CN86108050A - 水稻原生质体再生植株的技术 - Google Patents
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Abstract
一种水稻原生质体再生植株的技术,利用水稻77—170品系幼花序诱发的愈伤组织为材料,在修改的AA(A1)培养基中悬浮培养,并分离出大量存活的原生质体,再将原生质体培养在修改的KM培养基上使其产生胚性细胞团,再将胚性细胞团转移到修改的MS培养基中使其产生胚状体或胚性愈伤组织,从而再生成完整植株。
Description
本发明属植物细胞培养技术
植物细胞原生质体再生植株是用新的非常规的生物技术改良作物品种的一个基本环节。水稻原生质体再生植株是一个难题。直到1985年日本三井东压公司藤村达人等(Fuzimura,T..Sakurai.M..Akagy.H..Plant Tissue Culture Letters.2(2)∶74-75,1985)首次发表了由日本型水稻种子的盾片及未成熟胚的细胞悬浮培养物来源的原生质体在R2培养基中再生出了植株。
本发明的目的是用中国水稻品系作材料,在修改的培养基上获得水稻原生质体再生植株。
操作程序
(1)基因型的选取:
本发明选用粳稻品系77-170的幼花序,表面消毒后取长约3-10mm的幼花序,置于MS(加2mg/12.4D)培养基上,诱导愈伤组织。
(2)悬浮细胞系的建立:
取具有较高分化潜力的表面具小球状结构的浅黄色愈伤组织,按1g/20ml修改的AA液体培养基的比例,接种入50ml的三角瓶中进行悬浮培养,培养条件为25℃,12h/20℃,12h,150rpm,每3-4天吸出原培养基加入等量的新鲜培养基,两个月后形成分散均匀、分裂旺盛、原生质稠密的胚性细胞系,该细胞系中细胞团直径为250-350um。
(3)原生质体游离及纯化:
从悬浮细胞系中取0.5g细胞团加入10ml混合酶液(见附表1),置于黑暗27℃条件下,并轻轻摇动。3小时后95%的细胞可释放出具活性的原生质体。该混合液经孔径50um的镍丝网过滤。150g离心5分钟,吸去酶液后用清洗液(见附表2)清洗两次,然后用A2培养基(见附表3)再清洗一次。纯化后的原生质体用A,培养基悬浮并用血球计数器计数。
(4)原生质体培养:
将悬浮于A2培养基中的原生质体以8×10
/ml的密度接种于2×4cm的玻璃瓶中,每瓶接种1.5-2ml。置于27℃条件下暗培养6小时后,80%以上的原生质体出现微微膨大。一天后约20%的再生细胞开始拉长。第3天出现第一次细胞分裂,第8天统计时,正常的一次分裂频率为3-5%。另有部分再生细胞处于明显的体细胞胚发生的状态。15-20天后加入1-2ml含0.3M葡萄糖的A2培养基,并转移至25℃光强为2000lux的人工气候箱中,其后每隔两周分别加入与培养物等体积的含0.2M葡萄糖的A2培养基和液体A3培养基。两个月后将所得的直径约1mm的再生细胞团连同培养基一起均匀地倾到在固体A3培养基表面,于相同条件下培养。10天后这种小细胞团即可长成直径约2-3mm的小愈伤组织,将这种小愈伤组织转移至分化培养基A4表面,第10天开始出现绿色芽点,再过一周后同时分化出带1-2片小叶的绿芽和根。此时将绿芽同根一起转移至相同培养基上,半个月后,发育出叶片浓绿、分蘖旺盛的完整小植株。将此小植株转移到花盆中,可以正常开花结实。
本技术的优点:
(1)选用了较好基因型的粳稻77-170品系,并选取有利分化的幼花序为起始材料,易于再生。
(2)采用修改了的系列培养基,促进胚性细胞团和胚状体的发生,有利于再生完整植株。
附表一:混合酶液成分
Cellulase Onozuka R-10 1%
Cellulase Onozuka RS 0.5%
Macerozyme R-10 1%
Pectolyase Y-23 0.1%
CaCl2.2H2O 1470mg/L
KH2PO495mg/L
Sorbitol 0.25Mol
Mannitol 0.25Mol
MES 6,000mg/L
PH5.7
附表二:原生质体清洗液成分
CaCl2.2H2O 1,470mg/L
KH2PO495mg/L
Sorbitol 0.25Mol
Mannitol 0.25Mol
MES 6,000mg/L
PH5.7
附表三:水稻原生质体再生植株系列培养基
组分 A1培养基 A2培养基 A3培养基 A4培养基
基本培养基 AA KM MS MS
附加成分 (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l)
水解酪蛋白 250 250 250 250
椰子乳 50ml 50ml 50ml 50ml
庶糖 20,000 10,000 30,000 30,000
蜂王浆 - 400 400 400
琼脂 - - 6,000 6,000
小牛血清 - 8(ml) - -
葡萄糖 - 0.4(Mol) - -
生长激素
2.4-D 1 1 2 -
激动素 0.2 - - -
玉米素 - 0.5 - -
赤霉素 0.1 - - -
奈乙酸 - 0.5 - -
pH 5.7 0.7 5.7 5.7
Claims (4)
1、一种水稻原生质体再生植株的技术,其特征在于采用由水稻(Oryza sativa L.)77-170品系的幼花序诱发的愈伤组织为材料,在修改的AA培养基(A1)中悬浮培养并分离出大量存活的原生质体,再将该原生质体培养在修改的KM培养基上使其产生胚性细胞团,然后将该胚性细胞团转移到修改的MS培养基中,使其产生胚状体及胚性愈伤组织,从而再生成完整植株。
2、根据权利要求1所述的水稻原生质体再生植株的技术,其特征在于所说的修改的AA培养基(A1)是在AA基本培养基中添加了椰子乳、水解酪蛋白而减少了2.4-D的用量。
3、根据权利要求1所述的水稻原生质体再生植株的技术,其特征在于所说的修改的KM培养基(A2)是在KM基本培养基中加入了蜂王浆、水解酪蛋白、小牛血清、椰子乳等。
4、根据权利要求1所述的水稻原生质体再生植株的技术,其特征在于所说的修改的MS培养基(A3)(A4)是在MS基本培养基中添加了蜂王浆、椰子乳、水解酪蛋白。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 86108050 CN86108050A (zh) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | 水稻原生质体再生植株的技术 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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CN 86108050 CN86108050A (zh) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | 水稻原生质体再生植株的技术 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN86108050A true CN86108050A (zh) | 1988-06-15 |
Family
ID=4803781
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 86108050 Pending CN86108050A (zh) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | 水稻原生质体再生植株的技术 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN86108050A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106770250A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-05-31 | 农业部环境保护科研监测所 | 一种快速检测水稻耐镉性能的方法 |
CN106754630A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-05-31 | 农业部环境保护科研监测所 | 一种水稻悬浮单细胞培养基及水稻单细胞的制备方法 |
CN108782248A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-13 | 江西省超级水稻研究发展中心 | 一种建立水稻悬浮细胞系的方法及其制备工艺 |
CN109554330A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-04-02 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 一种马尾松原生质体制备方法 |
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1986
- 1986-12-05 CN CN 86108050 patent/CN86108050A/zh active Pending
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