CN108782248A - 一种建立水稻悬浮细胞系的方法及其制备工艺 - Google Patents

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黄永兰
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Abstract

本发明公开了一种建立水稻悬浮细胞系的方法，包括以下步骤：(1)接种用胚性愈伤组织的获得；(2)将获得的水稻胚性愈伤组织接种于培养基中，在摇床中振荡培养；(3)将培养物中的大颗粒愈伤筛除，收集悬浮液，离心，收集沉淀物；(4)添加新鲜培养基，将收集的沉淀物悬浮培养，继代培养多次后，直至培养基底部小颗粒细胞团大量产生，同时培养液变得较澄清；(5)吸取培养液中的小颗粒进行继代培养，添加培养基，继代2次后，转入不同培养基中继代，吸取其中小颗粒继代培养数天，即获得水稻悬浮细胞系。本发明提供了一种建立水稻悬浮细胞系的方法，可以缩短悬浮细胞培养进程，提高悬浮细胞系的胚性和减少无性系变异。

Description

一种建立水稻悬浮细胞系的方法及其制备工艺
技术领域
本发明属于水稻组织细胞培养技术领域，具体涉及一种建立水稻悬浮细胞系的方法。
背景技术
悬浮细胞培养是一种重要的植物生物技术，通过悬浮培养获得的悬浮细胞系是植物生理生化研究、原生质体分离和生物工程的重要材料。
在水稻中，一般胚性悬浮细胞系的建立要经历如下步骤：
首先是愈伤组织的准备，要求用于接种的愈伤组织要结合松散、颗粒较小且质地较硬，具有再生性(胚性)；
第二步是初步悬浮培养，接种后经过1个月左右悬浮培养获得一定量的小颗粒愈伤，继代时一般要用新鲜培养液置换一部分旧培养液，除了去除褐化愈伤组织外，一般不需要进行筛选，只在培养最后出现较多小颗粒愈伤时对其进行挑选；
第三步是悬浮愈伤的筛选驯化，由于初期培养挑选出来的小颗粒愈伤在继代时总是倾向于形成较大颗粒，需要在继代时持续选择小颗粒，此过程可持续长达7个月；
最后一步是建成悬浮细胞系的维持培养，在获得分散性良好的悬浮细胞系后，在继代过程中需要不时去除大颗粒细胞团，维持细胞系的分散性不变。
在后续过程需要植株再生的悬浮细胞培养试验中，悬浮细胞系本身的胚性以及从其衍生的再生植株的遗传稳定性对于多数研究而言都比较重要。一般而论，悬浮细胞系经历的培养时间越长，胚性越低，衍生的再生植株出现无性系变异特别是不育的概率也越大，因此缩短悬浮培养时间对于提高悬浮细胞系的胚性和减少无性系变异至关重要。而在水稻中，通过现有方法构建悬浮细胞系因品种及方法不同一般需要6-8个月，最少也需要4-5个月，如此长的过程往往导致获得的悬浮细胞系再生性不高，而且无性系变异特别是不育性状出现的概率也较大。基于此，在水稻悬浮细胞培养中应寻找缩短悬浮培养进程的方法，从而提高悬浮细胞系的胚性和减少无性系变异。
向太和等人发现悬浮培养初期培养基变得比较浑浊的品种容易建成悬浮细胞系，稍微浑浊的品种较难建成悬浮细胞系，而完全澄清的品种无法建成悬浮细胞系，通过镜检发现，培养基变得浑浊是由于从愈伤组织上脱落下大量的细胞所致，因此这些研究者认为悬浮培养初期培养液是否浑浊是悬浮细胞系能否成功建成的重要标志[向太和,杨剑波,吴家道.安徽农业科学,1996,24(1):1-8]。
发明内容
本发明针对水稻现有悬浮细胞培养程序历时较长的问题，提供了一种建立水稻悬浮细胞系的方法，可以缩短悬浮细胞培养进程，从而提高悬浮细胞系的胚性和减少无性系变异。本发明受启示于背景技术中向太和等人的研究发现，从愈伤组织上脱落的细胞(或小细胞团)最终发育成了我们所需要的小颗粒悬浮细胞团。因此，本申请的发明人通过初期培养时收集脱落细胞进行继代培养从而获得小颗粒细胞团。试验证明，此种操作的确能获得小颗粒细胞团而且还可以加速悬浮细胞系的建立进程。
本发明公开了一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)接种用胚性愈伤组织的获得；
(2)将获得的水稻胚性愈伤组织接种于培养基中，在摇床中振荡培养；
