栽培最悠久、面积最大、利用最广泛的豆科牧草。
现有技术公开了多种紫花苜蓿来源的原生质体的方法，如文献：《杂花和紫花苜蓿原生质体分离培养条件的筛选》，《'陇东'紫花苜蓿原生质体最佳分离条件》，《紫花苜蓿原生质体游离条件的研究》，《扁蓿豆和清水野生紫花苜蓿原生质体分离与培养条件的筛选》，《苜蓿原生质体分离与培养的研究毕业论文》等，用酶解法分离清水紫花苜蓿(Medicagosativa L.cv.‘Qingshui’)愈伤组织来源的原生质体的方法，文中并公开了酶解时间、酶液组合、甘露醇浓度、预处理条件、继代时间及培养方法等。其中，一篇文章公开了最佳酶液组合和酶解时间分别为纤维素酶2％+果胶酶0.5％和8h；最佳离心转速和离心时间分别为500r/min和6min。
紫花苜蓿根部原生质体是一种非常有价值的实验材料，目前已经引起越来越多的人的兴趣，它不仅可以用于细胞生物学、遗传学、植物生理学甚至分子生物学的基础研究，同时也可以用于植物育种及作物改良方面。例如在分子生物学方面，我们可以研究其细胞壁的再生、质膜的功能与结构、细胞水平上植物抗逆性研究，因为原生质体能够引入外源遗传物质和在特定条件下具有繁殖、分化、再生成完整植株的能力，所以它是遗传转化最为理想的材料。在转录组测序方面，由于10XGenomics单细胞技术的涌现，我们可以利用紫花苜蓿根细胞分析不同功能细胞异质性问题。但现有技术没有公开紫花苜蓿根部的原生质体提取方法，由于根部木质素丰富，所以提取原生质体难度大大增加。
现有技术中，用于根部原生质体提取的方法主要有机械提取法和酶解提取法，由于机械提取法过程复杂，且在实验过程中易对原生质体造成损伤，最终不仅提取的产量低，而且细胞碎片多。因此选用对原生质体伤害最小的酶解法是最佳的提取手段。
文献公开的提取方法是否适合紫花苜蓿根部原生质体的提取，不得而知。
本发明人采用现有技术提取蔷薇科根部原生质体文献中的方法提取的紫花苜蓿根部原生质体数量少，活性低，制备完成的悬浮液存在反转录抑制剂Ca2+和Mg2+，会严重影响后续实验的进行。如本发明人参考蔷薇科根部原生质体提取方法双酶解法，取1g根段进行实验，将提出的原生质体稀释4倍后，取0.1ml置于血球计数板中计算原生质体个数，最终提取的原生质体数量虽然达标平均数量为35.5X106，利用FDA溶液检测原生质体活性，所得活性很低，仅有71.5％左右，低活率的原生质体会影响后续实验的开展。
为此，本发明人对紫花苜蓿根中原生质体的提取分离方法进行了全新的研究，找到一种适合
紫花苜蓿根中原生质体的提取分离方法。
发明内容
本发明提供一种紫花苜蓿根中原生质体的提取分离方法，所述方法，步骤如下
步骤1，紫花苜蓿种子的清洗
取紫花苜蓿种子，经消毒处理，养育4-5天，长出幼根；
步骤2，紫花苜蓿幼根的预处理
将养育好的紫花苜蓿幼根浸泡在CPW溶液，浸泡1-2个小时；
步骤3，酶解
取浸泡后紫花苜蓿幼根加入酶解液进行酶解，酶解时间为4-8小时；
步骤4，分离
酶解液过滤，离心分离得到原生质体。
优选的，本发明的方法，步骤如下：
步骤1，紫花苜蓿种子的清洗
取生长4-5天在MS固体培养基无菌处理过的紫花苜蓿幼根，利用20％次氯酸钠，75％乙醇对紫花苜蓿种子消毒处理，再用蒸馏水清洗五次，将100目的尼龙纱布平铺在MS固体培养基上，将紫花苜蓿种子铺在尼龙纱布上养育4-5天；
步骤2，紫花苜蓿幼根的预处理
将配制好的含有13％甘露醇的CPW溶液放在冰上，取步骤1的紫花苜蓿幼根1-2g置于CPW溶液当中浸泡1-2个小时；
步骤3，酶解
取浸泡后紫花苜蓿幼根加入酶解液进行酶解，所述酶解液含有以下成份：2％纤维素酶、1％果胶酶、0.4％离析酶、0.5M甘露醇、20mM MES、20mM KCl、10mMCaCl2、0.1％BSA，
酶解液使用前需要过滤，过滤采用0.22μm混合纤维素滤膜过滤，酶解在抽真空30min后，在50rpm/min，25℃避光条件下进行，酶解时间为4-8小时；
步骤4，分离
利用40μmFalcon 50细胞过滤器过滤掉酶解后的残渣，上清置于50ml离心管里，利用300g离心力在4℃条件下离心5min，弃掉上清液后，使用含有8％甘露醇溶液清洗Ca2+和Mg2+，使细胞重悬，离心，再重悬，再离心，获得原生质体。
以下是对本发明名词术语的解释：
紫花苜蓿幼根：挑选成熟完整的种子放在MS固体培养基中，养育4-5天所萌发出来的幼根。
MS固体培养基：由Murashige&Skoog、蔗糖、琼脂所配制的培养基20％次氯酸钠：由体积分数为20％次氯酸钠与蒸馏水配制而成的混合溶液
75％乙醇：由无水乙醇与蒸馏水按照体积比配制而成的混合溶液13％甘露醇：在溶液中质量分数为13％的甘露醇溶液
CPW溶液：由KH2PO4、KNO3、CaCl2.2H2O、MgSO4.7H2O、KI、CuSO4.5H2O配制而成的细胞清洗液
