CN102220407B - 一种非洲菊灰霉病抗性鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非洲菊灰霉病抗性鉴定的方法，属植物抗病性鉴定技术领域。该方法是（1）适宜的接种材料的选择，以新鲜采集的完整幼叶或花瓣作为接种材料；（2）灰霉菌培养及其分生孢子悬浮液的制备（3）制备接种液，于接种前将分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为3%的马铃薯葡萄糖和分生孢子数为1×106个/ml浓度的接种液或将分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为6%的马铃薯葡萄糖和分生孢子数为3×105个/ml浓度的接种液；（4）接种。本发明方法在人工控制的稳定条件下进行，鉴定结果准确性高，达到了简单、快速、准确鉴定非洲菊灰霉病抗性的目的。
Description
技术领域
本发明属植物抗病性鉴定技术领域，具体涉及非洲菊灰霉病离体抗性鉴定的方法。
背景技术
非洲菊（Gerbera spp.）是世界五大重要切花之一，其盆花的应用也越来越流行，具有重要的经济价值。灰霉菌（Botrytis cinerea）是一种空气传播、适宜温度范围大（4℃-25℃）、侵染200多种寄主的腐生菌，由灰霉菌引起的软腐病，严重危害非洲菊的生产、贮藏、运输等各个环节，尤其是在非洲菊切花采后贮藏、运输过程中，由于高湿、温度波动大产生结露等环境条件，给灰霉菌的滋生繁殖提供了良好的条件，灰霉菌引起的软腐病成为非洲菊切花采后质量保持的限制因子之一，灰霉菌侵染引起的软腐病给非洲菊切花导致的经济损失，直接的影响是侵染产品被拒绝进入采后供应链，间接的影响是被感染产品的观赏性状降低，极大的影响了产品的销售价格。
大田生产发现，在非洲菊不同栽培品种中存在对灰霉菌软腐病的抗性差异。虽然可以通过控制栽培条件来降低灰霉菌软腐病的危害，但随着能源成本的升高，培育抗性品种是非洲菊育种、生产可持续发展的主要出路。
抗性资源的准确鉴定筛选是抗性品种培育的首要条件，现有技术中对非洲菊灰霉病抗性鉴定常采用大田活体植株接种法,存在供试植株感染病害、鉴定周期长、结果易受环境条件影响的缺陷和不足。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的大田活体植株接种法对非洲菊灰霉病抗性鉴定存在供试植株感染病害、鉴定周期长、结果易受环境条件影响的缺陷和不足，其目的是提供一种简单、快速、准确和能大规模筛选鉴定非洲菊灰霉病抗性资源的方法，为进一步的杂交育种或分子标记辅助育种提供支持。
解决上述技术问题和实现本发明目的是通过以下技术方案实现的:
一种非洲菊灰霉病抗性鉴定方法，按以下步骤进行：
（1）适宜的接种材料的选择，以新鲜采集的完整幼叶或花瓣作为接种材料；
（2）灰霉菌Botrytis cinerea培养及其分生孢子悬浮液的制备
用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称：PDA培养基）培养灰霉菌（Botrytis cinerea），将-70℃～-80℃低温保存的灰霉菌（Botrytis cinerea）于超菌工作台接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，于18℃～25℃温度，光照强度为1000～2000lx条件下16 h连续光照培养培养3天后，转入黑暗条件培养7～15天，菌丝长满整个培养皿后，用含有质量分数为0.1%吐温-20的灭菌蒸馏水悬浮培养皿中所培养的分生孢子，用小孔计数法制备每毫升孢子数为1×107个的分生孢子贮备液供接种用；
（3）制备接种液
