JP6856223B2 - ヒト毛乳頭細胞増殖用組成物 - Google Patents

Description

本発明は，ヒト毛乳頭細胞増殖用組成物等に関する。さらに詳しくいうと本発明は，エビネより抽出された化合物であるglucoindicanやcalanthosideを有効成分とするヒト毛乳頭細胞増殖用組成物等に関する。

エビネは，日本，中国，台湾，韓国などの山地の陰地に自生するラン科（Orchidaceae）の多年草である。エビネは，その全草または根茎が九子連環草と称され，扁桃腺，痔癒および打撲傷の治療薬として用いられている。
また，エビネの根茎には，ジフェナントレン化合物やインドール配糖体などの有用な成分が含まれていることが知られている（特許文献１から３）。しかしながら，全ての成分について明らかになっているものではなく，未だ知られていない有用成分を含む可能性が秘められているものである。

特開平１０−２６５４２５号公報 特開平１０−２６５４９２号公報 特開平１０−２６５４９３号公報 特開２００５−１７９２１６号公報 特開２００５−２６５４９３号公報

上記事情を背景として本発明では，エビネの根茎に含まれる有用成分のさらなる探索，ならびに見い出された有用成分の利用方法の発見を課題とする。

発明者らは，鋭意研究の結果，エビネの根茎に含まれる複数の化合物を明らかにした。加えて，これらの化合物のうち，glucoindicanならびにcalanthosideが，毛乳頭細胞増殖効果を有することを見い出し，発明を完成させたものである。

本発明は，以下の構成からなる。
本発明の第一の構成は，下記化７，化８で示される化合物のいずれか又は複数からなるヒト毛乳頭細胞増殖用組成物である。

本発明の第二の構成は，前記化合物のいずれか又は複数が，天然原料由来である第一の構成に記載のヒト毛乳頭細胞増殖用組成物である。
本発明の第三の構成は，天然原料が，エビネである第二の構成に記載のヒト毛乳頭細胞増殖用組成物である。
本発明の第四の構成は，化７で示される化合物のヒト毛乳頭細胞増殖のための医薬品，医薬部外品，サプリメント，健康食品のいずれかの製造における有効成分としての使用である。
本発明の第五の構成は，化８で示される化合物のヒト毛乳頭細胞増殖のための医薬品，医薬部外品，サプリメント，健康食品のいずれかの製造における有効成分としての使用である。

本発明により，エビネの根茎に含まれる有用成分のさらなる探索ならびに見い出された有用成分の利用方法の発見が，発明者らによりなされたものである。
すなわち，エビネの根茎に含まれる有用成分として，複数の化合物が抽出され，これらの化合物のうち，glucoindicanならびにcalanthosideは，ヒト毛乳頭細胞増殖効果を有することが発明者らにより明らかとなった。これより，これらを有効成分としてヒト毛乳頭細胞増殖にかかる組成物の提供が可能となったものである。

エビネ原料からメタノール抽出をへて，各化合物を抽出する方法を説明した図 エビネ原料からメタノール抽出をへて，各化合物を抽出する方法を説明した図 抽出された各化合物について，ヒト毛乳頭細胞における増殖効果を検討した結果を示した図 ミノキシジル硫酸塩（陽性コントロール）を用いて，ヒト毛乳頭細胞における増殖効果を検討した結果を示した図

本発明のヒト毛乳頭細胞増殖用組成物について説明を行う。

本発明のヒト毛乳頭細胞増殖用組成物は，化７，化８で示される化合物（以下，これらをまとめて「有効成分化合物」という）のいずれか又は複数を有効成分とすることを特徴とする。

本発明において有効成分化合物は，それぞれ化７がglucoindican，化８がcalanthosideと称される既知の化合物である。
本発明のヒト毛乳頭細胞増殖用組成物は，これらの有効成分化合物の新規用途として，ヒト毛乳頭細胞増殖作用が発明者により見い出されたことに基づくものである。同時に，ヒト毛乳頭細胞増殖を特徴とする化７ないし化８の使用方法にかかる発明が，発明者により完成されたものである。

本発明に用いられる有効成分化合物は，そのままの形で有効成分として用いることができるが，本発明の趣旨に鑑み，生体内における代謝等を受けて化合物の構造を変化させ有効成分化合物として作用するなどの，いわゆるDDS化された有効成分化合物を含むものとして用いることもできる。

本発明において有効成分化合物は，化学的に合成したものを用いてもよいし，天然原料由来のものを用いてもよい。天然原料の場合は，エビネを原料として用いることができる。

エビネを原料として用いる場合，エビネの全草，好ましくは地下部（根茎）を用いればよく，これらをそのまま用いてもよいし，乾燥させた後，原料として用いてもよい。このエビネ原料について，溶媒を用いて抽出を行う。用いる溶媒としては，エビネ原料からの有効成分化合物の抽出が可能な限り特に限定する必要はなく，水ないし種々の有機溶媒を用いることができる。
溶媒として，水ないしメタノールやエタノールなどの水溶性アルコール，又はこれらの混合溶媒を用いることが好ましい。これにより，安価かつ効率的に，有効成分の抽出を行うことが可能となり，エビネ溶媒抽出物の製造コストを減少させる効果を有する。
有機溶媒として，最も好ましくは，エタノールを用いることができる。エタノールは，人体への毒性が低い有機溶媒であるため，エビネ溶媒抽出物や，これを原料に製造される医薬の安全性を向上させる効果を有する。