酶解液：由纤维素酶R-10、果胶酶Y-23、离析酶R-10、甘露醇、MES、KCl、CaCl2、BSA配制而成的原生质体酶解溶液Falcon 50细胞过滤器：孔径为40μm，用于过滤碎片以及杂质的滤膜。
本发明有关液体的配方如下：
1、Murashige&Skoog配方：
硝酸铵 1.65克 氯化钙 0.44克
硝酸钾 1.9克 硫酸镁 0.37克
磷酸二氢钾 0.17克 硼酸 5.2毫克
碘化钾 0.83毫克 硫酸镁 22.3毫克
硫酸锌 3.6毫克 硫酸铜 0.025毫克
钼酸钠 0.25毫克 氯化钴 0.025毫克
硫酸铁 27.8毫克 环已六醇 0.1克
乙二胺四乙酸 37.3毫克 维生素B1 0.1毫克
维生素B6 0.5毫克 甘氨酸 2毫克
维生素PP 0.5毫克 加水 到1L。
作用：Murashige&Skoog既有植物所需的氮、磷、钾及锌、铜、钼、铁等元素，同时也包含了对生长发育起促进和调节作用的有机物质及植物激素等。
2.固体培养基(MS)配方：
蔗糖 8.02g
Murashige&Skoog 4.446g
琼脂 8g
加水到 1L
调节PH到 5.7-5.85
3.8％CPW清洗液1L配方
Figure BDA0003172635330000061
Figure BDA0003172635330000071
4.酶解液配方(25ml)
试剂 添加量 终浓度
纤维素酶R-10 0.50g 2％
果胶酶Y-23 0.25g 1％
离析酶R-10 0.1g 0.4％
甘露醇 2.25g 0.5M
0.2M MES 2.5ml(0.098g) 20mM
2M KCl 0.25ml(0.037g) 20mM
1M CaCl<sub>2</sub> 0.25ml(0.055g) 10mM
10％BSA 0.25ml 0.1％
H<sub>2</sub>O 待溶质完全溶解后定容至25ml
PH 调节到 5.7左右
我们做了两组对比实验，最终确定了本发明的方法，对比实验如下：
(1)使用相同处理方法的无菌种子萌发出来的幼根，经使用13％CPW溶液质壁分离处理后，使用含有浓度为3％、1.5％、0.6％纤维素酶、果胶酶、离析酶的基础酶液对幼根进行处理，酶解6小时后，对结果进行技数和活性测定。
(2)使用相同处理方法的无菌种子萌发出来的幼根，经使用13％CPW溶液质壁分离处理后，使用含有浓度为1.5％、0.5％、0.4％纤维素酶、果胶酶、离析酶的基础酶液对幼根进行处理，酶解6小时后，对结果进行技数和活性测定。
有关实验结果见本发明说明书附图。
本发明所得原生质体，原生质体总数/mL为1.75X106,可以获得数目为7X106，活性在82.86％左右的原生质体，原生质体计数采用以下方法：
利用血球计数板检测原生质体个数，按照白细胞计数法则：原生质体总数/L＝4个大方格内细胞数/4X10X20X106X稀释倍数。使用台盼蓝检测细胞活性，若细胞膜完整，则原生质体不会被染成蓝色，若原生质体破碎则会被染成蓝色，活性技术法则：无染色原生质体/原生质体总数。
测定原生质体的活性有多种方法。其中荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。本发明经过研究，简化了检测方法，采用以下活性测定方法：
取9μl悬浮液+1μl0.4％台盼蓝混合液滴加到血球计数板上，使用显微镜观察细胞的染色状况，若细胞破碎，则会被染成蓝色。随后观察有活性细胞的数目和破碎细胞的数目。
本发明的有益效果如下：
目前公布的根部原生质体提取方法中，采用的是双酶解法对材料进行处理，本技术采用的是单酶解法，相比双酶解法，步骤更简略，操作更简单，获得的原生质体活性更高。在无菌苗的准备上，实验周期更短，所需要的培养基更少，染菌率低。
利用此项技术，可以获得数目为7X106，活性在82.86％左右的原生质体，同时破碎的细胞碎片少，酶解过程中产生的细菌和真菌的数量少。
附图说明
图1：使用含有浓度为2％、1％、0.4％纤维素酶、果胶酶、离析酶的基础酶液在40X10倍镜下观察到的原生质体的状态。
图2：使用含有浓度为2％、1％、0.4％纤维素酶、果胶酶、离析酶的基础酶液在10X10倍镜下观察到的原生质体的状态。
图3：使用含有浓度为3％、1.5％、0.6％纤维素酶、果胶酶、离析酶的基础酶液在40X10倍镜下观察到的原生质体的状态。
图4：使用含有浓度为1.5％、0.5％、0.4％纤维素酶、果胶酶、离析酶的基础酶液在40X10倍镜下观察到的原生质体的状态。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1.先对发育成熟的种子进行无菌处理。首先使用75％乙醇浸泡2min，随后用20％次氯酸钠漂白15min。用无菌水洗脱漂白剂5次，最后一次浸泡30min，最终获得无菌的成熟种子。
