CN109628550B - 一种地被菊抗枯萎病品种的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属菊花抗病品种筛选技术领域，为解决目前由镰刀菌引起的菊花枯萎病进行抗性鉴定缺失的问题，提供一种地被菊抗枯萎病品种的筛选方法。在离体的地被菊叶片上接种尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌培养；进行病级划分，病情指数计算，筛选抗性品种；以筛选出的抗性品种为原材料，以地被菊的脚芽为插穗，将脚芽扦插于基质中；待扦插的脚芽展叶8‑10片后，采用伤根浸泡法进行人工接种尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌，接种后调查发病情况，并对地被菊枯萎病进行病级划分，筛选抗性品种。为地被菊抗病育种做一些前期准备工作。对16种地被菊病情指数区分度大，能准确划分出不同品种的枯萎病抗性。能快速有效的鉴定出地被菊对枯萎病的抗性。

Description

一种地被菊抗枯萎病品种的筛选方法
技术领域
本发明属于菊花抗病品种筛选技术领域，具体涉及一种地被菊抗枯萎病品种的筛选方法。
背景技术
地被菊（Chrysanthemum morifolium）为菊科菊属多年生宿根草本植物，是利用我国菊花野生种与栽培品种经反复杂交选育出的菊花品种群，不仅可以观赏，部分品种还具有较高的食用价值和药用价值。经过长期的人工培育，地被菊已成为重要的观赏和经济花卉，它具有株型低矮、花期较长、开花繁密、花色丰富、抗逆性强等特点。
我国是国际花卉界公认的拥有巨大花卉消费市场的国家，随着中国经济的不断发展，国内花卉消费市场逐渐走向成熟，市场对于地被菊的需求也日益增多。但是在生产实践中，菊花病害严重且发生普遍，不仅降低了地被菊的观赏价值和食用品质，还会因防治菊花各类病害增加人力和物力投入，提高生产成本，给花农带来一定的经济损失，同时，也影响了地被菊的景观效益和经济效益。
菊花枯萎病属于土传病原真菌性病害，由于近年来地区性的菊花枯萎病发生严重，使易于感病的菊花品种观赏性降低、产量减少，甚至品种丢失，因此对菊花枯萎病进行相关研究具有重要的现实意义。枯萎病是一种分布范围广、菌种类型多、防治困难、严重影响作物产量和品质的世界性土传病害。引起枯萎病的病原菌能在土壤中越夏越冬，使寄主的植物产生株型矮缩、叶片萎蔫变褐、根茎和花穗、花序或花朵腐烂等多种病害症状。病原菌在植物的生长过程中，通过侵入植物的维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，引起植物的枯萎甚至死亡，对植物造成毁灭性伤害，严重降低了产量和品质，在生产上较难防治。枯萎病在我国为普遍性流行病害，如经济作物香蕉、棉花、亚麻等；花卉植物菊花、百合、香石竹等；瓜类作物西瓜、黄瓜、甜瓜等；茄类作物番茄、长茄等；豆科作物蚕豆、绿豆、大豆等均有枯萎病发生。枯萎病可发生在植物的整个生长过程中，其主要发病时间在5~8月，与环境的温度和湿度密切相关。近年来，温室大棚设施不断增多，其封闭式空间和常年连作滋生了大量的病原菌，使植株感染枯萎病的病发率升高，限制了各类大棚经济作物和观赏花卉的生产和发展。目前，由镰刀菌引起的百合枯萎病发病率在我国一般为5%~30%，个别病情高发区可达40%~50%。香石竹种植区枯萎病危害严重，其中昆明地区的发病率一般为10%~30%，严重区可达70%~80%。四川、东北等地报道了瓜类作物感染枯萎病的发病率为20%，严重地块达80%~90%。我国由枯萎病引起的作物减产达20%~30%，严重区可减产50%~80%。因此，枯萎病给我国各类作物和观赏花卉带来严重危害，造成巨大经济损失，限制了我国农业的发展。
