CN102626035A - 一种通过孢子分离来制作虫草第一代母种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及到一种通过孢子分离来制作虫草母第一代种的方法。具体包括：选用瓶口直径约6～8cm的广口培养皿或平底罐头瓶作为孢子采集容器，并装上营养全面的培养基；采用即将成熟的虫草子实体，将其放置于培养基上方，使虫草子实体头部弹射的孢子撒落在培养基上，并在合适的培养环境下萌发成菌丝，再经过提纯复壮培养而得优良、纯正、健壮、适龄的虫草第一代母种。通过实施本发明，实现生产栽培北虫草优质、高产奠定了扎实的基础，值得大力推广。

Description

一种通过孢子分离来制作虫草第一代母种的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及到一种通过孢子分离来制作虫草母第一代种的方法。
技术背景
众所周知，在北虫草的繁育过程中，其遗传性状极不稳定，受环境、营养和繁殖代数等影响，退化和变异不可预料的随时出现，因而往往给虫草产业造成十分惊人的损失，甚至因此导致一个好端端企业破产。所以说，在北虫草栽培过程中，菌种的可靠性、稳定性是成败的关键。生产过程选育培养优良、纯正、健壮、适龄的菌种，是栽培北虫草实现优质、高产的基础。
而目前，众多的虫草栽培用户都是通过外购虫草试管母种来多代繁殖使用，菌种的退化和变异往往给这些用户带来很大的损失。有些用户知道虫草菌种容易退化和变异，他们不轻易用购买来的菌种进行多代繁殖，而是在生产过程中总是跟一些专业的菌种生产机构购买优良、纯正、健壮、适龄的第一代虫草菌种，这样在生产上有效的避免了损失，但是购买第一代菌种价格昂贵，导致生产成本高，效益低下。
目前制备优良、纯正、健壮的第一代虫草菌种主要是通过组织分离来实现，而通过组织分离制种的过程中技术工艺繁琐，所得的菌种质量也不稳定。
发明内容
本发明的目的就是克服以上技术的不足而提供全新一种通过孢子分离来制作虫草第一代母种的方法。具体包括：选用瓶口直径约6～8cm的广口培养皿或平底罐头瓶作为孢子采集容器，并装上营养全面的培养基；采用即将成熟的虫草子实体，将其放置于培养基上方，使虫草子实体头部弹射的孢子撒落在培养基上，并在合适的培养环境下萌发成菌丝，再经过提纯复壮培养而得优良、纯正、健壮、适龄的虫草第一代母种。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种通过孢子分离来制作虫草第一代母种的方法，技术方案中包括以下步骤：
1、孢子采集的容器选择：选用瓶口直径约6～8cm的广口培养皿或平底罐头瓶作为孢子采集容器。
2、1000毫升培养基的原料组成及制备方法：马铃薯250克、葡萄糖20克、蚕蛹粉20克、琼脂20克、蛋白胨5克、酵母膏(粉)6克、磷酸二氢钾2克、硫酸镁1克、VB15片、VB61片、VB121片、水1000ml；制备过程是首先将马铃薯削好皮并洗干净，切成厚度为3～4毫米的片状，然后同时和1000ml水放入锅中加热煮沸到马铃薯酥而不烂，再通过过滤取得澄清液；接着依次往澄清液添加葡萄糖、蚕蛹粉、琼脂、蛋白胨、酵母膏(粉)、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1、VB6、VB12，并将溶液的PH调节至6.5～7，最后再次加热至溶液沸腾而得培养基。
3、培养基装瓶灭菌：趁热将培养基分装于各孢子采集容器瓶里，培养基装入瓶中的厚度为0.5～0.8cm，瓶口安置上孢子分离所用的不锈钢铁钩，瓶口先用13～15cm见方的高密度无纺布密封并扎上橡皮圈，再盖上13～15cm见方的聚丙烯薄膜再扎上第二道橡皮圈封口防水，然后按常规灭菌后冷却，使培养基凝固于瓶中。
4、用于孢子分离的子实体选择：选取能代表原始菌株性状、健壮、产量高、形态好、孢子个头大、即将成熟的虫草子实体用于孢子分离。
5、子实体上瓶：在无菌环境下用镊子夹断子实体，夹取子实体孢子头部，将孢子头直接插于安置在瓶口的不锈钢铁钩上，封好无纺布盖，在封薄膜时不要全封，留一个小指头大小的透气的角孔。
6、孢子分离：将子实体已经上瓶的瓶子放于温度是22～23℃、空气相对湿度是75～80％、光照是300lx的环境中培养，3～4天后原先光洁的培养基表面会有孢子菌落出现，随后的几天会在培养基表面长满白色菌丝.
7、菌丝转管提纯：在培养基表面基本布满白色菌丝时，在无菌环境下将菌丝转接于试管斜面上进行提纯，提纯时在培养基表面的菌丝生长均匀处用接种针(钩)挑取0.3～0.5cm见方且带培养基的菌丝体，转接于试管斜面上，并按常规培养至菌丝长满试管斜面。
8、试管种转色贮存：将通过转管提纯且菌丝长满试管斜面的试管放置在温度是22～23℃、空气相对湿度是75～80％、光照是200～300lx的环境中培养，并培养至试管内菌丝的色泽转变为桔红色，将转色正常、无污染的试管母种放置于冰箱2～4℃环境中冷藏贮存。
与现有的技术相比，本发明既有如下优点：
1、本发明所提出的方法工艺新颖、简单、易实施。。
2、本发明在实施过程中，只需将子实体孢子头部夹取插于安置在瓶口的不锈钢铁钩上即可进行孢子分离，方便快捷；而传统的子实体组织分离，还要将子实体外皮剥丢后只取里面的肉块组织作为菌种，工序多且繁琐。
3、经本发明所培养出来的虫草菌丝优良、纯正、健壮、适龄，生长速度快；明显优于传统组织分离的试管菌种。
4、经本发明培育出来的的菌种成功率能达到99％。
5、通过实施本发明，实现生产栽培北虫草优质、高产奠定了扎实的基础，值得大力推广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法进一步说明。
一种通过孢子分离来制作虫草第一代母种的方法，具体实施方法如下：
1、孢子采集的容器选择：选用瓶口直径约6～8cm的广口培养皿或平底罐头瓶作为孢子采集容器。
2、1000毫升培养基的原料组成及制备方法：马铃薯250克、葡萄糖20克、蚕蛹粉20克、琼脂20克、蛋白胨5克、酵母膏(粉)6克、磷酸二氢钾2克、硫酸镁1克、VB15片、VB61片、VB121片、水1000ml；制备过程是首先将马铃薯削好皮并洗干净，切成厚度为3～4毫米的片状，然后同时和1000ml水放入锅中加热煮沸到马铃薯酥而不烂，再通过过滤取得澄清液；接着依次往澄清液添加葡萄糖、蚕蛹粉、琼脂、蛋白胨、酵母膏(粉)、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1、VB6、VB12，并将溶液的PH调节至6.5～7，最后再次加热至溶液沸腾而得培养基。
3、培养基装瓶灭菌：趁热将培养基分装于各孢子采集容器瓶里，培养基装入瓶中的厚度为0.5～0.8cm，瓶口安置上孢子分离所用的不锈钢铁钩，瓶口先用13～15cm见方的高密度无纺布密封并扎上橡皮圈，再盖上13～15cm见方的聚丙烯薄膜再扎上第二道橡皮圈封口防水，然后按常规灭菌后冷却，使培养基凝固于瓶中。
4、用于孢子分离的子实体选择：选取能代表原始菌株性状、健壮、产量高、形态好、孢子个头大、即将成熟的虫草子实体用于孢子分离。
5、子实体上瓶：在无菌环境下用镊子夹断子实体，夹取子实体孢子头部，将孢子头直接插于安置在瓶口的不锈钢铁钩上，封好无纺布盖，在封薄膜时不要全封，留一个小指头大小的透气的角孔。
6、孢子分离：将子实体已经上瓶的瓶子放于温度是22～23℃、空气相对湿度是75～80％、光照是300lx的环境中培养，3～4天后原先光洁的培养基表面会有孢子菌落出现，随后的几天会在培养基表面长满白色菌丝.
7、菌丝转管提纯：在培养基表面基本布满白色菌丝时，在无菌环境下将菌丝转接于试管斜面上进行提纯，提纯时在培养基表面的菌丝生长均匀处用接种针(钩)挑取0.3～0.5cm见方且带培养基的菌丝体，转接于试管斜面上，并按常规培养至菌丝长满试管斜面。
8、试管种转色贮存：将通过转管提纯且菌丝长满试管斜面的试管放置在温度是22～23℃、空气相对湿度是75～80％、光照是200～300lx的环境中培养，并培养至试管内菌丝的色泽转变为桔红色，将转色正常、无污染的试管母种放置于冰箱2～4℃环境中冷藏贮存。

Claims (1)

1.一种通过孢子分离来制作虫草第一代母种的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)孢子采集的容器选择：选用瓶口直径约6～8cm的广口培养皿或平底罐头瓶作为孢子采集容器；
(2)1000毫升培养基的原料组成及制备方法：马铃薯250克、葡萄糖20克、蚕蛹粉20克、琼脂20克、蛋白胨5克、酵母膏(粉)6克、磷酸二氢钾2克、硫酸镁1克、VB15片、VB61片、VB121片、水1000ml；制备过程是首先将马铃薯削好皮并洗干净，切成厚度为3～4毫米的片状，然后同时和1000ml水放入锅中加热煮沸到马铃薯酥而不烂，再通过过滤取得澄清液；接着依次往澄清液添加葡萄糖、蚕蛹粉、琼脂、蛋白胨、酵母膏(粉)、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1、VB6、VB12，并将溶液的PH调节至6.5～7，最后再次加热至溶液沸腾而得培养基；
(3)培养基装瓶灭菌：趁热将培养基分装于各孢子采集容器瓶里，培养基装入瓶中的厚度为0.5～0.8cm，瓶口安置上孢子分离所用的不锈钢铁钩，瓶口先用13～15cm见方的高密度无纺布密封并扎上橡皮圈，再盖上13～15cm见方的聚丙烯薄膜再扎上第二道橡皮圈封口防水，然后按常规灭菌后冷却，使培养基凝固于瓶中；
(4)用于孢子分离的子实体选择：选取能代表原始菌株性状、健壮、产量高、形态好、孢子个头大、即将成熟的虫草子实体用于孢子分离；
(5)子实体上瓶：在无菌环境下用镊子夹断子实体，夹取子实体孢子头部，将孢子头直接插于安置在瓶口的不锈钢铁钩上，封好无纺布盖，在封薄膜时不要全封，留一个小指头大小的透气的角孔；
(6)孢子分离：将子实体已经上瓶的瓶子放于温度是22～23℃、空气相对湿度是75～80％、光照是300lx的环境中培养，3～4天后原先光洁的培养基表面会有孢子菌落出现，随后的几天会在培养基表面长满白色菌丝；
(7)菌丝转管提纯：在培养基表面基本布满白色菌丝时，在无菌环境下将菌丝转接于试管斜面上进行提纯，提纯时在培养基表面的菌丝生长均匀处用接种针(钩)挑取0.3～0.5cm见方且带培养基的菌丝体，转接于试管斜面上，并按常规培养至菌丝长满试管斜面；
(8)试管种转色贮存：将通过转管提纯且菌丝长满试管斜面的试管放置在温度是22～23℃、空气相对湿度是75～80％、光照是200～300lx的环境中培养，并培养至试管内菌丝的色泽转变为桔红色，将转色正常、无污染的试管母种放置于冰箱2～4℃环境中冷藏贮存。
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