KR101093415B1 - 식물세포주를 이용한 비스유제놀 합성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물전환(biotransformation)을 통하여 비스유제놀(bis-eugenol)을 합성하는 방법에 대한 것으로, 특히 식물세포주를 이용한 비스유제놀 합성 방법과 생산방법 및 이에 따라 제조된 비스유제놀에 대한 것이며, 더욱 상세하게는 식물세포주를 이용하여 유제놀로부터 강항균, 피부미백효과, 항산화효과 등이 우수한 비스유제놀(bis-eugenol)을 합성하는 방법에 대한 것이다.

Description

식물세포주를 이용한 비스유제놀 합성 방법{Synthesis of bis-eugenol from eugenol with suspension cell of Kalopanax pictus Nakai}

본 발명은 생물전환(biotransformation)을 통하여 비스유제놀(bis-eugenol)을 합성하는 방법에 대한 것으로, 특히 식물세포주를 이용한 비스유제놀 합성 방법과 생산방법 및 이에 따라 제조된 비스유제놀에 대한 것이며, 더욱 상세하게는 식물세포주를 이용하여 유제놀로부터 강항균, 피부미백효과, 항산화효과 등이 우수한 비스유제놀(bis-eugenol)을 합성하는 방법에 대한 것이다.

식물세포주를 이용한 천연물의 생화학적 변형은 화학적 합성으로는 어려운 높은 위치 선택성과 키랄 선택성, cofactor 이용의 편의성을 가지기 때문에 많은 이로운 점을 가지고 있다.

다양한 유전자를 가지고 있는 식물 세포주는 합성하기 어려운 천연물들을 변형할 수 있는 유용한 도구이다. 이와 더불어 식물 세포주를 이용하여 생물전환(biotransformation)을 실시하면, 종래에 유기합성 방법으로 생합성하는 경우 중간에 들어가는 값 비싼 cofactor를 이용하지 않고, 식물세포주의 것을 사용하기 때문에 생합성 비용을 절약할 수 있는 이로운 점을 가지고 있다.

식물세포주를 이용한 생물전환 방법을 이용하면 다양한 식물이 이차대사산물들을 합성 할 수 있다. 다양한 이차대사산물들은 인간에 다양한 영향을 미치는 많은 병원성에 대하여 많은 생물학적 활성을 나타내고 있다. 이와 같이 만들어지는 물질들은 새로운 의약품 및 화장품 등과 같은 다양한 제품을 개발을 위한 원료물질로 사용되고 있다. 대표적으로 주목(Japanese Yew)의 식물 세포주를 사용하여 생물전환 방법으로 만들어진 항암제인 taxol은 자궁암에 대한 아주 높은 항암효과를 보이는 고부가가치의 물질로 알려져 있다.

한편, Eugenol은 항산화 활성이 우수하여 화장품등 산업분야에서 제품생산에 활용하고자 하나 세포독성이 있어 사용이 제한적 이었다. Eugenol은 여러 종류의 dimer로 전환이 보고되고 있는데 주로 유기합성방법을 이용한 합성 이었다. 유기합성 방법은 과정 중 인체에 해로운 독성물질을 첨가하여 합성하기 때문에 인체에 관련된 사용이 제한된다.

그리고, 비스유제놀(bis-eugenol)은 일부의 식물에서 한정적으로 발견되어 지고 있으며, eugenol의 derivatives중 하나로 eugenol이 2개 dehydration된 o,o’-dimethyl-dehydrodieugenol 으로써, 구강항균, 항산화 효과, 항염효과, 미백효과, 항암효과 등과 같은 다양한 생리적 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 하지만, 종래의 비스유제놀 생산방법은 하기 [반응식 1]에 따른 유기합성 방법을 이용해야 하기 때문에, 이를 상품화 및 인체에 사용하기 위해서는 합성 중에 들어가는 유독성물질들을 제거하는 과정이 필수불가결하다는 문제점이 있다.

