CN105557343A - 一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法 - Google Patents

一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，挑选在1/2？MS培养基上生长至4～6叶龄期，植株大小相近一致的无菌烟苗各10株，超净工作台内去除干净根系周围附着的MS培养基，以剪刀伤根后将植株根部于细菌悬浮液中浸泡30min后，灭菌滤纸吸干根部表面多余的菌液，重新栽回MS培养基内，灭菌水浸根作为对照，30℃、光照度2600lx、16h光周期条件培养，隔天观察记载发病病情，根据病情严重度计算病情指数。

Description

一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法
技术领域
本发明属于植物抗病领域，具体涉及一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法。
背景技术
目前传统烟草品种的青枯病抗性鉴定方法包括：网室接种、人工病圃和大田自然病圃法。这些方法鉴定环节繁复，所需鉴定周期较长，通常周年或整个生育期仅可完成一次鉴定，并于以下方面存在亟待改进之处。经济可行性角度：大批量评价种质资源材料抗性时，需耗费大量人力、物力和财力资源；结果稳定性与可靠性角度：易受气候、土壤以及病圃青枯菌系构成和初始接种体密度（自然病圃）等因素的影响；资源材料保存角度：无法继代重复利用，低抗材料发病过重,不利于品种资源的保存；生态安全角度：人工病圃如设置管理不当，可造成病害的爆发流行，存在巨大的生态安全隐患。其它基于传统网室鉴定发展起来的茄子苗期抗性鉴定法、辣椒水培抗性鉴定法和烟草漂浮池恒温水培抗性鉴定法等，虽在技术上具有一定的创新性与可行性，但仍未完全摆脱易受环境干扰，发病缓慢与程度不足或反之，种质资源材料浪费、无法继代等问题的束缚，因此在时间、空间、种质保存以及成本上仍无法实现高效、快捷、可持续以及经济可行性。
国外相关研究以香蕉无菌试管苗为受体材料，分别评价了不同品种对黄单胞菌萎蔫病（Xanthomonascampestrispv.musacearum）、黑条叶斑病（MycosphaerellafijiensisMorelet）、镰刀菌枯萎病（Fusariumoxysporumf.sp.cubense(Foc),）的抗性水平，并揭示出该室内评价方法与田间评价获得的结果具有显著的相关性。
迄今为止，国内外尚无利用烟草组培苗接种法作为烟草品种对青枯病抗性快速评价的相关报道。国内烟区一直沿用传统的田间人工病圃灌根法进行品种青枯病抗性鉴定，该方法虽在青枯病的抗性资源的筛选和评价方面卓有成效，但所需鉴定周期较长，通常需要花费整个生产季节，这无疑会加大资源评价的成本，降低了品种选育效率。
室内鉴定可为田间鉴定提供有力参考，其优越性在于：可人工控制生长环境条件，进行工厂化作业和管理，保持条件的一致性，不易受外界因素干扰;可对育种研究初期获得的杂交后代，或无性系的试管苗等进行早期大量鉴定和筛选；也可对育成的优良材料在标准化条件下采用多个菌系(小种或致病型)和不同菌量接种，进行抗病性鉴定和评价。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，传统方法虽在青枯病的抗性资源的筛选和评价方面卓有成效，但所需鉴定周期较长，通常需要花费整个生产季节，这无疑会加大资源评价的成本，降低了品种选育效率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
1、采用植物微扦插技术，以烟草青枯病不同抗性品种的无菌组培苗作为抗性筛选的受体材料，采用青枯菌株作为接种体材料，接种无菌烟苗，待感病对照品种病情不再进一步发展作为评判标准，所得结果作为品种抗性鉴定的主要依据。
2、对每一个品种的烟苗，不需要进行特殊的处理，保证了烟苗的一致性；同时浸泡所用菌液均匀一致，减少其他因素的干扰，保证了鉴定结果的一致性和可重复性；并且同一植株的多个茎枝可同时进行鉴定，增加了单株鉴定的准确性，这对于可进行无性繁殖的作物具有重要意义。
具体方法为：所述方法为：挑选在1/2MS培养基上生长至4～6叶龄期，植株大小相近一致的无菌烟苗各10株，超净工作台内去除干净根系周围附着的MS培养基，以剪刀伤根后将植株根部于细菌悬浮液中浸泡30min后，灭菌滤纸吸干根部表面多余的菌液，重新栽回MS培养基内，灭菌水浸根作为对照，30℃、光照度2600lx、16h光周期条件培养，隔天观察记载发病病情，根据病情严重度计算病情指数。
所述的病情严重度：病情严重度分为5级，标准如下：