植物枯萎病的病原菌虽然种类较多，但是都存在主要的致病病原菌。毛军需等通过对百合枯萎病的鉴定，认为百合感染枯萎病的主要病原菌为尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌；Rakhimov和Khakimov经过研究认为马铃薯枯萎病是由5种不同种类的镰刀菌引起的，即串珠镰刀菌（F.moniliforme Sheld.)、尖孢镰刀菌（F.oxysporum Shlecht.）、茄病镰刀菌（F.solani Sacc.)、雪腐镰刀菌（F.nivale Ces.)、接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinumFuckel S.）；肖荣风等人对西瓜枯萎病的病原菌进行了分析和鉴定，并深入研究了该镰刀菌的生物学特性；刘洋研究了茄病镰刀菌瓜类专化型的鉴定及侵染途径，证明了茄病镰刀菌瓜类专化型对南瓜果实具有致病性，该菌可存活于种子的种皮内，并影响种子发芽情况；杨蕊芝等人将感染枯萎病的万寿菊进行了组织分离，并鉴定出主要致病菌为尖孢镰刀菌。2017年李明远等通过组织分离法对菊花病株上的病原进行分离，并观察了病菌孢子形态，鉴定菊花病样确为菊花枯萎病（Fusarium oxysporium Schl.f. chrysanthem i Snyd. &hans.）。多数研究表明，植物枯萎病的主要致病菌为镰刀菌。
典型的尖孢镰刀菌菌丝体为白色棉絮状，具有很多的小型分生孢子，呈镰刀形，大小为5-12μm×2.5-3.5μm。茄病镰刀菌属于丛赤壳科肉座菌目(Hypocreales)镰刀属(Fusarium )的一种较为常见真菌，菌丝体呈白色至浅灰色，薄绒状小型分生孢子数量多，假头状着生，卵形或肾形，5.5~11μm×2.2~4μm。大型分生孢子马特型，两端较钝，顶胞稍弯。朱育菁等人通过在特定条件下培养，对尖孢镰刀菌的生理特性进行了分析，其结果证明了生长过程中尖孢镰刀菌的OD值、pH值、菌丝干重等和培养液的发酵时间密切相关。环境显著影响尖孢镰刀菌的生长，其中酸性土壤更适宜其生存。光照、温湿度对尖孢镰刀菌的生长有较大影响，光照增强，有利于其孢子的萌发。适宜的生存温度为15℃-35℃，温度过高或过低均会抑制其孢子萌发和菌落形成。对于湿度的要求较苛刻，湿度越大菌丝体生长越旺盛。
菊花枯萎病危害严重，且防治困难，植株一经染病如果防治不当，会迅速枯萎死亡，严重影响菊花的开花量、观赏性和品质。目前，菊花枯萎病主要采用化学药剂防治，而防治该病害的最有效途径是筛选并培育抗病品种。开展菊花抗病育种工作的前提是抗病性鉴定。目前，对菊花病害的研究主要集中于白锈病、黑斑病、白粉病等方面，由镰刀菌引起的菊花枯萎病进行抗性鉴定的研究较少。因此，掌握快速有效鉴定菊花枯萎病的方法至关重要。
发明内容
本发明为了解决由镰刀菌引起的菊花枯萎病抗性鉴定缺失问题，提供了一种地被菊抗枯萎病品种的筛选方法。
本发明由如下技术方案实现的：一种地被菊抗枯萎病品种的筛选方法，（1）采用离体叶片划伤接种法，在离体的地被菊叶片上接种尖孢镰刀菌(F.oxysporum缩写为FO.）和茄病镰刀菌（F. solani缩写为FS. )后，置于25℃光照培养箱中培养7d；然后对地被菊枯萎病进行病级划分，病情指数计算，筛选抗性品种；（2）以步骤（1）筛选出的抗性品种为材料，采用伤根浸泡法进行人工接种尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌，侵染后调查发病情况，然后对地被菊枯萎病进行病级划分，病情指数计算，筛选抗性品种。
步骤（1）中选取长势一致的地被菊扦插苗，分别自顶部向下摘取第3~5片叶，75%的酒精对叶片灭菌10s，无菌水冲洗干净，划伤叶片主叶脉并依次摆放在铺有无菌滤纸的培养皿内；接种环蘸取FO.和FS.的病菌孢子于叶片上，培养皿内注无菌水保湿；接种完成后密封置于25℃光照培养箱中培养7d，每日调查地被菊叶片的发病情况并记录；
