KR102201904B1 - 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 고수율로 추출하는 방법 - Google Patents

당잔대뿌리로부터 바닐린산을 고수율로 추출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당잔대뿌리로부터 바닐린산(vanillic acid)을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 반응표면분석법(RSM, Response Surface Methodology)을 이용하여 도출한 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 고수율로 추출하는 추출 조건에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명에 따른 방법은 건조된 당잔대뿌리를 분쇄하는 단계; 및 당잔대뿌리 분쇄물에 에탄올이 포함되지 않은 수용액을 넣고, 50~60℃의 온도에서 2~3시간 동안 당잔대뿌리추출물을 추출하는 단계를 포함한다.

Description

당잔대뿌리로부터 바닐린산을 고수율로 추출하는 방법{METHOD FOR EXTRACTING VANILLIC ACID WITH HIGH YIELD FROM ADENOPHORA STRICTA ROOT}
본 발명은 당잔대뿌리로부터 바닐린산(vanillic acid)을 고수율로 추출하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 반응표면분석법(RSM, Response Surface Methodology)을 이용하여 도출한 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 고수율로 추출하는 추출 조건에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당잔대뿌리로부터 추출된 바닐린산을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
당잔대(Adenophora stricta)는 한국에서는 7~9월경 전국 각지의 산과 들에서 자생하는 것으로 알려져 있다. 키는 50~100cm이고, 잎은 가장자리에 거친 톱니가 있으며 둥근 신장형으로 길이 3~7cm, 폭 1~3cm이다. 뿌리는 ‘사삼’이라고 하며, 도라지와 유사한 형태를 하고 있고, 인삼과 비슷한 약효가 있다고 알려져 있다. 사삼은 한방에서는 배농, 보중, 소종, 거담, 진해, 건위 및 강장제 등의 약재로 이용하고, 민간약으로도 기관지염, 기침, 대하증, 및 복통 등에 쓰인다.
당잔대를 이용하는 선행문헌으로서, 한국공개특허 제10-2017-0002437호에서는 사삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부외용제 조성물을 개시하고 있다. 또한, 한국출원특허 제10-2018-0039309호에서는 당잔대뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름개선용 화장료 조성물을 개시하고 있다.
바닐린산(Vanillic acid)은 향료로서 사용되는 디하이드록시벤조산 유도체(dihydroxybenzoic acid derivative)이며, 아래의 화학식을 갖는다.
[화학식 1]
Figure 112019087987609-pat00001
바닐린산은 천연물 중에 존재하는데, 인삼, 헛개나무, 더덕 등에 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며, 항암, 항염 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
바닐린산을 천연물에서 추출하는 방법으로서, 한국공개특허 제2012-0031706호는 추출 수율의 증진과 생리활성 성분을 효과적으로 용출시킬 수 있는 초고압을 이용하여 더덕 추출물을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 상기 특허에서는 더덕 추출물 중의 유용성분으로서, 총페놀, 플라보노이드, 바닐린산 등이 포함되어 있다고 개시한다.
하지만, 바닐린산은 향료로 주로 사용되고 있으며, 그 효능에 대한 연구는 미진한 상태이다.
본 발명자들은 바닐린산이 당잔대뿌리에 함유되어 있다는 것을 확인하고, 바닐린산을 함유한 당잔대뿌리 추출물의 산업적 가치는 상당할 것으로 기대하여 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명은 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 고수율로 추출하는 방법을 제공하고자 한다.
상기한 과제는, 건조된 당잔대뿌리를 분쇄하는 단계; 및 당잔대뿌리 분쇄물에 에탄올이 포함되지 않은 수용액을 넣고, 50~60℃의 온도에서 2~3시간 동안 당잔대뿌리추출물을 추출하는 단계를 포함하는, 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 추출하는 방법에 의해 달성된다.