本発明において有効成分化合物を含む組成物とすることにより，ヒト毛乳頭細胞増殖効果を発揮するものである。
本発明において組成物とは，本発明の趣旨に基づきヒト毛乳頭細胞増殖効果の発揮が期待される，医薬品，医薬部外品，サプリメント，健康食品など様々な形態の製品を指すものとして定義される。

以下，本発明について，実施例を挙げて詳述するが，本発明を実施例に基づき限定的に解釈すべきでないことはいうまでもない。

＜＜実験例１，溶媒抽出物の作製＞＞
１．図１，ないし図２の手順に順じて，化合物の探索・抽出を行った。
２．まず，宮崎産エビネの地下部について，メタノールによる抽出を３回繰り返し行い，メタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液を減圧下溶媒留去してメタノール抽出エキスを得た。

３．図１に順じて，下記一連の操作を行った。
(1) メタノール抽出エキスについて，酢酸エチル／3% 酒石酸溶液にて分液を行った。
(2) 酢酸エチル層について，溶媒を留去し，さらに順相および逆相カラムクロマトグラフィー，次いでHPLCにて精製を行い，化合物１，化合物４を得た。
(3) 3% 酒石酸溶液層に炭酸水素ナトリウムを添加してpH9.0に調整後，クロロホルムにより，分液操作を行った。得られたクロロホルム層について，溶媒を留去し，さらに順相および逆相カラムクロマトグラフィー，次いでHPLCにて精製を行い，化合物２，３を得た。

４．また，図２に準じて，下記一連の操作を行った。
(1) 実験例１に記載の方法と同様の操作により，メタノール抽出エキスを得た。さらに，得られたメタノール抽出エキスについて，酢酸エチル／水にて分液を行った。
(2) 酢酸エチル層について，溶媒溶媒を留去し，さらに順相および逆相カラムクロマトグラフィー，次いでHPLCにて精製を行い，化合物５（不図示）を得た。
(3) 水層について，Diaion HP-20 カラムに通した後，水，メタノールの順で溶出を行い，メタノール溶出液を濃縮後，さらに順相および逆相カラムクロマトグラフィー，次いでHPLCにて精製を行い，化合物６，７，８を得た。

＜＜実験例２．ヒト毛乳頭細胞増殖促進試験＞＞
実験例１により見いだされた複数の化合物について，ヒト毛乳頭細胞にどのような影響を及ぼすかを調べることを目的に実験を行った。

＜実験方法＞
１．ペニシリンGおよびストレプトマイシンを含むDMEM培地により細胞の培養を行った。ヒト毛乳頭細胞（HFDPC）は，96穴マイクロプレートを用い，1.0×10⁴cells/100μL/wellにて，37℃，5%CO₂下，24時間培養を行った。
２．さらに，各化合物を含む培養液を，100μL/well加え，37℃，5%CO₂下，4日間，培養を行った。なお，医薬品として，育毛，発毛等を目的に使用されているミノキシジル硫酸塩を陽性対象として同様の操作を行った。
３．培養後，各wellにWST-8溶液（株式会社同仁化学研究所）を加え，37℃，5%CO₂下，培養を行い，細胞増殖の指標としてO.D.値（450-655nm）の測定を行った。

＜実験結果＞
１．各化合物の検討結果を図３に示す。
(1) メタノール抽出エキスについて，10μg/mLまではほとんど変化は見られなかったが，それ以降濃度に応じて，ヒト毛乳頭細胞の増殖効果が確認された。また，100μg/mLの濃度では，有意な細胞増殖の促進が観察された。
(2) 化合物１ならびに２については，ヒト毛乳頭細胞の増殖効果は認められず，それぞれ高濃度において細胞毒性が認められた。
(3) 化合物３について，100μMにて，増加傾向が確認された。
(4) 化合物６について，検討を行った濃度範囲において，ほとんど変化は見られなかった。
(5) 化合物７について，100μMにて，有意なヒト毛乳頭細胞の増殖効果が確認された。
(6) 化合物８について，一貫して100%を越えており，さらに100μMで，検討を行った化合物の中で最も強く，かつ有意なヒト毛乳頭細胞の増殖効果が確認された。

２．ミノキシジル硫酸塩の結果を図４に示す。ミノキシジル硫酸塩の10μMにおいて，約130%のヒト毛乳頭細胞の有意な増殖効果が確認された。

３．これらの結果から，エビネより抽出された化合物は，ミノキシジル塩酸塩と濃度は異なるものの，化合物７についてはミノキシジル硫酸塩にせまるほどの，化合物８においてはこれを超えるヒト毛乳頭細胞の増殖効果が確認された。
４．よって，化合物７ならびに化合物８が，ヒト毛乳頭細胞増殖をもたらす化合物として有用であることが示された。

Claims (5)

1. 化７，化８で示される化合物のいずれか又は複数からなるヒト毛乳頭細胞増殖用組成物。
   

   

   

   
   
2. 前記化合物のいずれか又は複数が，天然原料由来である請求項１に記載のヒト毛乳頭細胞増殖用組成物。
   
3. 天然原料が，エビネである請求項２に記載のヒト毛乳頭細胞増殖用組成物。
   
4. 化７で示される化合物のヒト毛乳頭細胞増殖のための医薬品，医薬部外品，サプリメント，健康食品のいずれかの製造における有効成分としての使用。
   
5. 化８で示される化合物のヒト毛乳頭細胞増殖のための医薬品，医薬部外品，サプリメント，健康食品のいずれかの製造における有効成分としての使用。
   

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