[반응식 1]

상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 유제놀로부터 비스유제놀을 간단하고 용이하게 얻고자 하는 것이 목적이다.

그리고, 본 발명은 강항균, 피부미백효과, 항산화효과 등이 우수한 bis-eugenol을 대량으로 생산할 수 있는 새로운 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 독성물이 전혀 사용되지 않았고, 간단한 추출과정을 거침으로 바로 사용가능한 bis-eugenol 을 합성하고 생산하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 음나무(Kalopanax pictus) 조직이 배양된 배양액을 준비하는 단계; 및 상기 준비된 배양액에 유제놀(eugenol)을 첨가하고 배양하는 단계;를 포함하는 비스유제놀(bis-eugenol) 합성 방법이다.

그리고, 본 발명의 다른 실시형태는 상기한 비스유제놀 합성 방법에 있어서, 상기 유제놀을 첨가하고 배양한 배양액에 에틸아세테이트(EtOAc)를 첨가한 후 교반하는 단계; 및 상기 교반한 상등액을 회수하고 감압증류기를 이용하여 에틸아세테이트를 증발시키는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비스유제놀 생산 방법일 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시형태는 음나무 조직이 배양된 배양액에 유제놀을 첨가하고 배양시킴으로써 합성된 비스유제놀을 포함하는 비스유제놀 조성물인 것도 가능하다.

또한, 본 발명은 상술한 비스유제놀 합성 또는 생산 방법에 의해 합성되거나 생산된 비스유제놀을 포함하는 것을 특징으로 하는 비스유제놀 조성물일 수도 있다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

상기한 본 발명에 의하면, 식물세포주를 이용한 생물전환을 통하여 유제놀로부터 비스유제놀을 간단하고 용이하게 얻을 수 있는 효과가 있다.

그리고, 본 발명에 따라 천연 식물세포주를 이용한 생합성 방법은 높은 기질반응성과, 기질반응선택성을 가지기 때문에, 강항균, 피부미백효과, 항산화효과 등이 우수한 bis-eugenol을 대량으로 생산할 수 있는 새로운 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 합성되고 생산된 bis-eugenol은 식물세포를 이용하여 생물전환된 것이기 때문에, 독성물이 전혀 사용되지 않았고, 간단한 추출과정을 거침으로 바로 사용가능한 장점을 가지고 있다.

도 1은 본 발명에 따른 비스유제놀 생산 방법에 따라 얻은 결과물(B)과 출발물질인 유제놀(A)에 대한 HPLC 분석 결과의 일례를 나타내는 그래프이고,
도 2는 본 발명에 따른 비스유제놀 생산 방법에 따라 얻은 결과물에 대한 질량분석 결과의 일례를 나타내는 그래프이고,
도 3은 본 발명에 따른 비스유제놀 생산 방법에 따라 얻은 결과물에 대한 NMR 분석 결과의 일례를 나타내는 그래프이고,
도 4는 본 발명에 따른 비스유제놀 생산 방법의 배양시간에 따른 유제놀과 비스유제놀의 생물전환효율을 나타내는 그래프이다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 식물세포주를 이용하는 생물전환 방법으로 bis-eugenol 을 합성하고 생산하는 것에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 하기 [반응식 2]에 따라 구조식(1)으로 표시되는 유제놀(eugenol)을 구조식(2)으로 표시되는 구강항균, 피부미백효과, 항산화효과 등이 우수한 비스유제놀(bis-eugenol)로 제조하는 기술이다.

[반응식 2]

즉, 본 발명은 식물세포인 음나무의 현탁배양 세포주를 이용하여 생물전환을 실시하는 방법에 의해, eugenol을 기질로하여 bis-eugenol을 생산하는 기술이다. 이를 위하여, 본 발명은 음나무의 세포배양법과 생물전환 방법을 제공하고, 최종생합성 화합물의 생산방법 및 분리정제 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 비스유제놀(bis-eugenol) 합성 방법은, 먼저 음나무(Kalopanax pictus) 조직이 배양된 배양액을 준비하는 단계;를 거치며, 이어서 이렇게 준비된 배양액에 유제놀(eugenol)을 첨가하고 배양하는 단계;를 거친다.