바람직하게는, 당잔대뿌리 분쇄물에 정제수를 넣고, 50.16℃에서 2.91 시간 동안 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 당잔대뿌리추출물을 에틸아세테이트로 분획하여 바닐린산을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 과제는 상기 방법으로 추출된 바닐린산을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 의해 달성된다.
본 발명의 방법에 따르면, 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 고수율로 추출할 수 있다. 또한, 본 발명에서 추출된 바닐란산은 우수한 주름개선 효과를 갖는다.
도 1은 당잔대뿌리추출물의 에틸아세테이트 분획물의 HPLC 분석 그래프 및 화합물(compound) 1 내지 3의 UV 스펙트럼이다.
도 2는 당잔대뿌리추출물에서 유효성분인 화합물 2(바닐린산)을 분리하는 분리 모식도이다.
도 3은 당잔대뿌리추출물에서 분리된 화합물 2의 1H-NMR, 13C-NMR 및 LC-MS 그래프이다.
도 4는 온도, pH, 추출용매 농도 및 시간에 따른 추출물 중 바닐린산 함량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 반응표면분석법을 통한 당잔대뿌리로부터 바닐린산 추출 수율의 등고선도이다.
도 6은 반응표면분석법을 통한 당잔대뿌리로부터 바닐린산 추출 수율의 반응표면 그래프이다.
도 7은 본 발명에서 추출된 바닐린산의 주름 개선 효과를 보여주는 도면이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명은 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 고수율로 추출하기 위한 방법에 관한 것으로서, 반응표면분석법을 통해 바닐린산 추출의 최적의 조건을 설정하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 당잔대로부터 바닐린산을 효율적이고 고수율로 추출함으로써, 산업적 이용에 있어 경제적인 효과가 있을 것으로 기대된다. 특히, 반응표면분석법을 통하여 실험적으로 추출하고자 하는 물질의 추출되는 최적 조건을 확립함으로써 산업적으로 이용함에 있어 경제적 가치를 상승시킬 수 있을 것이다.
본 발명자들은 당잔대의 성분을 연구하던 중 당잔대뿌리 추출물이 바닐린산을 함유하고 있다는 것을 알게 되었고, 이를 산업적으로 이용하기 위해 추출의 최적조건을 확립하는 연구를 수행하였다.
본 발명에 따르면, 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 추출하는 방법은, 바닐린산 추출에 영향을 미치는 용매, 온도, 추출 시간의 조건을 달리하여 최적의 추출 조건을 확립하는 단계를 포함한다. 특히, 본 발명은 반응표면분석법을 통해 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 최적의 수율로 추출하는 방법을 제공한다.
반응표면분석법(RSM)은 선별 설계 또는 요인 설계를 사용하여 중요한 요인을 결정한 후, 선택된 유의한 요인에 대해 설계된 실험을 수행하여 각 요인의 최적값을 찾는 분석법이다. 반응표면분석법의 설계는 중심혼합회전설계법과 Box-Behnken design이 있다. 중심혼합회전설계법은 적은 실험 횟수로 2차 다항 모형의 회귀계수를 추정하는 설계법으로 실험 범위의 변경이 용이한 운전인자 변화에 대한 최적화에 적합하다. Box-Behnken design 설계법은 실험점의 수가 많지 않으면서도 직교불록을 만들기 용이하고, 2차 회귀 방정식을 구할 수 있기 때문에 흔히 이용된다. 또한 실험 조건이 너무 극단적인 경우 이를 제외할 수 있는 장점을 갖고 있다.
본 발명에서 사용된 당잔대뿌리는 재래시장을 포함한 일반시장의 한약건재상에서 구입하여 사용할 수 있다.
당잔대뿌리 추출물은 용매추출법으로 추출하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 탄소수 1~4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산 및 그의 혼합물로부터 선택된 용매를 사용하여 추출될 수 있다.
본 발명은 상기 당잔대뿌리 추출물로부터 바닐린산을 분리할 수 있는데, 다양한 크로마토그래피를 이용하여 분리할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 바닐린산은 상기 당잔대뿌리추출물로부터 에틸아세테이트를 용매로 하여 컬럼 크로마토그래피(Column Chromatography)를 이용하여 분리할 수 있다.