(3)将培养物中的大颗粒愈伤筛除，收集悬浮液，离心，收集沉淀物；
(4)添加新鲜培养基，将收集的沉淀物悬浮培养，悬浮培养过程中间隔不断添加新鲜培养基，继代培养多次后，直至培养基底部小颗粒细胞团大量产生，同时培养液变得较澄清；
(5)吸取培养液中的小颗粒进行继代培养，添加培养基，继续悬浮培养，继代2次后，转入不同培养基中继代，吸取其中小颗粒继代培养数天，即获得水稻悬浮细胞系。
上述任一方案优选的是，所述步骤(1)中以Kasalath成熟种子为外植体进行愈伤组织诱导。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中具体操作为：将3-5g水稻胚性愈伤组织接种于30ml培养基中，25-30℃条件下，以80-110转每分钟的转速在摇床中振荡培养。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中的培养基为NBL液体培养基。
上述任一方案优选的是，所述NBL培养基成分，如下所示：
1添加ABA有利于悬浮细胞分离获得的原生质体在培养过程中更容易存活和分裂。
2加入特美丁以防污染。
上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中的培养物在悬浮培养后培养液变得浑浊时，过40目细胞筛筛除大颗粒愈伤，收集悬浮液，离心5分钟，收集沉淀物。
上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中用40目细胞筛去除大颗粒愈伤组织。
上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中具体操作包括：
(41)保留部分旧培养基，添加相同成分新鲜培养基，将步骤(3)中收集的沉淀物悬浮，悬浮培养条件和温度与步骤(2)相同，继代培养4次后，当培养液底部出现较多愈伤时，进行下一步操作；
(42)无需离心直接移除部分旧培养液，加入等体积新鲜培养液，培养条件不变，继续悬浮培养，相同方法继代2次，直至培养基底部小颗粒细胞团大量产生，同时培养液变得较澄清。
上述任一方案优选的是，所述步骤(41)中继代时需要1000rpm离心5min收集悬浮物，并保留旧培养基10ml，添加相同成分新鲜培养基20ml。
上述任一方案优选的是，所述步骤(42)中移除20ml旧培养基，加入等体积相同成分新鲜培养基。
上述任一方案优选的是，所述步骤(5)中不同培养基为AA培养基。
上述任一方案优选的是，所述AA培养基成分为：
1添加ABA有利于悬浮细胞分离获得的原生质体在培养过程中更容易存活和分裂。
2加入特美丁以防污染。
上述任一方案优选的是，所述步骤(5)中用巴氏吸管吸取其中小颗粒(直径1mm以下)进行继代培养。
上述任一方案优选的是，所述步骤(5)中按照旧培养基：新培养基比例为1：2添加新鲜培养基，每次吸取其中小颗粒继代(直径1mm以下)，在继代40天左右，多数细胞团直径在0.5mm以下时即获得水稻悬浮细胞系。
上述任一方案优选的是，在步骤(4)和步骤(5)的悬浮培养过程中遇到愈伤褐化的问题时，需要缩短继代间隔时间至3-5天，并不时去除褐化愈伤的愈伤组织。
有益效果
本发明公开了一种建立水稻悬浮细胞系的方法，在悬浮培养初期通过离心收集从愈伤组织上脱落下来的细胞进行继续悬浮培养而获得进一步培养所需要的小颗粒愈伤，而传统方法是在保留接种愈伤的情况下不断更换部分旧培养液从而使小颗粒愈伤富集，与传统方法相比，本发明的方法可缩短悬浮细胞培养进程，从而提高悬浮细胞系的胚性和减少无性系变异。
附图说明
图1利用初期悬浮培养时从愈伤组织上脱落下来的细胞继代培养获得的愈伤组织；
图2初步建立的悬浮细胞系，显示颗粒变得较细，上清比较澄清；
图3最终建立的悬浮细胞系(培养物置于150ml三角瓶中，为4个三角瓶的培养物混合而得)；
图4利用体视镜(蔡司SteREO Discovery.V20荧光体视镜)拍摄的最终建立的悬浮细胞系中的细胞团，比例尺500微米。
