CN110904186A - 一种月季灰霉病抗病性鉴定方法 - Google Patents

一种月季灰霉病抗病性鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种月季灰霉病抗病性鉴定方法，属于植物灰霉病抗性鉴定技术领域。本发明所述方法为将不同的灰霉菌株接种到固体培养基上，培养3‑4周后产生分生孢子；刮取培养基表面的孢子及菌丝，过滤、滤去菌丝残体，获得清液，并用10％‑30％的液体培养基稀释到孢子浓度为1×105～7个/mL得到孢子悬浮液；孢子悬浮液接种月季花完整花瓣上，72h后测量花瓣的病斑直径，并计算病斑面积，分析月季灰霉病抗性。本发明所述方法接种成本低，接种时将整朵花瓣用分生孢子悬浮液进行接种，试验结果更准确；接种后72h就可统计发病结果，效率高。

Description

一种月季灰霉病抗病性鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种月季灰霉病抗病性鉴定方法，属于植物灰霉病抗性鉴定技术领域。
背景技术
灰霉病是世界上发生和危害最严重的病害之一，病原菌为灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，可以侵染1400多种植物。灰霉病菌不仅随时可以通过植物表面或植株伤口侵染茎、叶、花或果实，影响其品质和产量，尤其是在采后高湿条件下运输和储藏时危害严重。持续的低温、阴天、高湿、光照不足、通风不良的条件下，均会引起灰霉病的发生，严重时可使产品损失50％甚至完全失去价值，所以有效防治灰霉病成为当前农业生产亟待解决的问题。
月季灰霉病是由葡萄孢属(Botrytis spp.)真菌引起的死体营养型病害，灰霉菌在低温高湿条件下生存与繁殖力很强；是月季生产上常见且危害较严重的真菌性病害，花、叶、茎均可发病，尤其是切花月季采后存在机械损伤并保存在低温高湿环境下更易受到侵染，从而造成严重的经济损失，被称为月季切花采后“癌症”。花朵受侵害时，起初花瓣上出现小斑或花瓣边缘变褐色，之后迅速扩展，花瓣变褐色腐烂萎蔫，直至整个花朵褐变枯萎。
目前有关灰霉病的抗性鉴定方法报道的有烟草、黄瓜、草莓、葡萄、苹果、芍药等植物上。关于月季灰霉病抗病性的鉴定目前没有人报道过。大多数的灰霉病抗性鉴定方法都采用菌饼接种或者用孢子喷洒植株。月季花的花朵是主要的观赏部位。灰霉病菌分生孢子、分生孢子梗和菌丝都可以作为侵染源。但是在田间，尤其是月季切花采后运输的过程中灰霉病菌的侵染源主要是分生孢子，而且采用喷洒植株的接种方式，需要的成本高，时间长，同时也会造成接种不均匀等问题。所以本发明接种材料采用完整无损伤的月季花瓣，接种3-6μL 1×105～7个/mL的孢子悬浮液来进行月季灰霉病抗性鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种月季灰霉病抗病性鉴定方法，该方法使用无创伤的月季完整花瓣接种，10-30％的马铃薯蔗糖培养基(PSB)培养液稀释孢子、接种量为3-6μL时，花瓣发病整齐均匀，不同抗性品种间差异明显；本发明所述方法具体包括以下步骤：
(1)从感染灰霉病的月季花瓣上分离纯化后得到灰霉菌株，将该菌株接种到15-35mL固体培养基上，在20-30℃黑暗条件下培养3-4周后产生分生孢子。
(2)将液体培养基稀释到质量百分比浓度为10-30％，取10-30mL倒入步骤(1)培养好的固体培养基中，刮取培养基表面的孢子及菌丝，过滤、滤去菌丝残体，获得清液，并用10-30％的液体培养基稀释，使孢子浓度为1×105～7个/mL得到孢子悬浮液。
(3)在托盘内倒入无菌水，上面覆盖一层吸水纸，水不没过纸面；取月季花完整花瓣放在吸水纸上，在每个花瓣中央接种3-6μL的孢子悬浮液，盖上托盘的盖子。
(4)72h后测量花瓣的病斑直径，并计算病斑面积，分析月季灰霉病抗性。
按以下等级进行月季花抗病性分级：
