CN106770250B - 一种快速检测水稻耐镉性能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速检测水稻耐镉性能的方法，本发明方法中，直接以水稻单细胞作为耐镉实验材料，因而无需进行实地种植和/或反复的种植实验，不仅省时省力，而且可以提高检测和进一步水稻筛选的效率，从而可以克服现有技术中方法检测效率低，检测成本高等技术问题。本发明方法具有检测方法便捷且不受环境影响，同时具有检测效率高、检测成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及植物检测领域，具体而言，涉及一种快速检测水稻耐镉性能的方法。
背景技术
我国南方部分水稻主产区土壤中重金属镉含量超标严重，而镉含量过高会影响水稻正常的生长，也会进一步影响水稻的产量。由于不同水稻品种对镉的抗性有着显著的差异，一些耐镉品种的水稻即使在污染地区种植，也能够正常生长。因此，非常有必要筛选出具有良好耐镉性能的水稻品种，并在镉超标地区推广使用。
目前筛选耐镉水稻品种的方法，都是通过盆栽和小区实际种植的方式进行实验检测。然而，由于水稻生长一季需要半年时间，而且前期的播种以及中期管理、施肥等工作也较为耗时耗力，而且经济成本也比较高。因此，现有的检测筛选方法效率比较低而且很不经济。此外，由于在种植过程中，水稻的生长很容易由于受气候条件变化、水肥、病虫害等自然条件的影响，因而，种植试验往往需要进行2－3次的重复，才能得到可信的实验结果。而这也进一步影响了检测和筛选实验的效率，提高了成本。
因此，开发一种可以低成本且高效检测水稻耐镉性能的方法就成了目前亟待解决的技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种快速检测水稻耐镉性能的方法，所述的方法直接以水稻单细胞作为耐镉实验材料，无需进行实地种植和/或反复的种植实验，不仅省时省力，而且可以提高检测和进一步水稻筛选的效率，从而可以克服现有技术中方法检测效率低，检测成本高等技术问题。本发明方法具有检测方法便捷且不受环境影响，并且检测效率高、检测成本低等优点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种快速检测水稻耐镉性能的方法，其包括如下步骤：
1)、分别称取等量的不同种水稻单细胞，并将每份水稻单细胞分别悬浮于具有不同镉盐浓度的培养基中进行振荡培养；
2)、分别等量吸取振荡培养后的培养液，并加入荧光染色剂染色且继续培养后，荧光检测培养液中细胞的颜色，比较不同种水稻出现红色荧光时对应的最小镉离子浓度，其中最小镉离子浓度最高的水稻种为该批次水稻中最耐镉的水稻品种。
本发明中，采用水稻单细胞耐受试验来检测某一水稻品种对镉的耐受能力，因此具有检测快速准确且不受自然环境条件影响，同时具有检测成本低等优点。由于本申请方法无需进行水稻反复种植检测，因而可以在较短时间内实现水稻耐镉性能检测。
可选的，本发明中，还进一步包括将染色后的培养液分别与在相同条件下以未加入镉盐的培养基进行振荡培养的水稻单细胞依次进行对照检测的步骤。
可选的，本发明中，当检测出某种水稻单细胞出现红色荧光时对应的最小镉离子浓度≥6.5mg/L时，该种水稻即为耐镉水稻。
可选的，本发明中，所述对照检测是将染色后的培养液按照所含镉盐浓度由低至高，分别与未加入镉盐的培养基进行振荡培养的水稻单细胞(即空白对照组)依次进行对照检测。
可选的，本发明中，在水稻单细胞振荡培养2h后，再进行对照检测。
可选的，本发明中，水稻单细胞振荡培养时间为10h，并每间隔2h进行对照检测。
可选的，本发明中，所述检测是在荧光显微镜下进行的。
可选的，本发明中，还进一步包括如果经对照检测发现，如果最高镉盐浓度的培养基并未致使水稻单细胞死亡，则进一步配制更高镉盐浓度的培养基，然后在相同实验条件下进行重复培养及对照检测实验的步骤，直至经检测发现某一浓度镉盐的培养液会在检测时限内导致水稻单细胞死亡。
可选的，本发明中，所述水稻单细胞培养基为AA培养基；优选的，所述培养基为基本培养基AA。
