CN103382453A

CN103382453A - 来自具有储藏根的草本植物形成层的植物干细胞系及其分离方法

Info

Publication number: CN103382453A
Application number: CN2013102804915A
Authority: CN
Inventors: 张美玉; 李恩景; 陈荣雨
Original assignee: UNWHA BIOTECH CORP
Current assignee: UNWHA BIOTECH CORP
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2008-09-22
Publication date: 2013-11-06
Also published as: ZA201001572B; CN101939414B; AU2008301352A1; CA2700340A1; EP2220211A2; US20100233813A1; KR101064518B1; AU2008301352B2; US8247230B2; KR20090031307A; AP2010005189A0; US20130137178A1; EP2220211B1; WO2009038417A3; MY162649A; BRPI0815959A2; JP2010539900A; WO2009038417A2; EP2220211A4; HK1147517A1

Abstract

本发明涉及来自具有储藏根的草本植物形成层的植物细胞系及其分离方法，更具体涉及具有细胞分裂能力的来自形成层的同质细胞系及其分离方法，所述细胞系从具有储藏根的草本植物的含有形成层的储藏组织得到而不需要单独的去分化步骤。来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系具有活跃的分裂能力并且是同质的。而且，其在培养过程中是稳定的，因为其没有经过去分化步骤。因此，通过对其增殖的优化，细胞系可在短时间内大量增殖。因此，本发明的来自具有储藏根的草本植物的形成层的细胞系能够生产由于与培养周期、培养土壤的选择、培养成本以及类似因素有关的各种问题而难以在户外培养的大量有用植物。

Description

来自具有储藏根的草本植物形成层的植物干细胞系及其分离方法

本申请是2008年9月22日提交的200880108091.3号发明专利申请“来自具有储藏根的草本植物形成层的植物干细胞系及其分离方法”的分案申请。

【技术领域】

本发明涉及来自具有储藏根的草本植物形成层的植物细胞系及其分离方法，更具体涉及具有细胞分裂能力的来自形成层的同质细胞系及其分离方法，所述细胞系从具有储藏根的草本植物的含有形成层的储藏根组织得到而不需要单独的去分化步骤。

【背景技术】

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)含有大量有用物质，诸如人参皂苷、聚乙炔化合物、多酚化合物、含具有宿主防御功能的蛋白质的多糖、具有抗补体活性的多糖以及酸性多糖。但是，其难以培养并可引起与杀虫剂污染、环境破坏等有关的问题。另外，其非常昂贵，因为其必须培养至少4年以便将其储藏根用于医疗目的，因此需要大量的人力和成本。

由于这种原因，已经进行了有关使用生物工程方法在体外生产大量人参细胞或者大量生产人参不定根、毛根以及类似物的方法的研究。据报道，通过使用这种细胞培养方法体外培养人参细胞得到的细胞团(被称为愈伤组织)的生长速度高于野外得到的人参植物(韩国专利注册10-0333559)，并且培养的人参细胞的皂苷含量没有明显低于人参根的皂苷含量(Asaka等人，Plant Med.，59:345，1993)。

因此，通过培养人参不定根(人参或者野山参-Korea ForestService，CBN Biotech，Neobio，KT&G Research Institute，MicroplantsBioscience&Biotechnology等)或者人参细胞(Nitto Denko，Japan等)得到的物质正在被用作食物和化妆品的原材料(韩国专利注册10-0601903、韩国专利注册10-0637342、韩国专利公开10-2004-0014584)。特别是，野山参(true wild ginseng)非常稀有并且非常昂贵，集中在培养不定根及其种子以大量生产人参产品的研究已经在各个公司和研究所活跃地进行(韩国专利公开10-2005-0078372)。

当培养草本植物诸如人参、野山参及类似物时，待用作培养材料的组织是根，即储藏根。储藏根组织是在土壤中长期掩埋以形成与土壤微生物的各种关系同时在其生命过程中吸收土壤中的水分和无机养分的部分。为了在植物细胞或者组织培养中使用储藏根组织，需要对组织进行灭菌。但是，有许多难以从根部组织中通过表面灭菌除去微生物的报道，因为高浓度的灭菌液将破坏组织，而低浓度的灭菌液将引起组织被各种真菌和细菌污染。尤其是在土壤中长期生长的野外培养的人参和野山参的情况下，这种污染现象变得严峻(韩国专利注册10-0478213；Teng，W.L.等人，Plant Cell Tissue Organ Cult.，68:233，2002)。

而且，为了在植物储藏组织中生产大量的人参储藏根细胞，在目前已知的任何类型的生产方法中都必须将人参组织进行处理以便使储藏根(分化的组织)去分化成未分化的组织。在此过程中，不可避免地会出现体细胞无性系变异。换句话说，为了使用植物组织培养技术大量生产人参细胞，必须使用遗传稳定的样品作为材料以便减少体细胞无性系变异。据韩国专利公开10-2005-0078372报道，即便使用任何人参组织基本上都出现体细胞无性系变异。