여기서, 상기 배양액을 준비하는 단계는, 음나무(Kalopanax pictus)의 세포배양액을 준비하는 것으로써, 고체배지를 이용하여 음나무 조직으로부터 캘러스(callus)를 유도하는 단계; 및 상기 유도된 캘러스를 액체배지에 넣고 15~30℃의 온도로 배양시켜서 배양액을 준비하는 단계;를 포함하여 이루지는 것이 바람직하다. 음나무 조직으로는 음나무의 잎, 줄기, 뿌리 등이 다양하게 이용될 수 있고, 이것으로부터 캘러스를 유도하는 것은 생물전환을 위한 유용한 성분을 더욱 풍부하게 추출하여, 비스유제놀을 더욱 우수한 효율로 합성하고 생산하기 위한 것이다. 특별히, 상기 캘러스를 액체배지에 넣고 배양시키는 온도는 15~30℃가 바람직하고, 20±2℃ 정도가 더욱 바람직한데, 이는 음나무 식물세포가 성장하기 위한 최적의 적정온도이기 때문이다.

그리고, 상기 유제놀을 첨가하고 배양하는 것은, 상기와 같이 준비된 음나무 세포배양액을 이용하여 유제놀을 생물전환시키는 것으로써, 상기 유제놀을 첨가하고 6~18시간 동안 배양하는 것이 바람직하다. 후술하는 실험예 3에서와 같이, 본 발명자들은 배양시간에 따른 생물전환 효율을 측정하였고, 그 결과 최소 6시간이 지나야 약 50%정도의 생물전환 효율을 달성할 수 있으며, 최고 18시간 후에는 대부분이 bis-eugenol로 전환되기 때문이다.

이러한 본 발명에 의하면, 식물세포주를 이용한 생물전환을 통하여 유제놀로부터 비스유제놀을 간단하고 용이하게 얻을 수 있는 효과가 있다. 그리고, 본 발명에 따라 천연 식물세포주를 이용한 생합성 방법은 높은 기질반응성과, 기질반응선택성을 가지기 때문에, 강항균, 피부미백효과, 항산화효과 등이 우수한 bis-eugenol을 대량으로 생산할 수 있는 새로운 방법을 제공할 수 있다.

이와 함께, 본 발명은 상술한 비스유제놀 합성 방법에 있어서, 상기 유제놀을 첨가하고 배양한 배양액에 에틸아세테이트(EtOAc)를 첨가한 후 교반하며, 이어서 상기 교반한 상등액을 회수하고 이렇게 회수된 상등액으로부터 감압증류기를 이용하여 에틸아세테이트를 증발시키는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비스유제놀 생산 방법일 수 있다.

즉, 상기와 같이 유제놀을 첨가하고 배양시키면 비스유제놀이 합성되지만, 이것은 비스유제놀이 배양액 속에 아직 그대로 남아있는 형태이고, 상기 배양액으로부터 목적으로하는 비스유제놀만을 추출하는 것이 가능하다. 본 발명은 특별히 에틸아세테이트(EtOAc)를 추출용액으로 사용한 것이 특징인데, 일반적인 추출방법의 경우에는 알콜, 메탄올 에틸아세테이트 등을 다양하게 이용할 수 있지만, 본 발명에 따른 bis-eugenol의 경우에는 배양액에서 추출시 에틸아세테이트를 이용해야만 효과적인 추출이 이루어짐을 확인하였다. 즉, 다른 용매를 사용하면 비스유제놀이 효과적으로 추출이 되지 않았다.

한편, 본 발명은 음나무 조직이 배양된 배양액에 유제놀을 첨가하고 배양시킴으로써 합성된 비스유제놀을 포함하는 것을 특징으로 하는 비스유제놀 조성물일 수 있다. 이러한 본 발명은 상술한 바와 같이 생물전환 방법에 의해 유제놀로부터 비스유제놀을 얻은 것이 특징이다.