2.将种子铺在MS固体培养基上，提前铺上100目的尼龙纱布，垂直放置在光照培养箱4-5天，避免幼根扎入培养基中，影响后续的酶解，最终获得无菌幼苗。
3.使用放在冰上13％甘露醇的CPW溶液进行预处理，取1-2g幼根迅速置于15ml溶液当中1-2个小时，能够使要酶解的植物样品质壁分离。
4.配制25ml酶解液，首先基础酶液：2.25g甘露醇、0.098gMES、0.037gKCl、0.055gCaCl2、0.25ml 10％BSA溶液，剩余的为无菌水。将纤维素酶R-10(Solarbio)0.5g、果胶酶Y-23(Biotopped)0.25g、离析酶(Biotopped))0.1g依次溶于基础酶液中，PH调为5.7
5.将处理好的样品置于20ml酶液中，抽真空30min，酶解效果更好。
6.利用Falcon 50过滤酶解后的杂质，使用垂直离心机在4℃，300rcf条件下离心5min，去掉上清液，在此条件下对原生质体的伤害最小。
7.利用8％甘露醇溶液定容到20ml清洗原生质体，60g离心力离心5min，重复两次，最后将提取的原生质体重新悬浮在4ml的8％甘露醇溶液当中，经过清洗悬浮液中细胞碎片、细菌真菌以及杂质数量少，方便后续实验的进行。
8.取9μl悬浮液+1μl0.4％台盼蓝混合液滴加到血球计数板上，经检测，四个大方格原生质体个数分别为13、9、6、7平均数为8.75，按照白细胞计数原则，总原生质体得数为7X106。计数区死细胞的平均数为1.5，活率为29/35＝82.85％。
9.我们做了两组对照以此来验证试验结果，第一组使用的纤维素酶、果胶酶、离析酶浓度分别为3％、1.5％、0.6％。发现原生质体破碎率以及细胞碎片非常的多，利用血球计数板计算得到，原生质体个数为8.1X106，经台盼蓝染色，活性测定为52.1％。
10.随后我们使用纤维素酶、果胶酶、离析酶浓度分别为1.5％、0.5％、0.4％,发现虽然原生质体破碎率低，但是数量少。利用血球计数板计算得到，原生质体的个数为2.8X106，经台盼蓝染色，活性鉴定为81.34％。本技术选用的材料为无菌处理过的紫花苜蓿幼根，用上述提供的无菌操作，可以在短期内拿到无菌苗。目前还没有公布详细的根部原生质体提取方法。我们首先对材料进行预处理，其次根据对照试验找到适用于提取根部原生质体最佳的酶液配方，使提取的数量以及活性大大提高。
创新点：
我们在选择实验材料时，采用的无菌操作，不仅染菌率低，而且操作简单，在4-5天就可以得到无菌处理后的幼根，与现有的技术相比，我们的实验周期大幅缩短。
为了得到大小一致的原生质体，我们会使用13％CPW盐溶液对幼根进行质壁分离处理，同时为了使酶解液更好的附着在幼根上，我们抽真空30min，使酶解效果达到最好。
我们找到了适用于根部的酶解液配方，最后不仅产量多，并且活性能够保持在85％左右，相比之前发布的蔷薇科根部原生质体提取方法，我们不仅保证了原生质体的得率，并且活性要比之前公布的技术高出13％，达到上机测序的标准。
我们制备完成的悬浮液，不存在反转录抑制剂Ca2+和Mg2+，达到上机测序标准。

Claims (7)

1.一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法，所述方法，步骤如下
步骤1，紫花苜蓿种子的清洗
取紫花苜蓿种子，经消毒处理，养育4-5天，长出幼根；
步骤2，紫花苜蓿幼根的预处理
将养育好的紫花苜蓿幼根浸泡在CPW溶液，浸泡1-2个小时；
步骤3，酶解
取浸泡后紫花苜蓿幼根加入酶解液进行酶解，酶解时间为4-8小时；
步骤4，分离
酶解液过滤，离心分离得到原生质体。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤如下：
步骤1，紫花苜蓿种子的清洗
取生长4-5天在MS固体培养基无菌处理过的紫花苜蓿幼根，利用20％次氯酸钠，75％乙醇对紫花苜蓿种子消毒处理，再用蒸馏水清洗五次，将100目的尼龙纱布平铺在MS固体培养基上，将紫花苜蓿种子铺在尼龙纱布上养育4-5天；
步骤2，紫花苜蓿幼根的预处理
将配制好的含有13％甘露醇的CPW溶液放在冰上，取步骤1的紫花苜蓿幼根1-2g置于CPW溶液当中浸泡1-2个小时；
步骤3，酶解
取浸泡后紫花苜蓿幼根加入酶解液进行酶解，所述酶解液含有以下成份：2％纤维素酶、1％果胶酶、0.4％离析酶、0.5M甘露醇、20mM MES、20mM KCl、10mMCaCl2、0.1％BSA，
酶解液使用前需要过滤，过滤采用0.22μm混合纤维素滤膜过滤，酶解在抽真空30min后，在50rpm/min，25℃避光条件下进行，酶解时间为4-8小时；
步骤4，分离