본 발명의 방법으로 추출된 바닐린산은 MMP-1 발현을 감소시켜 우수한 주름 개선 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 추출된 바닐린산을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
제조예 1: 바닐린산의 분리
당잔대뿌리추출물의 분획별 효능 평가한 결과 에틸아세테이트 분획층에서 활성을 나타내 에틸아세테이트 분획층에 활성 유효성분이 있을 것으로 예상하여 에틸아세테이트 층을 분리정제하였다.
건조된 당잔대뿌리를 분쇄하여 추출 플라스크에 넣고 70%(v/v) 에탄올을 이용하여 pH6의 조건에서 3시간 동안 추출을 진행하고 여과하여 얻어진 여액을 감압농축 및 동결건조시켜 당잔대뿌리 추출물을 제조하였다. 얻어진 당잔대뿌리추출물 20g을 정제수 200mL에 다시 녹인 후, 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 에틸아세테이트층을 분리하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다. 에틸아세테이트 분획물을 HP-20 daion resin과 전개용매로써 정제수 및 메탄올을 활용하여 컬럼 크로마토그래피(Column Chromatography)를 진행한 결과, 총 6개의 분획물(Fraction)로 분리하였다. 그 중 분획물(Fraction) 1을 Sephadex LH-20 resin과 정제수 및 메탄올을 전개용매로 하여 총 6개의 분획물(Fraction)으로 나누었으며 그 중 분획물(Fraction) 6을 Sephadex LH-20 resin과 디클로로메탄 및 메탄올을 전개용매로 하여 분리 정제하였고, HPLC 분석 결과, 화합물(compound) 1, 화합물(compound) 2, 화합물(compound) 3을 분리하였다. 확인된 화합물 1~3의 HLPC 분석 그래프 및 UV 스펙트럼을 도 1에 나타냈다. HPLC 분석 결과에 따라서, 상기 화합물 1~3 중 단일 화합물인 화합물 2(18.7mg)를 바닐린산 후보로 선택하였다.
화합물 2의 분리 과정을 도 2에 나타냈다. 화합물 2의 구조를 규명하기 위하여 1H-NMR과 13C-NMR 분석을 실시하였다. 각각의 신호(signal)를 통하여 유추하였을 때 화합물(Compound) 2는 바닐린산(Vanillic acid)로 확인하였다. 또한, 분자량을 예측하기 위하여 ESI-MS를 분석한 결과 분자량은 168.1로 확인하였다.
그 결과를 아래 도 2와 표 1에 나타냈다.
화합물 이름 바닐린산(Vanillic acid)
Figure 112019087987609-pat00002
화학식 C8H8O4
분자량 168.14
NMR data 13C-NMR (400 MHz, CD3OD) 1H- NMR (500 MHz, CD3OD)
Position
1
2
3
4
5
6
COOH
OCH3		 124.1
116.5
151.4
147.5
114.6
122.9
167.6
55.2		 -
7.58 (1H, d, J=2.0 Hz)
-
-
-
7.54 (1H, dd, J=8.5 Hz)
-
3.89 (3H, s)
실시예 1: 추출공정의 최적화 실험 계획
건조된 당잔대뿌리를 분쇄하여 추출플라스크에 넣고 용매, pH, 온도 및 시간 조건을 설정하기 위해, 도 4에 표시된 조건에서 각각 추출을 진행하고 여과지(Whatman No.2)로 여과한 후 0.45 μm 필터로 여과하여 추출물을 제조하였다. 이때 추출물 중 바닐린산의 함량은 Shiseido Capcell pack C18 column, 5 μm, 4.6 mm I.D.* 250 mm를 이용하여 분석하였다.
온도를 조절하는 경우, pH 6, 추출용매 에탄올 50%(v/v) 및 3시간으로, pH를 조절하는 경우 온도 70℃, 추출용매 에탄올 50%(v/) 및 3시간으로, 추출용매의 농도를 조절하는 경우 온도 70℃, pH 6 및 3시간으로, 시간을 조절하는 경우 온도 70℃, pH 6 및 추출용매 에탄올 50%(v/v)로 설정하였다.
반응표면분석(RSM)은 추출 조건에 따라 인자(factor)를 설정할 수 있다. 추출 수율에 영향을 주는 온도, pH, 추출용매(EtOH) 및 시간에 따른 추출물 중 바닐린산 함량을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4을 보면, 결과적으로 pH 변화는 바닐린산의 함량에는 크게 영향을 주지 않는 것으로 확인되어, 나머지 3가지 조건인 온도, 추출용매(EtOH) 및 시간을 인자(factor)로 설정하였다.
실험예 1: 반응표면분석을 위한 모델 구축 및 통계분석
당잔대뿌리로부터 고수율의 바닐린산을 추출하는 공정의 모델링과 최적화를 위해 3-level-3-factor 실험계획인 Box-Behnken design을 이용한 반응표면분석법(RSM)을 이용하였다.
추출공정에 중요한 독립변수(Xn)로 고려되는 인자는 온도(X1), 시간(X2) 및 EtOH(X3)로 설정하였고, 3단계로 부호화하였으며, Box-behnken design에 따라, 하기 표 2와 같이 15구간으로 설정하여 추출실험을 실시하였다.
Run
Order		 Coded Variables Actual Variables Observed Variables
X1 X2 X3 온도(℃) 시간(hr) EtOH 양 (%) vanillic acid (ppm)
1 0 1 -1 70 5 0 1016
2 -1 0 1 50 3 100 1048
3 1 -1 0 90 1 50 938
4 0 -1 -1 70 1 0 1026
5 1 0 -1 90 3 0 908
6 0 1 1 70 5 100 1029
7 1 0 1 90 3 100 937
8 -1 0 -1 50 3 0 1061
9 1 1 0 90 5 50 882
10 0 0 0 70 3 50 1020
11 0 0 0 70 3 50 1012
12 0 0 0 70 3 50 1027
13 0 -1 1 70 1 100 1024
14 -1 1 0 50 5 50 1019
15 -1 -1 0 50 1 50 1028
실험예 2: 바닐린산 함량의 변화 및 최적화
상기의 독립변수에 영향을 받는 종속변수는 바닐린산의 함량(Y1)으로 측정하여 회귀분석을 실시하였다.
반응표면분석 실험 설계 결과값을 회귀 분석을 통해 얻은 상관계수(Y1= 1019.67 - 61.38 X1 - 8.75 X2 + 3.38 X3 - 44.08 X1 2 - 8.83 X2 2 + 12.92 X3 2 - 11.75 X1 X2 + 10.5 X1 X3 + 3.75 X2 X3)를 이용하여 2차 다항 회귀 모형식을 얻었으며, 분산(ANOVA)을 수행하여 R2 값이 0.982인 것을 확인하여, 신뢰할 수 있는 결과값임을 확인하였다.
　 Sum of square Degree of freedom Mean square F-value P-value
< 바닐린산 >
Model 40214.4 9 4468.3 30.32 0.001
Residual error 147.4 5 147.4
Lack-of-fit 208.1 3 208.1 3.69 0.22
Purea error 56.3 2 56.3
Torla 40951.3 14 　 　 　
R2 = 0.982, adjusted R2 =0.950
얻어진 2차 다항 회귀 모형식을 이용하여 등고선도(도 5)와 반응표면 그래프(도 6)를 설계할 수 있었다.
등고선도(도 5)를 확인하였을 때, 시간과 에탄올(EtOH)의 조건에는 크게 영향이 없으나 온도에 영향이 큰 것을 확인하였다.
반응표면 그래프(도 6)를 확인하여 각 독립변수에 따른 바닐린산의 추출정도를 확인할 수 있으며, 조합한 결과 표 4와 같은 예측값이 측정되었다.
추출조건
온도 (℃) 시간 (hr) EtOH 양 (%)
50.16 2.91 0.00
바닐린산
예측값 (ppm)
1057.1
바닐린산을 고수율로 추출할 수 있는 조건은 온도 50.16℃, 시간 2.91 hr, 에탄올 0%임을 통계적으로 확인하였다.
실시예 3: 최적 추출 조건을 이용한 바닐린산 추출
당잔대뿌리로부터 바닐린산을 고수율로 추출할 수 있는 최적 조건을 반응표면분석법을 통해 확인하였고(표 4), 이를 확인하기 위해 예측된 조건인 온도 50.16℃, 시간 2.91 hr, 에탄올 0%의 정제수로 당잔대뿌리 추출물을 제조하였다. 그 결과, 바닐린산의 함량이 예측값인 1057.1 ppm과 유사한 1068.2 ppm을 함유함을 확인하였다.
추출조건
온도 (℃) 시간 (hr) EtOH 양 (%)
50.16 2.91 0.00
바닐린산
예측값 (ppm) 실제값 (ppm)
1057.1 1068.2
실험예 4: 바닐린산의 MMP -1 발현 저해 실험
인간 피부 섬유아 세포(HDFn)를 5 x 104 cells/well의 농도로 6 웰-플레이트에 분주한 후 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 안정화시켰다. PBS로 2번 헹군 뒤, PBS가 있는 상태에서 UVA를 1 J/cm2로 조사하였다. 2% FBS가 첨가된 배지로 교환과 동시에 시료를 처리하고 양성대조군으로 100 μM 아데노신(adenosine, 주름기능성고시원료)을 사용하였다. 실시예 3에서 추출된 당잔대추출물을 에틸아세테이트를 용매로 하여 바닐린산을 분리하여 본 실험에 사용하였다. 48 시간 동안 반응시킨 후 스크래서(scraper)를 이용하여 세포를 수집하였다.
1x 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하고 BCA assay로 단백질을 정량한 후 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시켰다. Gel상의 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시키고 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 블로킹하였다. 1 x TTBS 용액으로 3 회 세척하고 1차 항체(SPT, Abcam, USA)를 4℃에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 1 x TTBS로 3 회 세척하고 ECL용액을 반응시켜 Chemi Doc 기기로 밴드를 검출하였다. 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 SPT 발현량을 계산하였으며 Image J 1.47 software를 이용하여 수치화하였다. 그 결과는 표 6 및 도 7에 나타내었다.
구분 분류 농도 MMP-1 발현감소율(%)
대조군 1 Untreated - -
대조군 2 UV (1J/cm2) - -
실시예 3 Vanillic aicd 10 ug/ml 22.0
실시예 3 Vanillic aicd 30 ug/ml 112.4
비교예 Adenosine 100 ug/ml 141.4
대조군 2 및 대조군 1을 100%로 하였을 때와 비교하여, 실시예 3의 바닐린산 10ug/ml, 30 ug/ml의 농도에서 MMP-1 발현감소율이 각각 22.0%, 112.4%로 현저히 증가한 것을 확인하였다. 이로써 본 발명에서 추출된 바닐린산이 주름개선 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (4)

  1. 건조된 당잔대뿌리를 분쇄하는 단계; 및
    당잔대뿌리 분쇄물에 에탄올이 포함되지 않은 수용액을 넣고, 50~60℃의 온도에서 2~3시간 동안 당잔대뿌리추출물을 추출하는 단계를 포함하는, 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 추출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당잔대뿌리추출물 추출 단계는 당잔대뿌리 분쇄물에 정제수를 넣고, 50.16℃에서 2.91 시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는, 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 추출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 당잔대뿌리추출물을 에틸아세테이트로 분획하여 바닐린산을 추출하는 단계를 추가로 포함하는, 당잔대뿌리로부터 바닐린산을 추출하는 방법.
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