0级:接种72h后整个花瓣完全被侵染。
1级:接种72h后病斑面积超过组织的1/2。
2级:病斑面积大于液滴4倍，但小于接种组织的1/2面积。
3级:侵染扩展到液滴之外，病斑大小为液滴的2～4倍。
4级:开始侵染，病斑仅在接种液滴之内。
5级:接种液滴清澈，无任何侵染迹象。
优选的，本发明步骤(1)中固体培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)，具体配制方法为：将1L的蒸馏水烧开，新鲜去皮的马铃薯200g切成丝放入锅中，边煮边搅拌，待马铃薯软化后，过滤后取滤液，并用蒸馏水定容至1L，再加入18-22g蔗糖和18g-20g琼脂煮沸，倒入瓶子中并封口，121℃高温高压灭菌，备用。
优选的，本发明液体培养基为马铃薯蔗糖培养基(PSB)，具体配制方法为：将1L的蒸馏水烧开，新鲜去皮的马铃薯200g切成丝放入锅中，边煮边搅拌，待马铃薯软化后，过滤后取滤液，并用蒸馏水定容至1L，再加入18-22g蔗糖煮沸，倒入瓶子中并封口，121℃高温高压灭菌，备用。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述方法仅用月季花瓣接种成本低。
(2)接种时将完整花瓣用分生孢子悬浮液进行接种，试验结果更准确。
(3)接种后72h就可统计发病结果，效率高。
(4)与现用的一些抗性鉴定方法如花瓣圆片接种相比，花瓣圆片失水率高极易造成花瓣萎蔫，而且有的品种月季花瓣太小，打成圆片比较困难，不能进行鉴定；本发明花瓣的保湿效果较好，花瓣不易失水；而且不用打圆片，比较省时省力；同时无损伤接种，结果更为准确。
附图说明
图1实施例1中完整花瓣接种不同品种月季抗性差异比较；
图2实施例1中花瓣圆片接种和完整花瓣接种两种方法数据整齐度比较；
图3实施例2中灰霉菌接种不同抗性月季花瓣的发病情况；
图4实施例3中花瓣圆片接种情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
本发明实施例1～3中月季花抗性分级：
0级:接种72h后整个花瓣几乎完全被侵染；
1级:接种72h后病斑面积超过组织的1/2；
2级:病斑面积大于液滴4倍，但小于接种组织的1/2面积；
3级:侵染扩展到液滴之外，病斑大小为液滴的2～4倍；
4级:开始侵染，病斑仅在接种液滴之内；
5级:接种液滴清澈，无任何侵染迹象。
实施例1
一种月季灰霉病抗病性鉴定方法，本实施例选择了17个品种：利亚图图、王威、美琪、威斯利、洋桔哥、亚历山德拉公主、太阳地、津德雷拉、马里兰、加里娃达、艾弗的玫瑰、巴黎女人、甜美人、黑火山、紫罗兰、红色龙沙宝石、人间天堂，具体包括以下步骤：
(1)接种材料的选择：选用完整无损伤的新鲜月季花瓣，为了保证准确性将整朵花的花瓣都进行接种。
(2)培养基的配制：
本实施例中固体培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)，配制1L的PSA具体过程为：将1L的蒸馏水烧开，新鲜去皮的马铃薯200g切成丝放入锅中，边煮边搅拌，待马铃薯软化后，用四层纱布过滤，并用蒸馏水定容至1L，再加入20g蔗糖糖和18g琼脂煮沸，倒入瓶子中并封口，121℃高温高压灭菌备用。
本实施例中液体培养基为马铃薯蔗糖培养基(PSB)，配制1L的PSB具体过程为：将1L的蒸馏水烧开，新鲜去皮的马铃薯200g切成丝放入锅中，边煮边搅拌，待马铃薯软化后，用四层纱布过滤，并用蒸馏水定容至1L，再加入20g蔗糖煮沸，倒入瓶子中并封口，121℃高温高压灭菌备用。
(3)接种菌株级孢子悬浮液制备：
接种工作所使用的灰霉菌株是从感染灰霉病的月季花瓣上分离纯化后得到；该菌株在PSA培养基上，于25℃黑暗条件下培养3周后产生分生孢子。
将配置好的PSB培养基浓度稀释为20％，取15mL倒入产生分生孢子的PSA培养基中，用灭过菌的接种环刮取培养基表面的孢子及菌丝，用超细的尼龙网纱(400目)过滤，滤去菌丝残体，获得清液；孢子悬浮液使用时需现配现用；配置好的孢子悬浮液用血球计数板计数，并用20％的PSB将孢子悬浮液浓度稀释为1×106个/mL。