利用40μmFalcon 50细胞过滤器过滤掉酶解后的残渣，上清置于50ml离心管里，利用300g离心力在4℃条件下离心5min，弃掉上清液后，使用含有8％甘露醇溶液清洗Ca2+和Mg2 +，使细胞重悬，离心，再重悬，再离心，获得原生质体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述MS固体培养基：由Murashige&Skoog、蔗糖、琼脂所配制的培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述Murashige&Skoog配方如下：
Figure FDA0003172635320000021
Figure 2
。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述固体培养基配方如下：
蔗糖 8.02g Murashige&Skoog 4.446g 琼脂 8g 加水到 1L 调节PH到 5.7-5.85
。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述13％甘露醇的CPW溶液配方如下：
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.272g KNO<sub>3</sub> 0.101g CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O 14.8g MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 2.46g KI 0.0016g CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O 0.00025g 甘露醇 13g 加水到 1L
。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酶解液的配方如下：
试剂 添加量 终浓度 纤维素酶R-10 0.50g 2％ 果胶酶Y-23 0.25g 1％ 离析酶R-10 0.1g 0.4％ 甘露醇 2.25g 0.5M 0.2M MES 2.5ml(0.098g) 20mM 2M KCl 0.25ml(0.037g) 20mM 1M CaCl<sub>2</sub> 0.25ml(0.055g) 10mM 10％BSA 0.25ml 0.1％ H2O 待溶质完全溶解后定容至25ml PH 调节到 5.7
。
CN202110823048.2A 2021-07-21 2021-07-21 一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法 Pending CN113621552A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110823048.2A CN113621552A (zh) 2021-07-21 2021-07-21 一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110823048.2A CN113621552A (zh) 2021-07-21 2021-07-21 一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113621552A true CN113621552A (zh) 2021-11-09

Family

ID=78380451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110823048.2A Pending CN113621552A (zh) 2021-07-21 2021-07-21 一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113621552A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861414A (zh) * 2016-06-15 2016-08-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种紫花苜蓿原生质体的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861414A (zh) * 2016-06-15 2016-08-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种紫花苜蓿原生质体的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
黄绍兴，王慧中，吕德扬: "紫花苜蓿根原生质体植株再生", 科技通报, no. 04, pages 1 - 1 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109810937B (zh) 一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法