具体实施方式
下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
实施例1水稻品种Kasalath悬浮细胞系的建立
通过如下步骤获得Kasalath悬浮细胞系：
1、接种用胚性愈伤的获得
以Kasalath成熟种子为外植体进行愈伤组织诱导，参照Toki等的方法[Toki S,Hara N,Ono K,et al..Plant J,2006,47(6):969-976]进行愈伤诱导，培养基为N6D固体培养基，1周后切下愈伤在相同培养基中继代，之后的继代中(每2周继代1次)注意选择结合松散易碎、质地较硬、颗粒较细的胚性愈伤，继代培养2月后用于悬浮细胞培养，选择在新鲜培养基(N6D固体培养基)上生长10-12天的新鲜胚性愈伤进行悬浮培养。
2、悬浮细胞培养
1)将3-5g水稻胚性愈伤组织接种于30ml NBL液体培养基中，NBL液体培养基成分见表1所示，25-30℃条件下，以80-110转每分钟的转速在摇床中振荡培养；
表1NBL培养基成分
1添加ABA有利于悬浮细胞分离获得的原生质体在培养过程中更容易存活和分裂。
2加入特美丁以防污染。
NBL培养基的配制方法：
铁盐、微量元素、有机物配成100倍母液；2,4-D配成100mg/L母液；ABA用乙醇溶解，配成1万倍母液；Timentin用无菌水配成1000倍母液；其他组分按需直接称量固体；配制时量取或称取所有组分，通过搅拌助溶和混匀，用水稀释至90％终体积，用1M KOH溶液调pH至5.8后用水定容至终体积，过滤除菌，4度冰箱保存。
2)步骤1中述及的培养物在8天悬浮培养后培养液将变得浑浊，用40目细胞筛除去大颗粒愈伤，收集悬浮液并在500转每分钟转速下离心5分钟，收集沉淀物，进行下一步操作；
3)保留旧培养基10ml，添加相同成分新鲜培养基20ml(NBL液体培养基)，将收集的沉淀物悬浮，按照步骤1中描述的温度和转速继续悬浮培养，每8天继代一次，每次继代时均离心收集悬浮物，并进行本步骤前述相同的操作，继代培养4次后培养液底部出现较多愈伤，如图1所示，此时进行下一步操作；
4)移除20ml旧培养液，加入等体积相同成分新鲜培养液(NBL液体培养基)，按照步骤1中描述的温度和转速继续悬浮培养，7-10天继代1次，继代2次，每次继代进行本步骤前述相同的操作，直至培养基底部小颗粒细胞团大量产生，同时培养液变得较澄清，如图2所示，此时进行下一步操作；
6)用巴氏吸管吸取其中小颗粒继代培养，按旧培养液：新培养液为1：2的比例添加培养液(NBL液体培养基)，按照步骤1中描述的温度和转速继续悬浮培养，7-10天继代一次，继代2次后，转入AA培养基中继代，AA培养基成分见表2，培养方法保持不变，每次吸取其中小颗粒继代，在继代40天左右多数细胞团直径在0.5mm以下，如图3和图4所示。
表2AA培养基成分
1添加ABA有利于悬浮细胞分离获得的原生质体在培养过程中更容易存活和分裂。
2加入特美丁以防污染。
AA培养基的配制方法：
铁盐、微量元素、有机物配成100倍母液；氨基酸配成10倍母液；2,4-D和Kinetin配成100mg/L母液；ABA和GA3均用乙醇溶解，分别配成1万倍和2万倍母液；Timentin用无菌水配成1000倍母液；其他组分按需直接称量固体；配制时量取或称取除GA3外的所有组分，通过搅拌助溶和混匀，用水稀释至90％终体积，用1M KOH溶液调pH至5.8后用水定容至终体积，过滤除菌，4度冰箱保存；GA3在每次使用前临时加。
在本实施离中从接种到悬浮细胞系最终建成约经历4个月时间，而用传统方法即通过在保留接种愈伤的情况下不断更换部分旧培养液从而使底部小颗粒愈伤富集的方法，经历了7个多月，因而本发明的方法有缩短悬浮细胞系建立进程的益处。