0级——无症状；
1级——1个叶片萎蔫；
2级——2～3个叶片萎蔫；
3级——4片叶片萎蔫；
4级——整株死亡；
。
所述的细菌悬浮液制备方法为：挑取室温条件下保存于灭菌去离子水中的青枯菌株，于TZC培养平板上划线，30℃条件下培养48h后，挑取典型的青枯菌野生型菌落，经PCR验证阳性后，转至普通NA培养平板，30℃条件下培养48h；采用比浊法，挑取强毒力纯培养物，于灭菌去离子水中配置成浓度为3×106cfu/mL的细菌悬浮液。
NA培养基制备方法为：
分别称取牛肉浸膏3.0g、葡萄糖10.0g、蛋白胨5.0g、酵母粉0.5g、琼脂粉15.0g放于1000mL容量的烧杯中，先加入500mL蒸馏水，充分搅拌，混合均匀后继续加蒸馏水定容至1000mL，以1N氢氧化钠溶液调节pH至7.0，分装于三角瓶中，高压灭菌锅中121℃灭菌20分钟后备用。
红四氮唑(TZC)培养基制备方法为：称取1.0g红四氮唑（C19H15CIN4）溶于100ml蒸馏水配制成1%红四氮唑溶液，高压灭菌7～8分钟，避光4℃保存。100mlNA培养基中加入0.5ml1%红四氮唑溶液即制备成红四氮唑(TZC)培养基。
本发明的优点在于：
1、引进烟草组培苗微扦插技术，构建了无菌继代苗接种的快速评价鉴定体系，简化了繁琐的田间抗性鉴定程序。
分别比较了国内外报道较为常用的室内快速鉴定方法，包括烟草离体叶片粗毒素接种、愈伤组织粗毒素接种、离体叶片剪叶活菌接种等方法，均未获得预期的相关性结果。本项目引入植物微扦插技术，以烟草青枯病不同抗性品种的无菌组培苗作为抗性筛选的受体材料，采用普通青枯菌株作为接种体材料，构建了烟草无菌组培苗活菌接种的抗性快速鉴定体系。无菌烟苗生长至4～5展叶期时，去除植株根部附着的MS培养基，于浓度为3×106cfu/ml的青枯菌悬液中浸泡30min。接种7~10d后感病对照品种充分发病后，以感病对照品种病情不再进一步发展作为评判标准，所得结果作为品种抗性鉴定的主要依据。
、快速、高效的病原验证分子检测技术的构建。
由于切根浸菌接种操作过程中，存在杂菌污染的可能。为了确证青枯菌接种体是引起烟草无菌苗萎蔫症状的始动因子，将萎蔫植株主茎切成长5mm左右的小段，静置悬浮于10mL灭菌PBS缓冲液中15~20min。直接以病样悬浮液作为扩增模版，直接进行PCR检测。青枯病阳性反应的评判标准为样品悬浮液可扩增获得280bp的青枯菌种特异性条带，分子检测阳性组织悬浮液于青枯菌半选择性培养平板上作进一步分离培养验证。
、鉴定过程可操作性更强，更为经济。
组培微扦插技术可通过单节切段快速繁殖获得足够数量的烟草无菌试管苗，省去了烟苗的温室和田间播种栽培步骤，降低了工作量；并可于同一个组培瓶内扩繁多株组培苗，节省了空间，并有利于控制发病条件，更加便于管理，有利于大量不同材料和不同基因型的鉴定。
、鉴定结果的一致性更强、重复性更高。
由于对每一个品种的烟苗，不需要进行特殊的处理，保证了烟苗的一致性；同时浸泡所用菌液均匀一致，减少其他因素的干扰，保证了鉴定结果的一致性和可重复性；并且同一植株的多个茎枝可同时进行鉴定，增加了单株鉴定的准确性，这对于可进行无性繁殖的作物具有重要意义。
、适用对象和应用范围更广。
植物抗性材料方面：可用于植物抗性材料的筛选，对所需鉴定的植物资源材料群体大小没有严格的限制，只要每个基因型的植株能够满足12个即可；病原菌致病性方面：可用于青枯菌株材料致病性差异的鉴定。
、鉴定后的植株可直接应用。
由于用于鉴定的烟苗仅仅是微扦插的幼苗，所剩余的植株没有接触病菌，因此可直接进行应用，而灌根法则不能，这对于珍贵稀有的材料的保存和繁殖具有重要意义。
直接经济效益分析
传统田间伤根接种法需投入大量人力、物力和财力，并占用了大量耕地资源。按每小区种植100株，每亩仅可种植2000株，所鉴定的品种（株系）仅为3～4个，需投入4500元，若需鉴定的品种（株系）群体庞大，所占用的土地、投入的人力物力必将是一个庞大的数字。使用微扦插法每次鉴定5个不同基因型的群体，每个品种（株系）所需的群体数量仅为12株，所投入的成本仅为250元。
本项目首次引入烟草微扦插试管苗接种技术对资源品种进行抗青枯病先期鉴定，较传统鉴定法可以减少投入18倍，具有良好的经济效益。
生态效益分析：
为确保抗性鉴定的选择压力一致，田间病圃需人工接种，平均每亩需接种60L浓度为3×108cfu/mL的青枯菌细胞悬浮液，亦即每亩需接入6000亿个青枯菌体细胞；作为土壤习居菌，青枯菌在脱离寄主的情况下可于土壤中长期存活（尤其是在长江以南地区），因此一旦于土壤中定殖常规手段难以根除，用作病圃的耕地短期内（通常需轮作3~5年）难以用作茄科作物的生产用地；此外，如果病圃选址、排灌系统设置不当以及隔离消毒措施管理不严，极易造成青枯病的扩散流行，由此造成生态效益损失难以评估。