可选的，本发明中，所述AA培养基为添加有2，4－D，KT(激动素)，丁香酚以及蔗糖的基本培养基AA，其各组分用量为：基本培养基AA1L；2，4－D1－5mg；KT0.1－1mg；丁香酚0.1－1mg蔗糖15－40g。
本发明中，通过对愈伤组织培育所用培养基营养成分的调整和优化，从而提高了愈伤组织的增殖速度，进而进一步提高了整个检测的效率。
可选的，本发明中，所述方法还进一步包括将水稻种子去壳后消毒，然后再切胚的步骤。
本发明中，通过对去壳后的水稻种子消毒，从而避免了由于水稻种子表面沾染细胞等物质而对其进一步培育所带来的影响。
可选的，本发明中，所述方法进一步还包括将愈伤组织接种于AA培养基后，将培养基超声振荡处理后，再进行振荡培养的步骤。
本发明中，通过对培养基进行超声处理，从而使得所接种的愈伤组织细胞能够充分分散，进一步有利于水稻单细胞的培育。
可选的，本发明中，所述愈伤组织振荡培养是在20－30℃黑暗条件下进行的。
本发明中，通过对水稻愈伤组织振荡培养条件的选择和调整，优化了愈伤组织的生长环境，从而进一步提高了愈伤组织的生长速度，进而提高了单细胞培育的效率。
可选的，本发明中，所述超声振荡的时间为10－20min。
可选的，本发明中，所述镉盐为氯化镉、硝酸镉或者硫酸镉中的一种；优选的，本发明中，所述镉盐为硫酸镉；更优选的，本发明中，所述镉盐为分析纯的硫酸镉。
本发明中，通过对所用镉盐进行选择和调整，使用具有良好溶剂性能的镉盐作为实验原料，从而进一步提高了检测试验的效率。
可选的，本发明中所述振荡培养是在20－30℃的黑暗条件下进行的振荡培养。优选的，本发明中，所述振荡培养的温度为25－27℃。
本发明中，通过对振荡培养的温度等条件的选择和优化，从而能够提高水稻单细胞的增殖速度，从而进一步提高检测效率。
可选的，本发明中，所述荧光染色剂为PI和SYTO9核酸染色剂。
本发明中，所用核酸染色剂染色原理如下：SYTO9是一种小分子染料，具有良好的细胞膜渗透性，可穿过完好的细胞膜进入到细胞核内与核酸结合并对其染色，在蓝光激发下发射绿色荧光，可以认为SYTO9能够将带有细胞核的细胞进行染色。PI分子量相对较大，不具有细胞膜渗透性，不能渗透穿过完好的细胞膜，只能进入细胞膜已破坏的细胞并与其核酸结合染色，在蓝光激发下发射红色荧光，可以认为PI只能对死细胞(细胞膜被破坏的细胞)进行染色。由于PI比SYTO9对核酸的亲和力更强，所以被SYTO9染色的死菌细胞在有PI存在的情况下会重新与PI分子结合，使核酸最终被染红色。当两种染色剂共同作用下的细胞，显绿色荧光的细胞被认为是具完整细胞膜的活菌，而显红色荧光的细胞被认为是细胞膜有破损的死。
本发明中，通过选用具有高效染色以及细胞分辨功能的染色剂，从而使得本发明的检测结构更为准确和可靠，提高了检测的效率和可靠性。
可选的，本发明中，所述染色时间为3－10min。优选的，本发明中，所述染色时间为5－7min。所述染色剂体积用量为培养液体积的1/5－1/20。本发明中，通过对染色时间的进一步调整和优化，从而使得可以让细胞充分染色的同时，还不会因为染色时间过长而导致的检测效率降低。
可选的，本发明中，所述水稻单细胞是由水稻种子去壳后切胚，经诱导培养得到愈伤组织，再由愈伤组织于AA培养基中振荡培养得到的。
可选的，本发明中，所述水稻种子去壳为除去水稻种子颖壳。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明中，通过采用水稻单细胞耐受试验以检测水稻品种对镉的耐受能力，因此具有检测快速准确且不受自然环境条件影响，同时检测成本低等优点；
(2)本发明中，通过对愈伤组织培育中所用培养基的调整和优化，从而提高了愈伤组织的培育速度，从而进一步提高了整体的检测效率。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