그리고, 본 발명은 상술한 비스유제놀 합성 방법에 의해 합성된 비스유제놀을 포함하는 것을 특징으로 하는 비스유제놀 조성물일 수 있고, 상술한 비스유제놀 생산방법에 의해 생산된 비스유제놀을 포함하는 것을 특징으로 하는 비스유제놀 조성물도 가능하다.

이와 같이, 본 발명에 따라 합성되고 생산된 bis-eugenol은 식물세포를 이용하여 생물전환된 것이기 때문에, 독성물이 전혀 사용되지 않았고, 간단한 추출과정을 거침으로 바로 사용가능한 장점을 가지고 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 시약 준비

본 실시예에서 사용한 시약으로써, 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D), Murashige and Skoog (MS), sucrose, agar는 독일의 Darmstast사에서 구입하여 사용하였다. Eugenol, formic acid는 Sigma Aldrich (CA, USA)에서 구입하였고, acetonitrile (ACN), ethyl acetate (EtOAc), chloroform (CHCl3), ethanol(EtOH)은 Fluka (Osaka, Japan)사로 부터 구입하여 사용하였다.

실시예 2: 음나무 세포배양 및 생물전환을 이용한 비스유제놀(bis-eugenol)의 합성 및 생산

먼저, 1/2 MS(Murashinge and Skoog, 1962) 4.4 2,4-D, 2% sucrose, 1,5% agar 배지를 이용하여, 음나무(Kalopanax pictus)로부터 캘러스를 유도하였고, 이렇게 유도된 캘러스를 1/2 MS 4.4 2,4-D, 2% sucrose가 포함된 액체배지에 넣은 다음, shaking incubator에서 120 rpm으로 3주 동안 25±1℃로 암소에서 배양하여 음나무 세포 배양액을 얻었으며, 이를 후술하는 생합성에 사용하였다.

즉, 비스유제놀 (bis-eugenol) 생합성을 위하여 상기와 같이 얻은 음나무 세포 배양액에 유제놀(eugenol)을 첨가하고 3일간 25±1℃로 암소에서 배양하여 생합성을 유도하였다.

이어서, 상기 생합성을 유도한 배양액에 동량의 에틸아세테이트 (EtOAc)를 첨가한 후 교반하였으며, 그런 다음 그 상등액인 에틸아세테이트층을 회수하고 감압증류기에서 에틸아세테이트를 날려서 비스유제놀을 농축하였다.

실험예 1: HPLC를 이용한 생합성 결과 확인

상기 실시예 2에 따라 농축된 비스유제놀을 대상으로 TLC 확인 후 HPLC에서 분석하였다. 분석기기는 Varian HPLC를 이용하였으며, 분석 조건은 용매 A (0.1% formic acid+증류수)와 용매 B (0.1% formic acid+acetonitrile)를 이용하여 10% B; 0-10분 30% B; 10-25분 40% B; 25-40분 50% B; 40-50분 60% B, and 50-65분 10% B로 실시하였다. 유속은 1.0ml/min, UV 280nm 파장에서 분석하고, injection volume은 10였다.

그 결과는 도 1에 나타난 바와 같다. 도 1은 본 발명에 따른 비스유제놀 생산 방법에 따라 얻은 결과물(B)과 출발물질인 유제놀(A)에 대한 Varian HPLC 분석 결과의 일례를 나타내는 그래프이고, 도 1의 B 그래프에서 "EPR"은 본 발명에 따른 비스유제놀 생산 방법에 따라 얻은 결과물(B)의 분석 결과를 뜻한다. 여기에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 비스유제놀 생산 방법에 따라 얻은 결과물(B)의 경우 출발물질인 유제놀(A)에서 관찰되지 않은 새로운 peak 가 만들어진 것을 알 수 있다.