本项目基于无菌试管苗接种技术建立的烟草青枯病抗性鉴定体系，可用于烟草品种抗性的室内先期初筛，减少耕地资源使用的同时大幅降低了青枯病流行的生态风险。
社会效益分析：
1、填补了我国烟草微扦插抗青枯病鉴定的空白。
微扦插法业已广泛应用于各种经济作物的无性繁殖，但国内尚未见将该方法用于植物抗源筛选等研究领域的报道。本项目将微扦插与抗性鉴定有机的结合成一体，有效地解决了大面积使用土地资源、鉴定品种（株系）少的问题，高效地提高了鉴定效率，极大地缩短了鉴定周期，改写了抗源利用的先期进程。
、有利于抗源利用的田间遴选的优化升级。
利用微扦插法鉴定品种（株系）抗性鉴定，很好地解决了先期大量而繁琐的资源遴选过程。该项目的顺利实施推广，先期可以首先遴选出良好的抗性材料，使得田间遴选的程序、目标更为直观明了，促进田间遴选的优化升级。
、有助于缩短抗性品种的选育进程。
传统的田间鉴定一个周期需要8个月，采用微扦插法则仅需3个月，时间上可以缩短5个月，且可以周年持续不间断地进行鉴定工作，大大提高了先期遴选的效率。由于先期抗源遴选进程的缩短，优化了后期优良基因的组合，提速了常规育种的选育进程。
具体实施方式
实施例1
所述方法为：挑选在1/2MS培养基上生长至5叶龄期，植株大小相近一致的无菌烟苗各10株，超净工作台内去除干净根系周围附着的MS培养基，以剪刀伤根后将植株根部于细菌悬浮液中浸泡30min后，灭菌滤纸吸干根部表面多余的菌液，重新栽回MS培养基内，灭菌水浸根作为对照，30℃、光照度2600lx、16h光周期条件培养，隔天观察记载发病病情，根据病情严重度计算病情指数。
所述的病情严重度：病情严重度分为5级，标准如下：
0级——无症状；
1级——1个叶片萎蔫；
2级——2～3个叶片萎蔫；
3级——4片叶片萎蔫；
4级——整株死亡；
。
所述的细菌悬浮液制备方法为：挑取室温条件下保存于灭菌去离子水中的青枯菌株，于TZC培养平板上划线，30℃条件下培养48h后，挑取典型的青枯菌野生型菌落，经PCR验证阳性后，转至普通NA培养平板，30℃条件下培养48h；采用比浊法，挑取强毒力纯培养物，于灭菌去离子水中配置成浓度为3×106cfu/mL的细菌悬浮液。
接种后隔天调查记载病情，以接种后21d的病情指数观测值作为抗性评价标准。接种21d后，红花大金元、翠碧1号、云烟85、K326、G80和岩烟97的病情指数分别为100、90.5、88.8、86.6、56和53.8。各品种无菌苗接种测定结果与自然病圃的鉴定结果呈极显著正相关，经Excel相关系数函数计算，其相关值为0.936。
本方法以青枯菌的3×106cfu/mL浓度的悬液作为接种体，分别接种抗感水平差异明显的红花大金元（HS），翠碧1号、云烟85、K326、G80和岩烟97等6个烟草品种，病情指数与田间自然发病情况呈明显正相关性,相关系数为0.936(n=6)，达极显著水平，鉴定结果与田间鉴定结果吻合度极高，能正确反映出不同烟草品种对青枯病的抗性水平。该方法可以作为鉴定烟草品种抗性水平的快速、可靠的初筛手段，并可替代耗时、耗费、耗力的田间鉴定过程。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其特征在于：所述方法为：挑选在1/2MS培养基上生长至4～6叶龄期、植株大小相近一致的无菌烟苗各10株，超净工作台内去除干净根系周围附着的MS培养基，以剪刀伤根后将植株根部于细菌悬浮液中浸泡30min后，灭菌滤纸吸干根部表面多余的菌液，重新栽回MS培养基内，灭菌水浸根作为对照，30℃、光照度2600lx、16h光周期条件培养，隔天观察记载发病病情，根据病情严重度计算病情指数。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其特征在于：所述的病情严重度：病情严重度分为5级，标准如下：
0级——无症状；
1级——1个叶片萎蔫；
2级——2～3个叶片萎蔫；
3级——4片叶片萎蔫；
4级——整株死亡；
。
3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其特征在于：所述的细菌悬浮液制备方法为：挑取室温条件下保存于灭菌去离子水中的青枯菌株，于TZC培养基平板上划线，30℃条件下培养48h后，挑取典型的青枯菌野生型菌落，经PCR验证阳性后，转至普通NA培养基平板，30℃条件下培养48h；采用比浊法，挑取强毒力纯培养物，于灭菌去离子水中配置成浓度为3×106cfu/mL的细菌悬浮液。
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