(1)水稻愈伤组织培养：挑选适量大小一致、生长饱满的湘早籼种子，手工去除颖壳后，置于75％酒精中浸泡消毒7min；然后，将消毒后种子用无菌水冲洗1次，再用0.1mol/L的次氯酸钠浸泡处理20min，期间每隔5min震荡1次次氯酸钠浸泡种子体系。然后，将次氯酸钠处理后种子用无菌水冲洗4次，并将表面沾有的无菌水水吸干，并将种子接种到预培养基上，于25℃以及黑暗条件下，预培养24h。取预培养后胀膨的“米粒”沿盾片方向切胚，将切面(即盾片)向上置于培养基上，并于26℃黑暗条件下诱导愈伤组织，15d后剔除芽和根，即得到取愈伤组织；然后，将愈伤组织置于培养基中，兵在27℃黑暗条件下继代培养。
其中预培养、愈伤组织诱导培养以及继代培养所用培养基均为添加有2，4－D、KT、蔗糖、琼脂的基本培养基LS。进一步的，所述培养基中各组分浓度为：2，4－D 2.5mg/L；KT0.1mg/L；蔗糖30g/L；琼脂7g/L。
(2)水稻悬浮细胞制备：取1.0g继代1次生长旺盛、松散的愈伤组织，然后将其接种于含有50mL经高温灭菌的AA液体培养基中，并将培养基于超声条件下振荡处理15min，从而使得使培养基中愈伤组织细胞充分分散开；然后，将培养基置于回旋式摇床上，并于25℃黑暗条件下，在摇床上以100r/min的振荡速度培养。
其中，所述AA液体培养基是将2，4－D，KT，丁香酚以及蔗糖溶解于基本培养基AA中而制成的，其各组分浓度为：2，4－D 2mg/L；KT 0.2mg/L；丁香酚0.2mg/L；蔗糖30g/L。
振荡培养15天后，将培养基置于显微镜下观察，发现明显的悬浮细胞，经检测，悬浮细胞的密度2×105/ml。
振荡培养过程中，每3d替换一次培养基，培养基替换方法为：倒出原培养基中2/3的上清液，然后加入等量新鲜培养基继续培养。
(3)水稻耐镉性能检测：量取适量水稻悬浮细胞培养基，然后装入离心管中，在3000r/min条件下离心，并得到水稻悬浮细胞进行收集。
分别称取适量分析纯的CdSO4，并将其分别溶于100ml基本培养基AA中，以得到镉离子浓度剂量分别为1.2mg/L，2.4mg/L，3.6mg/L，4.8mg/L的基本培养基AA。然后，向每份培养基中分别加入1g收集得到的水稻悬浮细胞，并在25℃黑暗条件下进行振荡培养，作为实验组。
同时，向未加入CdSO4的100ml AA培养基中加入1g收集得到的水稻悬浮细胞，并在25℃黑暗条件下进行振荡培养，作为对照组组。
振荡培养2h后，分别吸取200μL实验组和对照组培养液，然后，加入20μLPI和SYTO9染色剂，染色5min后，在荧光显微镜下将实验组分别与对照组一一进行对照检测。
结果显示，镉离子浓度剂量分别为1.2mg/L，2.4mg/L，3.6mg/L的培养基中细胞呈现绿色荧光，证明水稻细胞并未出现死亡；而镉离子浓度剂量为4.8mg/L的培养基中经染色显示出现部分红色荧光，证明已出现部分水稻细胞死亡。
继续震荡培养2h后，再次按照如上的步骤对实验组中水稻细胞进行对照检测。
结果显示，镉离子浓度剂量分别为1.2mg/L，2.4mg/L，3.6mg/L的培养基中细胞呈现绿色荧光，证明水稻细胞并未出现死亡；而镉离子浓度剂量为4.8mg/L的培养基中经染色显示完全为红色荧光，证明已出现水稻细胞已完全死亡。即湘早籼能够耐受镉离子的最高剂量为4.8mg/L。
实施例2
挑选适量大小一致、生长饱满的T优705种子，并按照实施例1中所述方法进行水稻悬浮细胞培养，并按照实施例1中所述方法将悬浮细胞离心收集。其中，实施例2中所用AA培养液中其各组分浓度为：2，4－D 1mg/L，KT 0.1mg/L，丁香酚0.1mg/L，蔗糖15－40g/L。
然后，按照实施例1中所述方法配制得到镉离子浓度剂量分别为1.2mg/L，2.4mg/L，3.6mg/L，4.8mg/L的培养基。然后，向每份培养基中分别加入1g收集得到的水稻悬浮细胞，并在25℃黑暗条件下进行振荡培养，作为实验组。
同时，按照实施例1中所述方法准备对照组。
振荡培养2h后，按照实施例1中所述方法进行对照检测，结果显示所有培养基中细胞均呈现绿色荧光。
继续震荡培养2h后，再次按照如上的步骤对实验组中水稻细胞进行对照检测，结果显示所有培养基中细胞仍均呈现绿色荧光。