地被菊离体叶片枯萎病的4个病害分级标准为：1级：叶片发黄且带有病斑，面积占整片叶面积的10%以下；2级：病斑面积占整个叶面积的10%-35%；3级：病斑面积占整个叶面积的 36%-60% ；4级：病斑面积扩大占整个面积的61%以上。按如下公式进行病情指数计算：病情指数DI =∑[(各级病叶数×各级代表数值)/总调查叶数×最高级代表数值]×100；地被菊抗性水平分为：高抗(HR)、抗(R)、中抗（MR）、感病（S）、高感（HS）；抗性评价标准按病情指数划分：高抗(HR):0＜DI≤15；抗(R)：15＜DI≤35；中抗（MR）:35＜DI≤52；感病（S）:53＜DI≤75；高感（HS）:75＜DI。
步骤（2）中人工接种尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的具体方法为：尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌制备成浓度为2.5×107个/ml的孢子悬浮液，浸根处理30min，侵染处理后于第4、8、12、16、20d分别调查发病情况，并计算病情指数；培养地被菊的室内温度为18℃~25℃，湿度75%~90%；伤根浸泡法划分地被菊枯萎病的5个分级标准：0级：叶片无任何枯萎症状；1级：底部叶片褪绿发黄1~2片；2级:叶片变为黄褐色且萎蔫下垂不超过整株叶片数的1/2；3级：叶片枯萎1/2~3/4且生长受到抑制，部分植株茎杆呈红褐色。4级:全株严重萎蔫以致枯死；病情指数（DI）=∑[(各级病株数×各级代表数值)/调查株数×最高一级代表数值]×100%；抗性评价标准：抗性评价按病情指数划分，高抗(HR):0＜DI≤15；抗(R)：15＜DI≤35；中抗（MR）:35＜DI≤52；感病（S）:52＜DI≤73；高感（HS）:73＜DI。
本发明以地被菊为试验材料，运用离体叶片划伤接种法接种尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌对地被菊进行枯萎病抗性鉴定和品种筛选，为地被菊抗病育种做一些前期准备工作。离体叶片划伤接种法对16种地被菊病情指数区分度大，能准确鉴定出不同品种的枯萎病抗性。
通过筛选镰刀菌的接种浓度和浸根时间，研究了不同因素对地被菊枯萎病的影响，以期为菊花苗期的枯萎病鉴定提供一些理论依据。
枯萎病是菊花近年来危害严重的一种土传真菌性病害，目前国内外对菊花枯萎病的研究甚少。以地被菊为试验材料，研究不同品种的抗病性对菊花枯萎病的进一步探索具有重要意义。本发明以筛选抗病性强的地被菊品种为目的，对不同品种地被菊的抗病性进行了初步研究，得出如下结论：
（1）离体叶片划伤接种法能快速有效的鉴定出不同地被菊品种对枯萎病的抗性，通过表型观察、计算叶片接种镰刀菌后的病情指数，将16种地被菊划分成不同抗性。FO.侵染16种地被菊的抗性结果：‘紫荷长短心’和‘俏粉阁’的病情指数相对较低在15~35之间，表现为抗，属于抗病品种；‘乳荷’、‘紫霞’、‘铺地粉’的病情指数低于52，具有一定的抗性，属于中抗品种；‘鲜红’、‘火焰’、‘玲珑’、‘奥运黄云’、‘亮黄早’、‘粉妆容’的抗性较差，病情指数在53~75之间，属于感病品种；‘紫娇’、‘白龙45’、‘粉黛’、‘紫绒球’、‘11Z1’的叶片死亡率较高，病情指数均超过75，属于高感品种。FS.侵染16种地被菊的抗性结果：‘俏粉阁’、‘紫荷长短心’、‘紫霞’的病情指数低于35，属于抗病品种；‘鲜红’、‘乳荷’、‘奥运黄云’的病情指数相对较高在35~52之间，属于中抗品种；‘火焰’、‘玲珑’、‘亮黄早’、‘铺地粉’的病情指数高于53，属于感病品种；紫娇’、‘白龙45’、‘粉黛’、‘紫绒球’、‘11Z1’、‘粉妆容’对FS.的抗性最差，属于高感品种。其中，‘俏粉阁’、‘乳荷’、‘紫荷长短心’对FO.和FS.的抗性表现一致均为抗病性较强的优良品种。