在建成悬浮细胞后即对其细胞团的再生性和白化率进行了检测。先将悬浮细胞在Hiei和Komari描述的nN6C培养基[Hiei Y,Komari T.Nat Protoc,2008,3(5):824-834](去除其中抗生素成分)中增殖与预分化，然后转移至无抗生素的RE-III再生培养基[参见文献Toki S,Hara N,Ono K,et al.Plant J,2006,47(6):969-976]中再生，观察小芽出现率及白化率。用本法建成的悬浮细胞(经历了4个月)其再生率为28.8％(80个愈伤有23个可再生)，小芽白化率8.6％(23个小芽中有2个白化)，而通过常规方法建成(经历7个多月悬浮培养)悬浮细胞其再生率只有17.5％(80个愈伤中有14个可再生)，白化率为21.4％(14个小芽中有3个白化)，因此，通过缩短培养进程，本发明提供的方法可提高悬浮细胞系的胚性和减少无性系变异。

Claims (10)

1.一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)接种用胚性愈伤组织的获得；
(2)将获得的水稻胚性愈伤组织接种于培养基中，在摇床中振荡培养；
(3)将培养物中的大颗粒愈伤筛除，收集悬浮液，离心，收集沉淀物；
(4)添加新鲜培养基，将收集的沉淀物悬浮培养，悬浮培养过程中间隔不断添加新鲜培养基，继代培养多次后，直至培养基底部小颗粒细胞团大量产生，同时培养液变得较澄清；
(5)吸取培养液中的小颗粒进行继代培养，添加培养基，继续悬浮培养，继代2次后，转入不同培养基中继代，吸取其中小颗粒继代培养数次，即获得水稻悬浮细胞系。
2.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(1)中以Kasalath成熟种子为外植体进行愈伤组织诱导。
3.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(2)中具体操作为：将3-5g水稻胚性愈伤组织接种于30ml培养基中，25-30℃条件下，以80-110转每分钟的转速在摇床中振荡培养。
4.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的培养基为NBL液体培养基。
5.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养物在悬浮培养后培养液变得浑浊时，过40目细胞筛筛除大颗粒愈伤，收集悬浮液，离心5分钟，收集沉淀物。
6.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(4)中具体操作包括：
(41)保留部分旧培养基，添加相同成分新鲜培养基，将步骤(3)中收集的沉淀物悬浮，悬浮培养条件和温度与步骤(2)相同，继代培养4次后，当培养液底部出现较多愈伤时，进行下一步操作；
(42)无需离心直接移除部分旧培养液，加入等体积新鲜培养液，培养条件不变，继续悬浮培养，相同方法继代2次，直至培养基底部小颗粒细胞团(直径1mm以下)大量产生，同时培养液变得较澄清。
7.根据权利要求6所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(41)中继代时需要1000rpm离心5min收集悬浮物，并保留旧培养基10ml，添加相同成分新鲜培养基20ml。
8.根据权利要求6所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(42)中移除20ml旧培养基，加入等体积相同成分新鲜培养基。
9.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(5)中用巴氏吸管吸取其中小颗粒(直径1mm以下)进行继代培养。
10.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(5)中按照旧培养基：新培养基比例为1：2添加新鲜培养基，每次吸取其中小颗粒继代(直径1mm以下)，在继代培养40天左右，多数细胞团直径在0.5mm以下时即获得水稻悬浮细胞系。
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