然后，按照实施例1中所述方法配制得到镉离子浓度剂量分别为6.0mg/L，8.0mg/L，10.0mg/L的培养基。接下来，向每份培养基中分别加入1g收集得到的水稻悬浮细胞，并在25℃黑暗条件下进行振荡培养，作为实验组。同时，按照实施例1中所述方法制备对照组。
振荡培养2h后，按照实施例1中所述方法进行对照检测，结果显示6.0mg/L，8.0mg/L培养液中细胞均呈现绿色荧光。10.0mg/L培养液中出现部分红色荧光。
继续震荡培养2h后，再次按照如上的步骤对实验组中水稻细胞进行对照检测，结果显示6.0mg/L，8.0mg/L培养液中细胞仍呈现绿色荧光。10.0mg/L培养液中完全呈现红色荧光，即T优705能够耐受镉离子的最高剂量为10.0mg/L，即T优705种子为耐镉水稻品种。
实施例3
挑选适量大小一致、生长饱满的江苏地方品种27760种子，并按照实施例1中所述方法进行水稻悬浮细胞培养，并按照实施例1中所述方法将悬浮细胞离心收集。其中，实施例3中所用AA培养液中各组分浓度为2，4－D 5mg/L，KT 1mg/L，丁香酚1mg/L，蔗糖40g/L。
然后，按照实施例1中所述方法配制得到镉离子浓度剂量分别为1.2mg/L，2.4mg/L，3.6mg/L，4.8mg/L的培养基。然后，向每份培养基中分别加入1g收集得到的水稻悬浮细胞，并在25℃黑暗条件下进行振荡培养，作为实验组。
同时，按照实施例1中所述方法准备对照组。
振荡培养2h后，按照实施例1中所述方法进行对照检测，结果显示镉离子浓度剂量分别为1.2mg/L，2.4mg/L的培养基中细胞呈现绿色荧光。镉离子浓度剂量为3.6mg/L的培养基中显示部分红色荧光，而4.8mg/L的培养基中经染色显示完全为红色荧光。
继续震荡培养2h后，再次按照如上的步骤对实验组中水稻细胞进行对照检测。
结果显示，镉离子浓度剂量分别为1.2mg/L，2.4mg/L的培养基中细胞仍呈现绿色荧光，证明水稻细胞并未出现死亡；而镉离子浓度剂量为3.6mg/L、4.8mg/L的培养基中经染色显示完全为红色荧光，证明已出现水稻细胞已完全死亡。即江苏地方品种27760能够耐受镉离子的最高剂量为3.6mg/L，为非耐镉品种。
实施例4
挑选适量大小一致、生长饱满的云南地方品种齐头百谷水稻种子，并按照实施例1中所述方法进行水稻悬浮细胞培养，并按照实施例1中所述方法将悬浮细胞离心收集。其中，实施例4中所用AA培养液中各组分浓度为2，4－D 5mg/L，KT 1mg/L，丁香酚1mg/L，蔗糖40g/L。
然后，按照实施例1中所述方法配制得到镉离子浓度剂量分别为1.2mg/L，2.4mg/L，3.6mg/L，4.8mg/L的培养基。然后，向每份培养基中分别加入1g收集得到的水稻悬浮细胞，并在25℃黑暗条件下进行振荡培养，作为实验组。
同时，按照实施例1中所述方法准备对照组。
振荡培养2h后，按照实施例1中所述方法进行对照检测，结果显示所有培养基中细胞均呈现绿色荧光。
继续震荡培养2h后，再次按照如上的步骤对实验组中水稻细胞进行对照检测，结果显示所有培养基中细胞仍均呈现绿色荧光。
然后，按照实施例1中所述方法配制到镉离子浓度剂量分别为10.0mg/L，15.0mg/L，20.0mg/L，22.0mg/L的培养基。然后，向每份培养基中分别加入1g收集得到的水稻悬浮细胞，并在25℃黑暗条件下进行振荡培养，作为实验组。同时，按照实施例1中所述方法制备对照组。
振荡培养2h后，按照实施例1中所述方法进行对照检测，结果显示10.0mg/L，15.0mg/L，20.0mg/L培养液中细胞均呈现绿色荧光。22.0mg/L培养液中出现部分红色荧光。
继续震荡培养2h后，再次按照如上的步骤对实验组中水稻细胞进行对照检测，结果显示10.0mg/L，15.0mg/L，20.0mg/L培养液中细胞仍呈现绿色荧光。22.0mg/L培养液中完全呈现红色荧光，即齐头百谷能够耐受镉离子的最高剂量为22.0mg/L，即云南地方品种齐头百谷为耐镉水稻品种，同时也是本发明实施例中所测四种水稻种耐镉能力最强的品种。