（2）镰刀菌不同接种浓度和时间对地被菊枯萎病具有显著影响。FO.和FS.的孢子悬浮液浓度为2.5×107个/ml，浸根时间为30min时的镰刀菌的致病力最强，地被菊感染枯萎病后的病情指数随着感病时间的增加快速上升，接种处理20d时‘火焰’和‘乳荷’的抗性差异显著，表明地被菊苗期鉴定最适宜的接种浓度为2.5×107个/ml，浸根时间为30min。
附图说明
图1为离体叶片划伤接种法对地被菊尖孢镰刀菌枯萎病7d时的抗性筛选结果；图中：a. 第一排从左到右的品种依次为‘鲜红’、‘火焰’、‘俏粉阁’、‘乳荷’，第二排从左到右的品种依次为‘玲珑’、‘奥运黄云’、’紫荷长短心’、‘紫霞’；b.第一排从左到右的品种依次为‘紫娇’、‘白龙45’、‘亮黄早’、‘粉黛’，第二排从左到右的品种依次为‘紫绒球’、‘11Z1’、‘铺地粉’、‘粉妆容’。
图2为离体叶片划伤接种法对地被菊茄病镰刀菌枯萎病7d时的抗性筛选结果；图中：a. 第一排从左到右的品种依次为‘鲜红’、‘火焰’、‘俏粉阁’、‘乳荷’，第二排从左到右的品种依次为‘玲珑’、‘奥运黄云’、’紫荷长短心’、‘紫霞’；b.第一排从左到右的品种依次为‘紫娇’、‘白龙45’、‘亮黄早’、‘粉黛’，第二排从左到右的品种依次为‘紫绒球’、‘11Z1’、‘铺地粉’、‘粉妆容’。
图3为镰刀菌浸根30min，不同接种浓度对‘乳荷’枯萎病的影响照片，图中：a为接种尖孢镰刀菌；b为接种茄病镰刀菌；图中从左到右接种浓度依次为：对照、2.5×107个/ml、2.5×106个/ml、2.5×105个/ml、2.5×104个/ml。
图4为镰刀菌不同接种浓度对‘火焰’枯萎病的影响；图中：a为接种尖孢镰刀菌；b为接种茄病镰刀菌；图中从左到右接种浓度依次为：对照、2.5×107个/ml、2.5×106个/ml、2.5×105个/ml、2.5×104个/ml。
图5为不同品种地被菊对枯萎病的发病情况；图中：a为接种尖孢镰刀菌；b为接种茄病镰刀菌；植株从左到右的品种依次为：‘俏粉阁’、‘乳荷’、‘鲜红’、‘火焰’、‘玲珑’。
具体实施方式
1、离体叶片划伤接种法进行枯萎病抗性筛选
将FO.和FS. 接种在PDA固体培养基上，28℃恒温培养7d后用于离体叶片抗病鉴定。地被菊离体叶片枯萎病的病害症状表现为：叶片从叶面边缘或叶脉中心部位微褪绿变黄，产生黑斑或黄褐斑，并随着病情的加重逐步扩大至整个叶面，使叶片完全失绿，变成黑褐色。
采用离体叶片接种法对16种地被菊叶片进行划伤接种。选取长势一致的地被菊扦插苗，分别自顶部向下摘取第3~5片叶，用75%的酒精对叶片灭菌10s，无菌水冲洗干净，用接种针划伤叶片主脉并依次摆放在铺有无菌滤纸的培养皿内。接种环蘸取病菌孢子于叶片上，培养皿内注无菌水保湿。每个品种分别接种FO.和FS.，以不接菌种的离体叶片为对照，每处理选取10片叶子，共3个处理，3次重复。接种完成后置于25℃光照培养箱中培养7d，每日调查地被菊叶片的发病情况并记录。
地被菊离体叶片枯萎病的分级和抗性评价标准：参考文献《张丽丽.百合抗枯萎病研究[D].河北农业大学, 2013.》中的百合枯萎病的病级划分标准，建立地被菊离体叶片枯萎病的4个病害分级标准。1级：叶片发黄且带有病斑，面积占整片叶面积的10%以下；2级：病斑面积占整个叶面积的10%-35%；3级：病斑面积占整个叶面积的 36%-60% ；4级：病斑面积扩大占整个面积的61%以上。按如下公式进行病情指数计算：
病情指数（DI）=∑[(各级病叶数×各级代表数值)/总调查叶数×最高级代表数值]×100。
地被菊抗性水平分为：高抗(HR)、抗(R)、中抗（MR）、感病（S）、高感（HS）。
抗性评价标准按病情指数划分：高抗(HR):0＜DI≤15；抗(R)：15＜DI≤35；中抗（MR）:35＜DI≤52；感病（S）:53＜DI≤75；高感（HS）:75＜DI。
统计分析方法：应用excel 2010和SPSS17.0统计软件处理数据，进行方差分析，试验结果以平均值表达。
离体叶片划伤接种法对尖孢镰刀菌枯萎病抗性筛选结果：采用离体叶片划伤接种法接种FO.，16种地被菊抗病性见表1。从表1可以看出，不同品种的地被菊接种FO.后对枯萎病的抗性具有显著差异。其中‘俏粉阁’和‘紫荷长短心’的病情指数分别是16.67和31.67，根据地被菊叶片枯萎病抗性评价标准划分为抗，其中‘俏粉阁’的病情指数最低。‘乳荷’、‘紫霞’、‘铺地粉’的病情指数分别是40.83、43.33、41.67，它们的病情指数在35~52之间，表现为中抗。‘鲜红’、‘火焰’、‘玲珑’、‘奥运黄云’、‘亮黄早’、‘粉妆容’的病情指数依次为58.33、65.83、64.17、55.83、71.67、70.83，病情指数在53~75之间，为感病品种。‘紫娇’、‘白龙45’、‘粉黛’、‘紫绒球’、‘11Z1’的病情指数分别是100、80.83、96.67、85、96.67，病情指数高于75，表现为高感，其中‘紫娇’的感病率达到100%。
在供试的16种地被菊中，对FO.枯萎病抗性的表现由强到弱依次为：‘俏粉阁’＞‘紫荷长短心’＞‘乳荷’＞‘铺地粉’＞紫霞’＞‘奥运黄云’＞‘鲜红’＞‘玲珑’＞‘火焰’＞‘粉妆容’＞‘亮黄早’＞‘白龙45’＞‘紫绒球’＞‘粉黛’＞‘11Z1’＞‘紫娇’。其中‘俏粉阁’和‘紫荷长短心’属于抗病品种；‘乳荷’、‘紫霞’、‘铺地粉’属于中抗品种；‘鲜红’、‘火焰’、‘玲珑’、‘奥运黄云’、‘亮黄早’、‘粉妆容’属于感病品种；‘紫娇’、‘白龙45’、‘粉黛’、‘紫绒球’、‘11Z1’属于高感品种。
表1 离体叶片划伤接种法对地被菊尖孢镰刀菌枯萎病的抗性筛选
Figure DEST_PATH_IMAGE001
离体叶片划伤接种法对FS抗性筛选：地被菊接种FS.的抗病性鉴定结果见表2。从表2可以看出，16种地被菊对FS.的枯萎病抗性具有显著差异。‘俏粉阁’、‘紫荷长短心’、‘紫霞’接种FS.后的病情指数分别是30、32.5、27.5，根据地被菊抗病评价标准划分为抗。‘鲜红’、‘乳荷’、‘奥运黄云’的病情指数依次为47.5、50.83、40.83，病情指数在35~52之间，表现为中抗。‘火焰’、‘玲珑’、‘亮黄早’、‘铺地粉’感染枯萎病后的病情指数分别为56.67、71.67、67.5、64.17，病情指数在53~75之间，划分为感病。‘紫娇’、‘白龙45’、‘粉黛’、‘紫绒球’、‘11Z1’、‘粉妆容’的病情指数依次为86.67、98.33、93.33、76.67、81.67、83.33，病情指数高于75，表现为高感。
表2 离体叶片划伤接种法对地被菊茄病镰刀菌枯萎病的抗性筛选
Figure 453228DEST_PATH_IMAGE002
采用离体叶片划伤接种法鉴定，16种地被菊对茄病镰刀菌的枯萎病抗性由强到弱依次为：‘紫霞’＞‘俏粉阁’＞‘紫荷长短心’＞‘奥运黄云’＞‘鲜红’＞‘乳荷’＞‘火焰’＞‘铺地粉’＞‘亮黄早’＞‘玲珑’＞‘紫绒球’＞‘11Z1’＞‘粉妆容’＞‘紫娇’＞‘粉黛’＞‘白龙45’。其中‘俏粉阁’、‘紫荷长短心’、‘紫霞’属于抗病品种；‘鲜红’、‘乳荷’、‘奥运黄云’属于中抗品种；‘火焰’、‘玲珑’、‘亮黄早’、‘铺地粉’属于感病品种；‘紫娇’、‘白龙45’、‘粉黛’、‘紫绒球’、‘11Z1’、‘粉妆容’属于高感品种。
相同病发条件下，不同品种的地被菊存在明显的抗病性差异，当病原菌不同时，同一个品种的病情指数也会发生变化。本发明通过离体叶片划伤接种法对16种地被菊进行了镰刀菌枯萎病抗性鉴定，其中，‘鲜红’、‘奥运黄云’、‘紫霞’、‘铺地粉’、‘粉妆容’对FO.和FS.的抗性鉴定结果不同。‘鲜红’和‘奥运黄云’对FO.的抵抗力较差，表现为感病，而‘对FS.具有一定的抗病能力，表现为中抗。‘紫霞’对FO和FS.都属于抗性相对较强的品种，但对FO.的抗性稍弱表现为中抗。‘铺地粉’和‘粉妆容’对FO.的抗病能力强于FS.，其中‘铺地粉’对FO.的抗性较强表现为中抗。这5种地被菊对FO.和FS.的抗性表现不同，可能是其对两种不同镰刀菌产生的应激反应不同，其抵抗能力具有一定的差异性。
菊花枯萎病的鉴定方法国内外研究较少，参考其他植物抗病的相关报道寻找一个快速有效的鉴定方法尤为重要。Morrison等曾用子叶接种法对植物进行离体抗病鉴定。而地被菊的离体组织器官保存时间较长，其叶片有约一周的保绿时间，可以进行离体叶片划伤鉴定，具有一定的准确性和稳定性。离体叶片划伤接种法对16种地被菊病情指数区分度大，能准确划分出不同品种的枯萎病抗性。张海旺等通过活体喷雾接种、叶片无划伤和离体叶片划伤接种法进行对比，也证明了离体叶片划伤接种法能准确鉴定水稻的抗病性，支持了本试验的方法。
综上所述，离体叶片划伤接种法能快速有效的鉴定出地被菊对枯萎病的抗性。其中，‘俏粉阁’、‘乳荷’、‘紫荷长短心’对FO.和FS.的抗性表现一致均为抗病性较强的优良品种。本文只对地被菊同一苗龄的中部叶片进行了研究和鉴定，其不同苗龄叶片和不同组织器官的感病情况还有待考证。
2、伤根浸泡接种法进行枯萎病抗性筛选
以地被菊的脚芽为插穗，去掉下部叶片，保留顶部1-2片叶子，在浓度为1 g·L-1生根粉溶液中浸泡15 min。采用沙土、营养土、蛭石配比为3：2：1的基质，将脚芽扦插于105孔穴盘内。待扦插的脚芽展叶8-10片后，进行人工接种镰刀菌。
采用地被菊枯萎病抗性鉴定结果，选取中抗品种‘乳荷’和感病品种‘火焰’为试验材料。供试菌种为尖孢镰刀菌(FO.)和茄病镰刀菌（FS.)。室内温度18℃~25℃，湿度75%~90%。
A、不同镰刀菌接种浓度处理：孢子悬浮液的制备：分别选取培养7d的FO.和FS.，在培养皿内加入5ml灭菌水，将菌丝刮净后用移液枪吸入液体，打进装有无菌滤纸的漏斗内过滤菌液到烧杯中，分装于10ml离心管里摇匀，制成镰刀菌孢子悬浮液。用血球计数板计算孢子数量并用无菌水调整悬浮液浓度。
选取长势一致的菊花扦插苗，采用伤根浸泡法，分别在浓度为2.5×104、2.5×105、2.5×106、2.5×107个/ml的孢子悬浮液中浸根处理30min，以蒸馏水浸根为对照，每个处理重复3次。接种处理后于第4、8、12、16、20d分别调查发病情况，并计算病情指数。
B、不同镰刀菌浸根时间处理：分别配制FO.和FS.的孢子悬浮液，通过血球计数板调整孢子悬浮液浓度为2.5×107个/ml。选取长势一致的扦插苗，将‘乳荷’和‘火焰’分别伤根浸泡15min和30min，以蒸馏水浸根为对照，每个处理重复3次。接种处理后于第4、8、12、16、20d分别调查发病情况，计算病情指数。
C、地被菊枯萎病的分级和抗性评价标准：地被菊枯萎病苗期的病发症状表现为染病初期植株萎蔫下垂，自下部叶片开始褪绿黄化，随着病害程度加重，植株生长延缓，叶片黄化数量和面积不断向上延伸，部分植株茎杆呈现红褐色，病情严重时可致植株枯萎死亡。参考吕红豪甘蓝枯萎病病级划分标准，建立地被菊枯萎病的5个分级标准。地被菊枯萎病分级标准：0级：叶片无任何枯萎症状；1级：底部叶片褪绿发黄1~2片；2级:叶片变黄褐色且萎蔫下垂不超过整株叶片数的1/2；3级：叶片枯萎1/2~3/4且生长受到抑制，部分植株茎杆会发红褐色。4级:全株严重萎蔫以致枯死。
病情指数（DI）=∑[(各级病株数×各级代表数值)/调查株数×最高一级代表数值]×100%。
抗性评价标准：抗性评价按病情指数划分，高抗(HR):0＜DI≤15；抗(R)：15＜DI≤35；中抗（MR）:35＜DI≤52；感病（S）:52＜DI≤73；高感（HS）:73＜DI。
D、统计分析方法：应用excel 2010统计软件处理数据，采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，Duncan新复极差法进行多重比较（P＜0.05为显著差异）。
E、结果与分析：
（1）不同浓度镰刀菌对地被菊枯萎病情况的影响：不同浓度的FO.和FS.孢子悬浮液对地被菊枯萎病发病情况的影响不同，结果见表3、表4。地被菊伤根浸泡处理30min，‘火焰’和‘乳荷’的病情指数随着接种浓度的增加呈现上升趋势。当FO.和FS.的侵染浓度为2.5×104个/ml时，‘火焰’和‘乳荷’的发病情况没有明显差异且病情指数低。孢子悬浮液的浓度在2.5×105个/ml时，接种处理20d时，FS.侵染‘乳荷’和‘火焰’的病情指数分别为22.08和32.92，依据地被菊苗期抗性评价标准划分为抗，FO.侵染‘乳荷’的病情指数为25.83，表现为抗，而‘火焰’的病情指数为39.58，表现为中抗；当FO.的侵染浓度为2.5×106个/ml时，20d时‘乳荷’和‘火焰’的病情指数分别为30.83和43.75，与浓度为2.5×105个/ml时的病情指数无显著差异。FS.侵染浓度在2.5×106个/ml时，‘乳荷’和‘火焰’接种20d的病情指数是26.25和42.92，分别表现为抗和中抗；当FO.和FS.的侵染浓度为2.5×107个/ml时，‘乳荷’和‘火焰’的病情指数上升趋势明显，病发速度较快，侵染20d时两个品种的病情指数差异显著（P＜0.05），分别划分为中抗和感病。
表3不同浓度尖孢镰刀菌对地被菊发病情况的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表中数据为平均值±标准误，小写字母表示处理间的显著差异（P＜0.05），下表同。
表4不同浓度茄病镰刀菌对地被菊发病情况的影响
Figure 308052DEST_PATH_IMAGE004
(2) 不同浸根时间对地被菊枯萎病情况的影响：镰刀菌不同浸根时间对地被菊枯萎病有显著影响，结果见表5、表6。镰刀菌的浸根时间越长，地被菊的发病情况越严重。由表5可知，地被菊接种FO.浸根15min时，‘乳荷’和‘火焰’的病情指数呈上升趋势，16d后病发速度变慢。‘乳荷’和‘火焰’浸根处理20d时的病情指数是34.17和43.75，根据地被菊枯萎病苗期抗性评价标准划分为抗和中抗。当FO.浸根时间为30min时，接种处理4d后‘火焰’的病情指数上升速率较快，在接种第20d后的病情指数是55.42，表现为感病。‘乳荷’接种处理4~12d时，病发速度最快，之后的病情指数上升速率减慢，20d时的病情指数是43.75表现为中抗；从表6可以看出，当地被菊接种FS.浸根15min时，‘乳荷’和‘火焰’的病情指数上升速度较慢，接种处理20d的病情指数分别为26.67和41.67，划分为抗和中抗，与FO.浸根15min的抗性表现相同。FS.浸根时间为30min时，‘乳荷’和‘火焰’的病情指数上升趋势相对较快，侵染后20d的病情指数差异显著分别是37.08和53.75，表现为中抗和感病。
表5 尖孢镰刀菌不同浸根时间对地被菊发病情况的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表6 茄病镰刀菌不同浸根时间对地被菊发病情况的影响
Figure 25472DEST_PATH_IMAGE006
枯萎病属于土传性病害，掌握地被菊枯萎病发病规律，探究不同因素对地被菊枯萎病的影响，有利于深入研究菊花枯萎病的病发条件，为枯萎病的防治提供一些理论依据。覃柳燕等利用伤根淋灌法对香蕉盆栽苗进行室内接种香蕉枯萎病菌菌株FOC4和拮抗菌PZ6，研究了PZ6菌株对香蕉苗的促生和防治效果。姜子德等认为浸根接种法和灌根接种法均可使一品红感染枯萎病，而浸根接种尖孢镰刀菌的发病速度更快。从前述结果中可以看到‘乳荷’和‘火焰’在镰刀菌不同接种浓度和浸根时间下均可发病，表明FO.和FS.通过伤根浸泡法可以成功侵染地被菊。
本发明对镰刀菌的接种浓度和浸根时间做不同处理，研究了影响枯萎病发病情况的主要因素。结果表明镰刀菌的接种浓度越高，致病性越强。FO.和FS.在孢子悬浮液浓度为2.5×107个/ml时侵染‘火焰’和‘乳荷’的病情指数上升趋势最快，其病情指数在接种第20d达到最大值，两个品种的抗性差异显著，说明该浓度的镰刀菌侵染力最强。这一结果与百合、西瓜、番茄等筛选出的镰刀菌致病浓度不同，其侵染力最强的孢子悬浮液浓度为106个/ml，这可能是由于地被菊本身抗逆性强，对枯萎病的抗病能力强于其它花卉和作物，需要提高镰刀菌的浓度才能有效区分不同品种的抗病性。浸根时间对菊花枯萎病也有显著影响，浸根时间越长，染病程度越严重。FO.和FS.浸根处理30min时，‘乳荷’和‘火焰’的发病速度较快且病情指数的抗性表现与离体叶片抗性鉴定结果一致，表明镰刀菌浸根30min的致病性最强，是FO.和FS.的最佳浸根时间。而张丽丽等认为镰刀菌孢子悬浮液的浸根时间不宜超过30min，与本发明结果不一致。导致该结果的原因可能是地被菊抗逆性强，浸根时间越长，镰刀菌的分生孢子与地被菊根部接触越充分，大量的镰刀菌孢子通过根部伤口侵入植物体内破坏组织细胞，从而加强了镰刀菌的致病能力，使植株病害程度加重。

Claims (1)

1.一种地被菊抗枯萎病品种的筛选方法，其特征在于：（1）采用离体叶片划伤接种法，在离体的地被菊叶片上接种尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌，接种完后置于25℃光照培养箱中培养7天；然后对地被菊枯萎病进行病级划分，病情指数计算，筛选抗性品种；（2）以步骤（1）筛选出的抗性品种为原材料，以地被菊的脚芽为插穗，去掉下部叶片，保留顶部1-2片叶子，在浓度为1 g·L-1生根粉溶液中浸泡15分钟；将脚芽扦插于基质中；待扦插的脚芽展叶8-10片后，采用伤根浸泡法进行人工接种尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌，接种后调查发病情况，并对地被菊枯萎病进行病级划分，病情指数计算，筛选抗性品种；
步骤（1）中选取长势一致的地被菊扦插苗，分别自顶部向下摘取第3-5片叶，75%的酒精对叶片灭菌10秒，无菌水冲洗干净，划伤叶片主叶脉并依次摆放在铺有无菌滤纸的培养皿内；接种环蘸取尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的病菌孢子于叶片上，培养皿内注无菌水保湿；接种完成后密封置于25℃光照培养箱中培养7天，每日调查地被菊叶片的发病情况并记录；
地被菊离体叶片枯萎病的4个病害分级标准为：1级：叶片发黄且带有病斑，面积占整片叶面积的10%以下；2级：病斑面积占整个叶面积的10%-35%；3级：病斑面积占整个叶面积的36%-60% ；4级：病斑面积扩大占整个面积的61%以上；按如下公式进行病情指数计算：病情指数DI =∑[(各级病叶数×各级代表数值)/总调查叶数×最高级代表数值]×100；所述最高级代表数值为4；
地被菊抗性水平分为：高抗、抗、中抗、感病、高感；抗性评价标准按病情指数划分：高抗:0＜DI≤15；抗：15＜DI≤35；中抗:35＜DI≤52；感病:53＜DI≤75；高感:75＜DI；
步骤（2）中人工接种尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的具体方法为：尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌制备成浓度为2.5×107个/ml的孢子悬浮液，浸根处理30分钟，侵染处理后于第4天、8天、12天、16天、20天分别调查发病情况，并计算病情指数；伤根浸泡法地被菊枯萎病的5个分级标准：0级：叶片无任何枯萎症状；1级：底部叶片褪绿发黄1-2片；2级:叶片变黄褐色且萎蔫下垂不超过整株叶片数的1/2；3级：叶片枯萎1/2-3/4且生长受到抑制，部分植株茎杆呈红褐色；4级：全株严重萎蔫以致枯死；病情指数=∑[(各级病株数×各级代表数值)/调查株数×最高一级代表数值]×100%；所述最高一级代表数值为4；
抗性评价标准：抗性评价按病情指数划分，高抗:0＜DI≤15；抗：15＜DI≤35；中抗:35＜DI≤52；感病:53＜DI≤73；高感:74＜DI。
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