于接种前，将步骤（2）获得的分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为3%的马铃薯葡萄糖（potato dextrose, PD）和分生孢子数为1×106个/ml浓度的接种液供接种用或将步骤（2）获得的分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为6%的马铃薯葡萄糖（potato dextrose, PD）和分生孢子数为3×105个/ml浓度的接种液供接种用；
（4）接种
用微量移液器取2μl的接种液以液滴的方式将孢子液接种到步骤（1）所述的幼叶或花瓣，将该幼叶或花瓣材料保持在相对湿度为90%～95%、光照强度为1000lx～2000lx、温度为18℃～25℃的条件下, 接种24h后开始观察病情发展，根据病情发展的速度及病情指数判断供试材料的抗性, 花瓣在48h内病情指数达到3～5级为感病品种，幼叶在120h内病情指数达到3～5级为感病品种。
所述的病情指数分为花瓣病情指数统计方法和幼叶病情指数统计方法，所述的花瓣病情指数统计方法如下：
0级：接种液滴清澈，无任何侵染迹象，
1级：开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状，
2级：侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-4倍，
3级：侵染区域继续扩大，但小于接种花瓣的1/2面积，
4级：侵染面积超过花瓣的1/2，
5级：整个花瓣几乎或完全被侵染，
48h内病情指数达到3～5级为感病品种；
所述的幼叶病情指数统计方法如下：
0级：接种液滴清澈，无任何侵染迹象，
1级：开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状，
2级：侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-5倍，
3级：侵染区域继续扩大，侵染斑大小为液滴的6-10倍，
4级：侵染区域继续扩大，侵染区域接近叶片面积的1/2，
5级：侵染区域达到或超过叶片面积的2/3，
120h内病情指数达到3～5级为感病品种。
所述的接种是对完整幼叶的正面接种或对花瓣的正面接种。
本发明所涉及的生物材料灰霉菌Botrytis cinerea已在许多非专利文献公开，如在“番茄灰霉病病原菌生物学特性的研究”（徐明等，贵州农业科学，2009,37(3)：68-71）中公开，并且上述生物材料申请人有保存，申请人保证自本专利申请日起20年内向公众发放。申请人联系地址是云南省昆明市北郊黑龙潭云南农业大学，邮政编码 650201，联系电话：0871-5220399。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、现有的大田非洲菊活体灰霉菌病害抗性鉴定从育苗开始、小苗移栽、接种到发病是一项历时2～3月、费时费力的工作，且病害表现易受环境影响、很难获得准确的结果。本发明采用小分生孢子液滴、补充营养、花瓣无创伤接种，于室温、高湿、自然光条件下48h能清楚地鉴别出非洲菊不同基因型间的灰霉病抗性差异，花瓣鉴定结果的准确性被幼叶鉴定结果进一步证实，且对非洲菊抗感亲本杂交分离后代的检测结果符合非洲菊灰霉菌抗病基因为QTL基因控制性状的分离特点，达到了简单、快速、准确鉴定非洲菊灰霉病抗性的目的。
2、现有非洲菊灰霉病抗性鉴定采用活体鉴定的方法，因接种病菌使植株感染病害影响植株正常生长发育、甚至死亡，致使非洲菊杂交育种后代的早期抗性鉴定无法进行。本发明的方法采用离体的幼叶作接种材料，不但不影响植株正常的生长发育，并且能够在早期对杂交后代进行灰霉病抗性鉴定，能够有效的促进非洲菊灰霉病抗性育种。
3、现有灰霉菌活体抗性鉴定方法，因易受环境的影响，其鉴定结果准确性低，无法为非洲菊灰霉菌抗性连锁分子标记的建立提供可靠的研究材料，本发明的离体花瓣鉴定方法是在人工控制的稳定条件下进行，鉴定结果准确性高，可为非洲菊灰霉菌抗性连锁分子标记的建立提供可靠的支持。
附图说明
图1是一对抗病和感病的非洲菊亲本及其杂交分离后代的灰霉菌抗性变异，横坐标及其数字表示杂交亲本及其杂交分离后代。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的描述。以下各实施例中所用的灰霉菌Botrytis cinerea由云南农业大学提供，其余试剂均为是市售产品。所用仪器光学显微镜、光照培养箱、人工气候箱均为普通配制。
本发明使用的生物材料灰霉菌Botrytis cinerea是利用灰霉菌的致灰霉病的致病共性来感染植株，因此具有致病力的各种灰霉菌菌株都能达到本发明的效果，该灰霉菌广泛存在于许多大田或园艺作物中，采用植物病原真菌的常规稀释分离方法（方中达，植病研究法（第三版），中国农业出版社，1998，124～125）即可得到灰霉菌Botrytis cinerea。
实施例1 以花瓣为接种材料的实施例
（1） 植物材料
供试的灰霉菌不同抗性的非洲菊切花栽培品种为：Macy, Kaliki, Risto, Serena, CK100, 3142，5544共7个基因型，由荷兰非洲菊育种公司Florist和Shreurs提供，采集新鲜花瓣作为接种材料；
（2）灰霉菌Botrytis cinerea培养及其分生孢子悬浮液的制备
用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称：PDA培养基）培养灰霉菌Botrytis cinerea，将-80℃低温保存的灰霉菌（Botrytis cinerea）于超菌工作台接种于装有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的直径10cm培养皿中心，于20℃～22℃温度，光照强度为1800lx条件下16h连续光照培养，培养3天后，转入黑暗条件培养7天，菌丝长满整个培养皿后，用含有质量分数0.1%吐温-20的灭菌蒸馏水悬浮培养皿中所培养的分生孢子，用小孔计数法制备每毫升孢子数为1×107的分生孢子贮备液供接种用；
（3）制备接种液
于接种前，将步骤（2）获得的分生孢子贮备液制备为分别含有质量分数为1%、3%、6%浓度的马铃薯葡萄糖（potato dextrose, PD）及分生孢子数为3×105个/ml、1×106个/ml浓度的接种液供接种用；
（4）接种
取将步骤（3）制备的含不同浓度分生孢子和PD的接种液2μl分别接种到步骤（1）所述的花瓣上，将该花瓣材料分别保持在塑料膜密封，相对湿度90%～95%，光照强度为1800lx、温度为20℃～22℃的条件下, 接种24h后开始观察病情发展，根据病害发展速度及病情指数判断供试材料的病害抗性。接种采用对花瓣的正面和反面接种对比形式。
（5）病情观察及病情指数统计
花瓣病情指数统计方法如下：
0级：接种液滴清澈，无任何侵染迹象；
1级：开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状；
2级：侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-4倍；
3级：侵染区域继续扩大，但小于接种花瓣的1/2面积；
4级：侵染面积超过花瓣的1/2；
5级：整个花瓣几乎或完全被侵染。
48h内病情指数达到3～5级为感病品种。
（6）实验结果及分析：
接种花瓣正反两面比较组织正反面对接种效果的影响。观察结果为，花瓣正反面接种均能发病、且正反面发病表现结果一致，但花瓣正面接种病害发展快于反面，可能是非洲菊花瓣背面膜质化程度的增大加大了病菌侵入的难度，以正面接种为理想。
统计灰霉菌分生孢子及营养浓度配比对非洲菊花瓣正面接种的病情指数详见表1。病情指数结果表明，含有1%的PD的两个分生孢子浓度3×105个/ml、1×106个/ml接种的各品种的花瓣4天内均发病轻、且品种间差异不明显；含有6%的PD及分生孢子浓度1×106个/ml接种的各品种的花瓣在接种48h均已严重发病、无法鉴定品种间差异；3%PD与分生孢子3×105个/ml浓度组合接种的花瓣虽然品种间差异明显，但48h时品种间差异尚小；以3%PD与分生孢子1×106个/ml及6%PD与分生孢子3×105个/ml浓度组合最为理想，48h能清楚鉴别品种间抗性差异，病情指数大于3的品种均为田间观察较为感病的品种。
表1 灰霉菌分生孢子及营养浓度配比对非洲菊花瓣正面接种的病情指数
实施例2 以完整幼叶为接种材料的实施例
（1）植物材料
供试的非洲菊切花栽培品种及来源同实施例1，采集新鲜完整幼叶作为接种材料；
（2）灰霉菌Botrytis cinerea培养及其分生孢子悬浮液的制备
同实施例1。
（3）制备接种液
同实施例1。
（4）接种
取将步骤（3）制备的含不同浓度分生孢子和PD的接种液2μl分别接种到步骤（1）所述的幼叶上，将该幼叶保持在塑料膜密封，相对湿度90%～95%，光照强度为1800lx、温度为20℃～22℃的条件下, 接种24h后开始观察病情发展，根据病害发展速度及病情指数判断供试材料的病害抗性。接种采用对花瓣的正面和反面接种对比形式。
（5）病情观察及病情指数统计
幼叶病情指数统计方法如下：
0级：接种液滴清澈，无任何侵染迹象；
1级：开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状；
2级：侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-5倍；
3级：侵染区域继续扩大，侵染斑大小为液滴的6-10倍；
4级：侵染区域继续扩大，侵染区域接近叶片面积的1/2；
5级：侵染区域达到或超过叶片面积的2/3。
120h（5天）内病情指数达到3～5级为感病品种。
（6）实验结果及分析：
观察接种幼叶正反两面的结果与花瓣接种结果类似，幼叶正反面接种均能发病、且正反面发病表现结果一致，但正面接种病害发展快于反面，可能是幼叶背面膜质化程度的增大加大了病菌侵入的难度。
统计灰霉菌分生孢子及营养浓度配比对非洲菊幼叶正面接种的病情指数详见表2。表2表明，以非洲菊幼叶为接种材料，接种5～7天的灰霉病病情指数与花瓣接种48h时的病情指数反应的非洲菊品种间抗性差异一致，非洲菊幼叶接种5～7天能清楚的鉴别不同品种间抗性差异。
表2 灰霉菌分生孢子及营养浓度配比对非洲菊幼叶正面接种的病情指数
实施例3 适宜接种材料的试验
除对实施例1所述的接种材料进行了试验外，实施例2还对非洲菊叶块和茎段进行了试验，试验方法采用实施例1的处理方法进行。
（1）植物材料
供试的灰霉菌不同抗性的非洲菊切花栽培品种为：Macy, Kaliki, Risto, Serena, CK100, 3142，5544共7个基因型，由荷兰非洲菊育种公司Florist和Shreurs提供，分别取其新鲜采集的非洲菊叶块和茎段作为接种材料，叶块大小直径1.5cm、2.5cm、3.5cm三种，茎段长度为8cm。
（2）灰霉菌Botrytis cinerea培养及其分生孢子悬浮液的制备
用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称：PDA培养基）培养灰霉菌Botrytis cinerea，将-80℃低温保存的纯菌株于超菌工作台接种于直径10cm培养皿中心，于20℃～22℃温度，光照强度为1800lx条件下16 h连续光照培养3天后，转入黑暗条件培养7天，菌丝长满整个培养皿后，用含有0.1%吐温-20的灭菌的蒸馏水悬浮培养皿中所培养的分生孢子，用小孔计数法制备每毫升孢子数为1×107的分生孢子贮备液供接种用；
（3）制备接种液
叶块接种液制备：
于接种前，将步骤（2）获得的分生孢子贮备液制备为含有质量分数为1%、3%、6%浓度的马铃薯葡萄糖（potato dextrose, PD）及分生孢子数为3×105个/ml、1×106个/ml六种不同马铃薯葡萄糖和分生孢子浓度组合的接种液供接种用；
茎段接种液的制备：
与花瓣、幼叶相比，具有切面创伤的茎段，创伤能使孢子迅速进入组织、并从植物组织中获得充足的营养而繁殖快速。若在有创伤的条件下使用高浓度的营养物质和分生孢子接种，则病害发展过快无法鉴定品种间抗性差异。所以相应的降低茎段接种液的营养物质及分生孢子的浓度。
于接种前，将步骤（2）获得的分生孢子贮备液制备为含有质量分数为1%浓度的马铃薯葡萄糖（potato dextrose, PD）及分生孢子数为3×105个/ml浓度的接种液供接种用。
（4）接种
叶块接种：分别取2μl、5μl、10μl的叶块接种液接种到步骤（1）所述的叶块正面，接种后将材料保持在相对湿度90%～100%，光照强度为1800lx、温度为21℃～22℃的条件下, 接种后24 h开始观察病情发展，根据病害发展速度及病情指数判断供试材料的病害抗性。接种采用创伤接种和无伤口自然接种两种对比形式。
茎段接种：将制备好的茎段接种液2μl接种到步骤（1）所述的茎段上端切口面，茎段上端指靠近花朵的一端。将接种后的茎段放置在同上述叶块相同的条件下。接种后24h开始观察病情发展，3天后测量病害侵染茎段的长度，以此判断供试材料的抗病性。
（5）病情观察及病情指数统计
①叶块病情观察及病害抗性评估
所有品种的叶块在整个实验过程中均未发病，未进行病情观察及病害抗性评估。
②茎段病情观察及病害抗性评估
切取长8cm的非洲菊茎段，在其顶端（靠近花朵的一段）滴加接种液，接种后24 h开始观察病情发展，3天后测量病害侵染茎段的长度，接种3天后灰霉菌对茎段的侵染情况见表3。
表3表明，接种3天后测得供试品种中灰霉菌侵染其茎段的长度从最短的16.9mm（Serena）到最长的58.7mm（CK100），茎段接种结果不同于田间观察结果，虽然抗性品种Risto病害侵染茎段长度远小于其它品种，与田间观察结果一致，但供试品种中田间最为感病的Kaliki的侵染茎段的长度32.1mm比其它品种小很多，茎段接种不能鉴定非洲菊灰霉菌抗性差异。
表3灰霉病对茎段的侵染情况
实施例1、实施例2、实施例3结果表明：
①在非洲菊灰霉病抗性鉴定的适宜材料的选择方面：
不同非洲菊材料：幼叶、叶块、花瓣、茎段接种灰霉菌孢子悬浮液后，不同大小的所有叶块在整个试验过程中均未发病；茎段接种发病与否及病情发展速度容易评估，但茎段结果不同于田间观察结果，不能用于非洲菊灰霉菌抗性鉴定；花瓣正面接种24h后观察到明显的病斑，不同品种间表现出差异，48h后差异进一步扩大，可明显看出品种间差异并与田间观察结果一致，达到预期的简单、快速、准确、大规模鉴定不同基因型的抗性差异的效果，因此花瓣正面接种是鉴定非洲菊灰霉菌抗性的理想材料。
此外，幼叶接种24 h后，在抗性品种上观察到明显的过敏反应，病情发展速度虽然慢于花瓣，但在一周内能观察到品种间差异结果、且与花瓣接种和田间观察结果一致，也是比较理想的非洲菊灰霉菌抗性鉴定材料。
② 叶片创伤激发对灰霉菌的防卫反应
研究发现不同直径大小的非洲菊叶块接种灰霉菌后均不发病，灰霉菌接种能够侵染导致完整的非洲菊幼叶发病，却不能使叶块发病，可能是切取叶块的创伤反应诱发了非洲菊的抗性防卫反应，抑制了灰霉病病菌的侵染危害。
实施例4 杂交亲本及其后代抗性差异的鉴定
本实施例是在上述探索出适宜的非洲菊接种材料、灰霉菌孢子浓度、孢子悬浮液处理、接种量、接种方法的基础上，利用建立的该抗性鉴定方法，鉴定田间种植的杂交亲本及其相应的育种系的病害抗性。
供试的灰霉菌抗病和感病非洲菊亲本Risto和Kaliki及其杂交分离后代由荷兰非洲菊育种公司Florist提供，以花瓣作为接种材料。
参照实施例1的方法制备灰霉菌分生孢子浓度为1×106个/ml，PD含量为3%的接种液，采用花瓣正面接种的方法，接种量为2μl。接种后将材料放置在相对湿度90%～95%，光照强度为1800lx、温度为21℃～22℃的环境条件下, 接种后24 h开始观察病情发展。