실험예 2: MASS, NMR를 이용한 생합성 결과 확인

구체적인 결과 확인을 위하여, 상기 실시예 2에 따라 농축된 비스유제놀을 Varian LC-MS/MS에서 flow rate이 0.2 mL/min로 분석하였다. 이동상은 A (0.1% formic acid in water)와 B (0.1% formic acid in acetonitrile)를 이용하여 gradient를 실시하여 10% B 2분, 40% B 10분, and 70% 20분으로 600 V에서 실시하였다. Spray needle voltage는 5 kV이고 capillary voltage는 80 V이며 capillary temperature는 220°C 로 하였다. Full scan mass spectra은 50-2000 m/z 범위에서 기록하였다.

그 결과는 도 2에 나타난 바와 같다. 도 2는 본 발명에 따른 비스유제놀 생산 방법에 따라 얻은 결과물에 대한 질량분석 결과의 일례를 나타내는 그래프이고, 여기에 도시된 바와 같이, 325의 값을 보였는데, 이것은 비스유제놀에 대한 결과값과 상당히 유사하다.

또한, 식물세포 반응액에서 생물전환을 확인하고자, Ogata (Ogata et al., 2000)가 확인한 방법을 이용하여, 상기 실시예 2에 따라 농축된 비스유제놀을 대상으로 NMR 분석을 실시하였다.

그 결과는 도 3에 나타난 바와 같다. 도 3은 본 발명에 따른 비스유제놀 생산 방법에 따라 얻은 결과물에 대한 NMR 분석 결과의 일례를 나타내는 그래프이고, 여기에 도시된 바와 같이, 그 결과는 0.93(t, 3H, J57.3Hz,9-H), 1.61(m,2H,J57.3,7.9Hz,8-H), 2.51(t,2H,J57.9Hz,7-H)와 같았다. 이것을 기존의 bis-eugenol에 대하여 얻은 H-NMR 값과 비교분석한 결과, 동일한 결과를 보이는 것으로 나타났다.

실험예 3: 생물전환효율 측정

이와 함께, 상기 실시예 2에 따라 얻은 음나무 세포 배양액에 유제놀(eugenol)을 첨가하고 배양시키는 배양시간을 달리하여, 그에 따른 생물전환효율을 계산하였다.

그 결과는 도 4에 나타난 바와 같다. 도 4는 본 발명에 따른 비스유제놀 생산 방법의 배양시간에 따른 유제놀과 비스유제놀의 생물전환효율을 나타내는 그래프이고, 여기에 나타난 바와 같이, 배양 후 6시간이 지나면 약 50%정도의 생물전환 효율을 보여주었으며, 18시간 후에는 처음에 넣어준 기질의 대부분이 bis-eugenol로 전환되는 것을 확인할 수 있다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

본 발명은 식물세포주를 이용한 생물전환을 통하여 유제놀로부터 비스유제놀을 간단하고 용이하게 얻을 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

Claims (7)

1. 음나무(Kalopanax pictus) 조직이 배양된 배양액을 준비하는 단계; 및
   상기 준비된 배양액에 유제놀(eugenol)을 첨가하고 배양하는 단계;를 포함하는 비스유제놀(bis-eugenol) 합성 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 배양액을 준비하는 단계는,
   고체배지를 이용하여 음나무 조직으로부터 캘러스(callus)를 유도하는 단계; 및
   상기 유도된 캘러스를 액체배지에 넣고 15~30℃의 온도로 배양시켜서 배양액을 준비하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 비스유제놀 합성 방법.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 유제놀을 첨가하고 배양하는 것은,
   상기 유제놀을 첨가하고 6~18시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 비스유제놀 합성 방법.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 유제놀을 첨가하고 배양한 배양액에 에틸아세테이트(EtOAc)를 첨가한 후 교반하는 단계; 및
   상기 교반한 상등액을 회수하고 감압증류기를 이용하여 에틸아세테이트를 증발시키는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비스유제놀 생산 방법.
   
   
   
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