(4)接种：在托盘内倒入灭过菌的无菌水，上面覆盖一层吸水纸，水不能没过纸面；撕下月季花完整花瓣放在吸水纸上，在每个花瓣中央接种4μL的孢子悬浮液，盖上托盘的盖子。
(5)数据统计：72h后测量花瓣的病斑直径，并计算病斑面积，分析月季灰霉病抗性。
图1是实施例1中用完整花瓣接种17个不同品种月季抗性差异比较，由图可以看出用完整花瓣接种不同品种月季花对灰霉菌抗性差异明显；抗性2级：利亚图图、王威、美琪、威斯利、洋桔哥、压力山德拉公主；抗性3级：太阳地、津德雷拉、马里兰、加里娃达、艾弗的玫瑰、巴黎女人；抗性4级：甜美人、黑火山、紫罗兰、红色龙沙宝石、人间天堂。
图2为实施例1中部分花瓣圆片接种和完整花瓣接种数据的整齐度比较，由图可以看出用完整花瓣接种比用花瓣圆片接种数据更整齐，精确度更高。
实施例2
一种月季灰霉病抗病性鉴定方法，本实施例选择了粉红雪山和艾莎两个品种，具体包括以下步骤：
(1)接种材料的选择：选用完整无损伤的新鲜月季花瓣，为了保证准确性将整朵花的花瓣都进行接种。
(2)培养基的配制：
本实施例中固体培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)，配制1L的PSA具体过程为：将1L的蒸馏水烧开，新鲜去皮的马铃薯200g切成丝放入锅中，边煮边搅拌，待马铃薯软化后，用四层纱布过滤，并用蒸馏水定容至1L，再加入18g蔗糖糖和20g琼脂煮沸，倒入瓶子中并封口，121℃高温高压灭菌备用。
本实施例中液体培养基为马铃薯蔗糖培养基(PSB)，配制1L的PSB具体过程为：将1L的蒸馏水烧开，新鲜去皮的马铃薯200g切成丝放入锅中，边煮边搅拌，待马铃薯软化后，用四层纱布过滤，并用蒸馏水定容至1L，再加入22g蔗糖煮沸，倒入瓶子中并封口，121℃高温高压灭菌备用。
(3)接种菌株级孢子悬浮液制备：
接种工作所使用的灰霉菌株是从感染灰霉病的月季花瓣上分离纯化后得到；该菌株在PSA培养基上，于25℃黑暗条件下培养4周后产生分生孢子。
将配置好的PSB培养基浓度稀释为10％，取30mL倒入产生分生孢子的PSA培养基中，用灭过菌的接种环刮取培养基表面的孢子及菌丝，用超细的尼龙网纱(400目)过滤，滤去菌丝残体，获得清液；孢子悬浮液使用时需现配现用；配置好的孢子悬浮液用血球计数板计数，并用10％的PSB将孢子悬浮液浓度稀释为1×105个/mL。
(4)接种：在托盘内倒入灭过菌的无菌水，上面覆盖一层吸水纸，水不能没过纸面；撕下月季花完整花瓣放在吸水纸上，在每个花瓣中央接种5μL的孢子悬浮液，盖上托盘的盖子。
(5)数据统计：72h后测量花瓣的病斑直径，并计算病斑面积，分析月季灰霉病抗性。
图3是本实施例中粉红雪山和艾莎两个品种完整花瓣的发病情况，由图可以看出接种48h花瓣开始发病，但是病斑太小；接种72h后花瓣发病整齐，是最适宜的测量时间；其中，粉红雪山抗性3级，艾莎抗性1级。
实施例3
一种月季灰霉病抗病性鉴定方法，本实施例选择了光彩、何粉、国王之殿、菲特4个品种，具体包括以下步骤：
(1)接种材料的选择：选用完整无损伤的新鲜月季花瓣，为了保证准确性将整朵花的花瓣都进行接种。
(2)培养基的配制：
本实施例中固体培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)，配制1L的PSA具体过程为：将1L的蒸馏水烧开，新鲜去皮的马铃薯200g切成丝放入锅中，边煮边搅拌，待马铃薯软化后，用四层纱布过滤，并用蒸馏水定容至1L，再加入22g蔗糖糖和18g琼脂煮沸，倒入瓶子中并封口，121℃高温高压灭菌备用。
本实施例中液体培养基为马铃薯蔗糖培养基(PSB)，配制1L的PSB具体过程为：将1L的蒸馏水烧开，新鲜去皮的马铃薯200g切成丝放入锅中，边煮边搅拌，待马铃薯软化后，用四层纱布过滤，并用蒸馏水定容至1L，再加入18g蔗糖煮沸，倒入瓶子中并封口，121℃高温高压灭菌备用。