CN102517384A (zh) 一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法
CN113046291B (zh) 一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法
CN104754932A (zh) 大规模生产包含共生体的人工种子的方法
Arya et al. Micropropagation of superior eucalyptus hybrids FRI-5 (Eucalyptus camaldulensis Dehn x E. tereticornis Sm) and FRI-14 (Eucalyptus torelliana FV Muell x E. citriodora Hook): A commercial multiplication and field evaluation
CN106417033B (zh) 一种高唐栝楼快速繁殖方法
ZA200303565B (en) Enhanced selection of genetically modified pine embryogenic tissue.
CN113897330A (zh) 一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法和应用
RU2619052C1 (ru) Способ получения растений хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum Schousb.) в условиях in vitro
CN113621552A (zh) 一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法
Twumasi et al. Establishing in vitro Zinnia elegans cell suspension culture with high tracheary element differentiation
Li et al. In vitro maturation and germination of Jatropha curcas microspores
CN103898155B (zh) 利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基
Mei et al. Nitraria sibirica cell suspension culture: establishment, characterization and application
CN103651078A (zh) 一种筛选转基因植物种子的方法
CN109609433B (zh) 从分离和培养生长细胞获得植物纤维的方法
CN103146748A (zh) 农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法
CN108624547B (zh) 一种分离单子叶植物保卫细胞的方法
CN102204511B (zh) 一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法
CN106770250B (zh) 一种快速检测水稻耐镉性能的方法
CN113061639A (zh) 一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法
Gupta et al. A simple protocol for a rapid and consistent production of a large number of viable protoplasts from the Ulvophycean species
CN115354013B (zh) 一种烟草原生质体制备方法
Hassanein et al. High-efficiency colony formation and whole plant regeneration from mesophyll protoplasts of Pelargonium× hortorum ‘Panaché sud’
Steiner Protoplast isolation and transformation in sweetpotato

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination