CN103621332A - 一种快速鉴定月季对白粉病抗性的方法 - Google Patents

一种快速鉴定月季对白粉病抗性的方法 Download PDF

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纪程
晏慧君
陈敏
张婷
周宁宁
李淑斌
蹇洪英
王其刚
张颢
唐开学
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Abstract

本发明提供一种快速鉴定月季对白粉病抗性的方法，以新鲜、健康、完整的月季嫩叶作为侵染材料，套袋隔离处理两周，收集白粉菌并调配成孢子悬浮液，然后对侵染材料进行接种、染色、制片，最后病情观察及病情指数统计，即得到该月季嫩叶对白粉病的抗性。通过本发明能准确、快速鉴别出不同基因型月季对白粉病的抗性情况，有效缩短了鉴定周期，且操作简单，可用于月季杂交育种后代种子的苗期快速抗性鉴定。

Description

一种快速鉴定月季对白粉病抗性的方法
技术领域
本发明属于植物抗病性鉴定技术领域，具体涉及月季白粉病离体抗性资源的方法。
背景技术
月季（Rosa hybrida）是蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）植物，目前已成为世界上最流行的庭园植物，也是重要的盆花及第一大切花。由白粉病菌（Podosphera pannosa, Pp）引起的白粉病害（Powdery mildew）则是全国乃至全球切花月季生产的第一大病害。
目前，生产中主要通过反复施用化学药剂来预防和控制其发生，这样不仅增加了生产成本，同时还造成了环境的污染和破坏。因此，不论从节能环保的方向考虑，还是从缩短育种周期等方向考虑，从现有的月季种质资源中发掘白粉病抗性性状及其相关基因并应用到现代月季的新品种选育中，从而培育具有白粉病抗性的月季新品种是今后月季遗传育种的主要方向之一。而白粉病抗性新品种选育的基础就是抗性资源的准确鉴定。目前，报道的月季白粉病抗性鉴定技术以叶片侵染观察法为主，该鉴定方法的不足之处有：鉴定周期过长、结果准确性不高、操作繁琐等。
发明内容
为克服现有技术中“叶片侵染观察法”对月季白粉病抗性鉴定存在鉴定周期过长、肉眼观察不准确、结果易受环境条件影响等不足，本发明提供一种准确、简单、快捷筛选月季抗白粉病资源的方法，为下一步的杂交育种亲本抗性鉴定、杂交后代抗性快速鉴定等提供技术支撑。
本发明通过以下技术方案实现：一种快速鉴定月季对白粉病抗性的方法，其特征在于经过下列各步骤：
（1）以新鲜、健康、完整的月季嫩叶作为侵染材料，用纸袋将嫩叶套袋隔离两周；
（2）将新采集的月季白粉病菌孢子放入灭菌蒸馏水中，调配成孢子含量数为1×104~1×105/ml的分生孢子悬浮液；
（3）取步骤（1）的月季嫩叶洗净并吸干表面水份，在每片嫩叶反面以滴液的方式，接种步骤（2）的分生孢子悬浮液20uL后，置于以灭菌蒸馏水为培养介质的培养皿中，封口后在温度为20～25℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间为15～16h/d的条件下培养48~72h；
（4）将步骤（3）培养后的嫩叶浸泡在三氯乙酸质量含量为0.10~0.15%的乙醇脱色液中，于37℃下恒温脱色36～48h，期间更换2～3次新的上述乙醇脱色液，直至嫩叶完全透明，再用考马斯亮蓝染色液进行染色6~10min，然后用蒸馏水漂洗，最后滴加甘油∶水=1∶1体积比的溶液进行制片；
（5）将步骤（4）的制片置于光学显微镜下，观察并以病情指数统计嫩叶上的白粉菌感染情况，即得到该月季嫩叶对白粉病的抗性。
所述步骤（4）的考马斯亮蓝染色液是质量浓度为0.10~0.15%的三氯乙酸水溶液∶质量浓度为0.50~0.70%的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液的体积比=1∶1。
所述步骤（5）的病情指数是：
0级为免疫，即无菌丝、无菌落；
1级为高抗，即菌丝长小于100um，无菌落；
2级为中抗，即菌落直径小于400um；
3级为中感，即菌落直径小于800um；
4级为易感，即菌落直径大于1mm。
与现有技术相比，本发明具备以下优点和显著效果：
（1）目前已报道的月季白粉病抗性鉴定方法，是以肉眼观测为鉴定依据，其鉴定结果重复性不好且准确率低，而本发明的“离体叶片显微观察法”是在月季叶片受白粉病菌侵染后，在人工控制的稳定条件下培养一定时间，以白粉菌显微形态观测为鉴定标准进行的。该鉴定方法可为月季白粉病抗病育种工作准确筛选出抗性的月季资源。
（2）目前，月季白粉病抗性鉴定从菌种的收集、侵染、发病、统计到鉴定结果至少需要14～21天，是一项周期性较长的工作。本发明采用分生孢子悬浮滴液、离体叶片营养补充，于一定的条件下培养48h后就能准确、快速鉴别出月季资源不同基因型的白粉病抗性情况，明显缩短了鉴定周期。
（3）目前，月季白粉病抗性鉴定有室内和室外鉴定法，室外鉴定法需要对鉴定材料进行扦插繁殖，还需统计一定量的样本重复数才能提高实验结果的重复性。本发明采用叶片离体鉴定法，操作简单、鉴定快速、实验结果准确。可用于月季杂交育种后代种子的苗期快速抗性鉴定，为月季抗性育种后期抗性资源的筛选提供简单、快速、准确的鉴定方法。
附图说明
图1为日本无刺野蔷薇叶片经白粉菌侵染48h后白粉菌与寄主互作显微结构图；
图2为大花香水月季叶片经白粉菌侵染48h后白粉菌与寄主互作显微结构图；
图3为金樱子月季叶片经白粉菌侵染48h后白粉菌与寄主互作显微结构图；
图4为‘杏花村’月季叶片经白粉菌侵染48h后白粉菌与寄主互作显微结构图；
图5为‘地平线’月季叶片经白粉菌侵染48h后白粉菌与寄主互作显微结构图；
图6为‘云粉’月季叶片经白粉菌侵染48h后白粉菌与寄主互作显微结构图；
图中，HA：吸器；C：一级菌丝；SH：二级菌丝。
具体实施方式
以下结合实例对本发明做进一步的描述。
实施例1
（1）以新鲜、健康、完整的日本无刺野蔷薇（R. multiflora ‘Inermis’）嫩叶作为侵染材料，提前两周用纸袋将嫩叶套袋，做隔离处理，以防止田间自然病原侵染；
（2）用毛笔将新鲜采集的月季白粉病菌孢子刷落至灭菌蒸馏水中，镜检统计数量并调配成孢子含量为1×104~1×105/ml的分生孢子悬浮液；
（3）将步骤（1）所得月季嫩叶洗净并吸干表面水份，每片嫩叶取步骤（2）制备的分生孢子悬浮液20uL，由于月季叶片正面革制化程度的增大加大了病菌侵入的难度，因此以滴液的方式对嫩叶反面进行接种，再将嫩叶置于以灭菌蒸馏水为培养介质的培养皿中，在嫩叶下放一片滤纸防止叶片漂动，用封口膜将培养皿封口后在温度为23℃、光强为2600lx、光照时间为16h/d的条件下进行的培养48h；
（4）将步骤（3）所得培养后的嫩叶浸泡在含0.10~0.15%三氯乙酸的乙醇脱色液中，于37℃下恒温脱色36～48h，期间更换2次乙醇脱色液，直至嫩叶完全透明，再用考马斯亮蓝染色液进行染色6~10min，其中考马斯亮蓝染色液是质量浓度为0.10~0.15%的三氯乙酸水溶液∶质量浓度为0.50~0.70%的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液的体积比=1∶1，然后用蒸馏水漂洗，最后滴加甘油∶水的体积比=1∶1的溶液进行制片；
（5）在光学显微镜下观察并以病情指数统计步骤（4）所得制片后嫩叶的白粉菌感染情况（如图1所示）：菌丝长小于100um，无菌落，即得到日本无刺野蔷薇对白粉病的抗性是1级高抗性。
实施例2
（1）以新鲜、健康、完整的大花香水月季（Rosa odorata var. Gigantea）嫩叶作为侵染材料，提前两周用纸袋将嫩叶套袋，做隔离处理，以防止田间自然病原侵染；
（2）用毛笔将新鲜采集的月季白粉病菌孢子刷落至灭菌蒸馏水中，镜检统计数量并调配成孢子含量为1×104~1×105/ml的分生孢子悬浮液；
（3）将步骤（1）所得月季嫩叶洗净并吸干表面水份，每片嫩叶取步骤（2）制备的分生孢子悬浮液20uL，以滴液的方式对嫩叶反面进行接种，再将嫩叶置于以灭菌蒸馏水为培养介质的培养皿中，在嫩叶下放一片滤纸防止叶片漂动，用封口膜将培养皿封口后在温度为20℃、光强为2000lx、光照时间为15h/d的条件下进行的培养48h；
（4）将步骤（3）所得培养后的嫩叶浸泡在含0.10~0.15%三氯乙酸的乙醇脱色液中，于37℃下恒温脱色40h，期间更换3次乙醇脱色液，直至嫩叶完全透明，再用考马斯亮蓝染色液进行染色6~10min，其中考马斯亮蓝染色液是质量浓度为0.10~0.15%的三氯乙酸水溶液∶质量浓度为0.5~0.7%的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液的体积比=1∶1，然后用蒸馏水漂洗，最后滴加甘油∶水的体积比=1∶1的溶液进行制片；
（5）在光学显微镜下观察并以病情指数统计步骤（4）所得制片后嫩叶的白粉菌感染情况（如图2所示）：菌落直径大于1mm，即得到大花香水月季对白粉病的抗性为4级易感。
实施例3
（1）以新鲜、健康、完整的金樱子（R. Laevigata）月季嫩叶作为侵染材料，提前两周用纸袋将嫩叶套袋，做隔离处理，以防止田间自然病原侵染；
（2）用毛笔将新鲜采集的月季白粉病菌孢子刷落至灭菌蒸馏水中，镜检统计数量并调配成孢子含量为1×104~1×105/ml的分生孢子悬浮液；
（3）将步骤（1）所得月季嫩叶洗净并吸干表面水份，每片嫩叶取步骤（2）制备的分生孢子悬浮液20uL，以滴液的方式对嫩叶反面进行接种，再将嫩叶置于以灭菌蒸馏水为培养介质的培养皿中，在嫩叶下放一片滤纸防止叶片漂动，用封口膜将培养皿封口后在温度为25℃、光强为3000lx、光照时间为15h/d的条件下进行的培养48h；
（4）将步骤（3）所得培养后的嫩叶浸泡在含0.10~0.15%三氯乙酸的乙醇脱色液中，于37℃下恒温脱色36h，期间更换3次乙醇脱色液，直至嫩叶完全透明，再用考马斯亮蓝染色液进行染色6~10min，其中考马斯亮蓝染色液是质量浓度为0.10~0.15%的三氯乙酸水溶液∶质量浓度为0.50~0.70%的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液的体积比=1∶1，然后用蒸馏水漂洗，最后滴加甘油∶水的体积比=1∶1的溶液进行制片；
（5）在光学显微镜下观察并以病情指数统计步骤（4）所得制片后嫩叶的白粉菌感染情况（如图3所示）：无菌丝、无菌落，即得到金樱子月季对白粉病的抗性为0级免疫。
实施例4
（1）以新鲜、健康、完整的‘杏花村’（R.‘Xinghuacun’）月季嫩叶作为侵染材料，提前两周用纸袋将嫩叶套袋，做隔离处理，以防止田间自然病原侵染；
（2）用毛笔将新鲜采集的月季白粉病菌孢子刷落至灭菌蒸馏水中，镜检统计数量并调配成孢子含量为1×104~1×105/ml的分生孢子悬浮液；
（3）将步骤（1）所得月季嫩叶洗净并吸干表面水份，每片嫩叶取步骤（2）制备的分生孢子悬浮液20uL，以滴液的方式对嫩叶反面进行接种，再将嫩叶置于以灭菌蒸馏水为培养介质的培养皿中，在嫩叶下放一片滤纸防止叶片漂动，用封口膜将培养皿封口后在温度为22℃、光强为2400lx、光照时间为16h/d的条件下进行的培养48h；
（4）将步骤（3）所得培养后的嫩叶浸泡在含0.10~0.15%三氯乙酸的乙醇脱色液中，于37℃下恒温脱色48h，期间更换2次乙醇脱色液，直至嫩叶完全透明，再用考马斯亮蓝染色液进行染色6~10min，其中考马斯亮蓝染色液是质量浓度为0.10~0.15%的三氯乙酸水溶液∶质量浓度为0.50~0.70%的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液的体积比=1∶1，然后用蒸馏水漂洗，最后滴加甘油∶水的体积比=1∶1的溶液进行制片；
（5）在光学显微镜下观察并以病情指数统计步骤（4）所得制片后嫩叶的白粉菌感染情况（如图4所示）：菌落直径小于400um，即得到‘杏花村’月季对白粉病的抗性为2级中抗。
实施例5
（1）以新鲜、健康、完整的‘地平线’（R.‘Dipingxian’）月季嫩叶作为侵染材料，提前两周用纸袋将嫩叶套袋，做隔离处理，以防止田间自然病原侵染；
（2）用毛笔将新鲜采集的月季白粉病菌孢子刷落至灭菌蒸馏水中，镜检统计数量并调配成孢子含量为1×104~1×105/ml的分生孢子悬浮液；
（3）将步骤（1）所得月季嫩叶洗净并吸干表面水份，每片嫩叶取步骤（2）制备的分生孢子悬浮液20uL，以滴液的方式对嫩叶反面进行接种，再将嫩叶置于以灭菌蒸馏水为培养介质的培养皿中，在嫩叶下放一片滤纸防止叶片漂动，用封口膜将培养皿封口后在温度为24℃、光强为2800lx、光照时间为15h/d的条件下进行的培养48h；
（4）将步骤（3）所得培养后的嫩叶浸泡在含0.10~0.15%三氯乙酸的乙醇脱色液中，于37℃下恒温脱色44h，期间更换2次乙醇脱色液，直至嫩叶完全透明，再用考马斯亮蓝染色液进行染色6~10min，其中考马斯亮蓝染色液是质量浓度为0.10~0.15%的三氯乙酸水溶液∶质量浓度为0.50~0.70%的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液的体积比=1∶1，然后用蒸馏水漂洗，最后滴加甘油∶水的体积比=1∶1的溶液进行制片；
（5）在光学显微镜下观察并以病情指数统计步骤（4）所得制片后嫩叶的白粉菌感染情况（如图5所示）：菌落直径小于800um，即得到‘地平线’月季对白粉病的抗性为3级中感。
实施例6
（1）以新鲜、健康、完整的‘云粉’（R.‘Yunfen’）月季嫩叶作为侵染材料，提前两周用纸袋将嫩叶套袋，做隔离处理，以防止田间自然病原侵染；
（2）用毛笔将新鲜采集的月季白粉病菌孢子刷落至灭菌蒸馏水中，镜检统计数量并调配成孢子含量为1×104~1×105/ml的分生孢子悬浮液；
（3）将步骤（1）所得月季嫩叶洗净并吸干表面水份，每片嫩叶取步骤（2）制备的分生孢子悬浮液20uL，以滴液的方式对嫩叶反面进行接种，再将嫩叶置于以灭菌蒸馏水为培养介质的培养皿中，在嫩叶下放一片滤纸防止叶片漂动，用封口膜将培养皿封口后在温度为25℃、光强为2200lx、光照时间为16h/d的条件下进行的培养48h；
（4）将步骤（3）所得培养后的嫩叶浸泡在含0.10~0.15%三氯乙酸的乙醇脱色液中，于37℃下恒温脱色40h，期间更换2次乙醇脱色液，直至嫩叶完全透明，再用考马斯亮蓝染色液进行染色6~10min，其中考马斯亮蓝染色液是质量浓度为0.10~0.15%的三氯乙酸水溶液∶质量浓度为0.50~0.70%的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液的体积比=1∶1，然后用蒸馏水漂洗，最后滴加甘油∶水的体积比=1∶1的溶液进行制片；
（5）在光学显微镜下观察并以病情指数统计步骤（4）所得制片后嫩叶的白粉菌感染情况（如图6所示）：菌落直径大于1mm，即得到‘云粉’月季对白粉病的抗性为4级易感。

Claims (4)

1.一种快速鉴定月季对白粉病抗性的方法，其特征在于经过下列各步骤：
（1）以新鲜、健康、完整的月季嫩叶作为侵染材料，用纸袋将嫩叶套袋隔离两周；
（2）将新采集的月季白粉病菌孢子放入灭菌蒸馏水中，调配成孢子含量数为1×104~1×105/ml的分生孢子悬浮液；
（3）取步骤（1）的月季嫩叶洗净并吸干表面水份，在每片嫩叶反面以滴液的方式，接种步骤（2）的分生孢子悬浮液20uL后，置于以灭菌蒸馏水为培养介质的培养皿中，封口后在温度为20～25℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间为15～16h/d的条件下培养48~72h；
（4）将步骤（3）培养后的嫩叶浸泡在三氯乙酸质量含量为0.10~0.15%的乙醇脱色液中，于37℃下恒温脱色36～48h，期间更换2～3次新的上述乙醇脱色液，直至嫩叶完全透明，再用考马斯亮蓝染色液进行染色6~10min，然后用蒸馏水漂洗，最后滴加甘油∶水=1∶1体积比的溶液进行制片；
（5）将步骤（4）的制片置于光学显微镜下，观察并以病情指数统计嫩叶上的白粉菌感染情况，即得到该月季嫩叶对白粉病的抗性。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定月季对白粉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤（1）的套袋隔离法，将嫩叶提前两周用纸袋套袋。
3.根据权利要求1所述的快速鉴定月季对白粉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤（4）的考马斯亮蓝染色液是质量浓度为0.10~0.15%的三氯乙酸水溶液∶质量浓度为0.50~0.70%的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液的体积比=1∶1。
4.根据权利要求1所述的快速鉴定月季对白粉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤（5）的病情指数是：
0级为免疫，即无菌丝、无菌落；
1级为高抗，即菌丝长小于100um，无菌落；
2级为中抗，即菌落直径小于400um；
3级为中感，即菌落直径小于800um；
4级为易感，即菌落直径大于1mm。
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