(3)接种菌株级孢子悬浮液制备：
接种工作所使用的灰霉菌株是从感染灰霉病的月季花瓣上分离纯化后得到；该菌株在PSA培养基上，于25℃黑暗条件下培养3周后产生分生孢子。
将配置好的PSB培养基浓度稀释为30％，取10mL倒入产生分生孢子的PSA培养基中，用灭过菌的接种环刮取培养基表面的孢子及菌丝，用超细的尼龙网纱(400目)过滤，滤去菌丝残体，获得清液；孢子悬浮液使用时需现配现用；配置好的孢子悬浮液用血球计数板计数，并用30％的PSB将孢子悬浮液浓度稀释为1×107个/mL。
(4)接种：在托盘内倒入灭过菌的无菌水，上面覆盖一层吸水纸，水不能没过纸面；撕下月季花完整花瓣放在吸水纸上，在每个花瓣中央接种3μL的孢子悬浮液，盖上托盘的盖子。
(5)数据统计：72h后测量花瓣的病斑直径，并计算病斑面积，分析月季灰霉病抗性；光彩抗性2级、何粉抗性3级、国王之殿抗性0级、菲特抗性1级。
图4是实施例3中光彩和何粉、国王之殿和菲特接种情况，由图可以看出用花瓣圆片接种，光彩种花瓣圆片接种易失水皱缩；国王之殿品种在同样时间内发病太快，测量困难；菲特品种病斑大小差异大，数据不整齐；因此用花瓣圆片接种对某些月季品种不太适宜。
综上所述，本发明所述方法鉴定过程中的花瓣没有伤口，花瓣不易失水；而且不用打圆片，比较省时省力；同时无损伤接种，避免了伤口刺激引起的抗性反应，结果更为准确。

Claims (3)

1.一种月季灰霉病抗病性鉴定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)从感染灰霉病的月季花瓣上分离纯化后得到灰霉菌株，将该菌株接种到15-35mL固体培养基上，在20℃～30℃黑暗条件下培养3-4周后产生分生孢子；
(2)将液体培养基稀释到质量百分比浓度为10-30％，取10-30mL倒入步骤(1)培养好的固体培养基中，刮取培养基表面的孢子及菌丝，过滤、滤去菌丝残体，获得清液，并用10-30％的液体培养基稀释，使孢子浓度为1×105～7个/mL得到孢子悬浮液；
(3)在托盘内倒入无菌水，上面覆盖一层吸水纸，水不没过纸面；取月季花完整花瓣放在吸水纸上，在每个花瓣中央接种3-6μL的孢子悬浮液，盖上托盘的盖子；
(4)72h后测量花瓣的病斑直径，并计算病斑面积，分析月季灰霉病抗性；
按以下等级进行月季花抗病性分级：
0级:接种72h后整个花瓣完全被侵染；
1级:接种72h后病斑面积超过组织的1/2；
2级:病斑面积大于液滴4倍，但小于接种组织的1/2面积；
3级:侵染扩展到液滴之外，病斑大小为液滴的2～4倍；
4级:开始侵染，病斑仅在接种液滴之内；
5级:接种液滴清澈，无任何侵染迹象。
2.根据权利要求1所述月季灰霉病抗病性鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中固体培养基为马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基，具体配制方法为：将1L的蒸馏水烧开，新鲜去皮的马铃薯200g切成丝放入锅中，边煮边搅拌，待马铃薯软化后，过滤后取滤液，并用蒸馏水定容至1L，再加入18-22g蔗糖和18-20g琼脂煮沸，倒入瓶子中并封口，121℃高温高压灭菌，备用。
3.根据权利要求1所述月季灰霉病抗病性鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中液体培养基为马铃薯蔗糖培养基，具体配制方法为：将1L的蒸馏水烧开，新鲜去皮的马铃薯200g切成丝放入锅中，边煮边搅拌，待马铃薯软化后，过滤后取滤液，并用蒸馏水定容至1L，再加入18-22g蔗糖煮沸，倒入瓶子中并封口，121℃高温高压灭菌备用。
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