对比例1
挑选适量大小一致、生长饱满的湘早籼种子，然后按照实施例1中所述方法制备水稻悬浮单细胞。
其中，对比例1方法水稻悬浮细胞制备步骤中所述AA液体培养基中，不添加丁香酚，其他添加物用量相同。对比例2中其余步骤中所用培养基均与实施例1中相同。
在振荡培养15天后，将对比例1中的培养基置于显微镜下观察，未发现明显的悬浮细胞；继续培养60日后，将培养基置于显微镜下观察，才发现明显的悬浮细胞，经检测，悬浮单细胞的密度1.5×105/ml。
然后，按照实施例1所述方法对所得到的水稻单细胞进行耐镉检测，结果显示湘早籼能够耐受镉离子的最高剂量为4.8mg/L。
对比例2
挑选适量大小一致、生长饱满的T优705水稻种子，然后按照实施例2中所述方法制备水稻悬浮单细胞。
其中，对比例2方法水稻悬浮细胞制备步骤中所用AA液体培养基中，不添加丁香酚，其他添加物用量相同。对比例1中其余步骤中所用培养基均与实施例2中相同。
在振荡培养15天后，将对比例中的培养基置于显微镜下观察，未发现明显的悬浮细胞；继续培养45日后，将培养基置于显微镜下观察，才发现明显的悬浮细胞，经检测，悬浮单细胞的密度1×105/ml。
然后，按照实施例1所述方法对所得到的水稻单细胞进行耐镉检测，结果显示湘T优705水稻能够耐受镉离子的最高剂量为10.0mg/L。
本发明中，通过采用水稻单细胞耐受试验以检测某一水稻品种对镉的耐受能力，因此具有检测快速准确且不受自然环境条件影响，同时检测成本低等优点。同时，本发明中，通过对愈伤组织培育中所用培养基的调整和优化，从而提高了愈伤组织的培育速度，从而进一步提高了整体的检测效率。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (8)
1.一种快速检测水稻耐镉性能的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)、分别称取等量的不同种水稻单细胞，并将每份水稻单细胞分别悬浮于具有不同镉盐浓度的培养基中进行振荡培养；
其中，所述水稻单细胞是由水稻种子去壳后切胚，经诱导培养得到愈伤组织，再由愈伤组织于AA培养基中振荡培养得到的；
所述AA培养基为添加有2,4-D，KT，丁香酚以及蔗糖的基本培养基AA，其各组分浓度为：2,4-D 1-5mg/L，KT 0.1-1mg/L，丁香酚0.1-1mg/L,蔗糖15-40g/L；
2)、分别等量吸取振荡培养后的培养液，并加入荧光染色剂染色且继续培养后，荧光检测培养液中细胞的颜色，比较不同种水稻出现红色荧光时对应的最小镉离子浓度，其中最小镉离子浓度最高的水稻种为最耐镉的水稻品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将水稻种子去壳后消毒，然后再切胚的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将愈伤组织接种于AA培养基后，将AA培养基超声振荡处理后再进行振荡培养的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述超声振荡的时间为10-20min。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述镉盐为氯化镉、硝酸镉或者硫酸镉中的一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述振荡培养在20-30℃的黑暗条件下进行，且培养时间为8-12小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光染色剂为PI和SYTO9核酸染色剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述染色的时间为3-10min；所述染色剂体积用量为培养液体积的1/5-1/20。
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