按实施例1中花瓣病情指数的统计方法将其分级统计，一对亲本及其杂交后代灰霉菌抗性差异变异结果如图1所示，抗、感亲本及其杂交后代的抗性呈现典型的数量性状分离，与已知的灰霉菌抗性为QTL数量性状遗传的报到吻合（Richard et al. Three QTLs for Botrytis cinerea resistance in tomato（番茄灰霉菌抗性的三个QTLs），Theoretical and Applied Genetics, 2007, 114(4): 585-593.），说明本发明方法是科学的和可行的。
Claims (2)
1.一种非洲菊灰霉病抗性鉴定的方法，按以下步骤进行：
（1）适宜的接种材料的选择，以新鲜采集的完整幼叶或花瓣作为接种材料；
（2）灰霉菌Botrytis cinerea培养及其分生孢子悬浮液的制备
用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养灰霉菌，将-70～-80℃低温保存的灰霉菌于超净工作台接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，于18℃～25℃温度，光照强度为1000～2000lx条件下16 h连续光照培养3天后，转入黑暗条件培养7～15天，菌丝长满整个培养皿后，用含有质量分数为0.1%吐温-20的灭菌蒸馏水悬浮培养皿中所培养的分生孢子，用小孔计数法制备每毫升孢子数为1×107个的分生孢子贮备液供接种用；
（3）制备接种液
于接种前，将步骤（2）获得的分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为3%的马铃薯葡萄糖和分生孢子数为1×106个/ml浓度的接种液供接种用或将步骤（2）获得的分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为6%的马铃薯葡萄糖和分生孢子数为3×105个/ml浓度的接种液供接种用；
（4）接种
用微量移液器取2μl的接种液以液滴的方式将孢子液接种到步骤（1）所述的幼叶或花瓣，将该幼叶或花瓣材料保持在相对湿度为90%～95%、光照强度为1000lx～2000lx、温度为18℃～25℃的条件下, 接种24h后开始观察病情发展，根据病情发展的速度及病情指数判断供试材料的抗性, 花瓣在48h内病情指数达到3～5级为感病品种，幼叶在120h内病情指数达到3～5级为感病品种；所述的病情指数分为花瓣病情指数统计方法和幼叶病情指数统计方法，所述的花瓣病情指数统计方法如下：
0级：接种液滴清澈，无任何侵染迹象，
1级：开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状，
2级：侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-4倍，
3级：侵染区域继续扩大，但小于接种花瓣的1/2面积，
4级：侵染面积超过花瓣的1/2，
5级：整个花瓣几乎或完全被侵染，
48h内病情指数达到3～5级为感病品种；
所述的幼叶病情指数统计方法如下：
0级：接种液滴清澈，无任何侵染迹象，
1级：开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状，
2级：侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-5倍，
3级：侵染区域继续扩大，侵染斑大小为液滴的6-10倍，
4级：侵染区域继续扩大，侵染区域接近叶片面积的1/2，
5级：侵染区域达到或超过叶片面积的2/3，
120h内病情指数达到3～5级为感病品种。
2.根据权利要求1所述的一种非洲菊灰霉病抗性鉴定的方法，其特征在于：所述的接种是对完整幼叶的正面接种或对花瓣的正面接种。
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