同时，形成层是使茎和根加厚以便允许植物体积(volumetrically)增大。据报道，当其中出现大多数活跃细胞分裂的分生组织形成层被用作植物细胞组织培养的外植体时，细胞的迅速和大量生产成为可能(韩国专利注册10-0533120)。有关这种形成层的结构和超微结构的研究由于在材料使用方面的内在技术困难而进展缓慢。据报道，由于形成层由一些狭窄、细长薄壁细胞层构成，在提取过程中很容易受到损伤。而且据报道，高度空泡化的活跃分生组织细胞即便通过采用电子显微镜的常规方法或者通过新近发展的技术也难以固定以便在原位研究蛋白质、RNA和其他分子的位置(Lachaud Suzanne等人，LifeScience，633，1999)。

另外，连续形成层的机械切片没有被广泛使用，这被认为是由于分离具有很长的长度和很薄的细胞壁的形成层细胞的技术难度。在许多研究中，已经报道，在次级维管组织的结构反映了形成层的假设的前体下，形成层细胞的形状、尺寸和排列的特征间接地以形成层衍生物的结构为基础(Kitin，P.等人，Ann.Bot.，86:1109，2000)。换句话说，一些研究表明在直接使用形成层作为在各种领域进行研究的材料存在许多困难。

由本发明的部分发明人开发的韩国专利注册10-0533120公开了使用从植物的茎收集的形成层诱导愈伤组织的方法。该注册专利涉及用于迅速大量得到植物细胞的植物细胞培养方法，并提到通过从植物茎部收集的形成层诱导愈伤组织而不是使用一般的种子培养方法的植物细胞培养方法。该注册专利建议了在添加高浓度植物激素毒莠定和赤霉素的情况下通过使用木本植物茎的形成层诱导形成层细胞的方法，但在该注册专利中，愈伤组织仅仅从木本植物茎的形成层被诱导。由于愈伤组织是通过去分化过程形成的组织，该注册专利仍具有由去分化引起的变异问题。

此外，本发明的一些发明人开发了PCT/KR2006/001544发明，其解决了由去分化引起的变异问题，并涉及提供可稳定增殖并具有高度遗传稳定性的细胞系的方法。在该PCT申请中公开的方法也使用木本植物茎的形成层，但由于草本植物诸如人参植物的形态学和生理学特征与木本植物的不同，存在开发考虑草本植物特征的改进发明的需要，以便诱导来自草本植物的储藏根组织的形成层的细胞系。

因此，本发明的发明人付出了极大的努力以得到植物细胞系，其为具有分裂能力并且不经过去分化过程的同质细胞系，因此在培养过程中没有体细胞无性系变异。结果，本发明的发明人通过将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织并在含有特定植物激素的培养基中培养储藏根，分离了来自形成层的细胞系，并发现分离的细胞系为同质细胞系，其具有无限分裂能力，不需要去分化过程即可分离以便不具有体细胞无性系变异，由此在遗传上高度稳定并且在生理上是均一的，由此完成了本发明。

【发明内容】

本发明的一个目的在于提供来自草本植物储藏根形成层的细胞系，其具有分裂能力，同质并可在培养过程中稳定增殖。

本发明的另一目的在于提供分离所述细胞系而不使用去分化步骤的方法。

为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供了分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)得到含形成层的具有储藏根的草本植物的储藏根组织；

(b)通过在含有IAA(吲哚-3-乙酸)或者IBA(吲哚-3-丁酸)的培养基中培养得到的含有形成层的储藏根组织以诱导来自形成层的细胞系，其中在培养过程中、之前或之后将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织；以及

(c)收集诱导的形成层细胞系。

在另一方面，本发明提供了细胞系，其来自具有储藏根的草本植物形成层，并具有下列特征：

(a)其固有地处于未分化状态；

(b)其为同质细胞系；并且

(c)其以大量液泡为形态学特征。

在再一方面，本发明提供了保藏草本植物细胞系的方法，包括冷冻来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系。

通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将更加明确。

【附图说明】

图1示出了在本发明中使用的户外培养的人参的典型特征；

图2示出了从植物储藏组织中制备的含有形成层的人参储藏根的外植体的特征；

图3(a)示出了具有分裂能力的同质细胞系在人参根部的含形成层的外植体的形成层中特异性地被诱导，图3(b)示出了当使用常用培养系统时，外植体的剖面的细胞均被诱导；

图4(a)示出了来自人参根部形成层的细胞系在将其从培养基中分离之前被诱导、分离并允许在生长培养基中增殖，图4(b)显示来自形成层的细胞系被分离并允许大量增殖，图4(c)显示来自形成层的细胞系在光学显微镜下以单细胞水平被观察，并且图4(d)显示来自人参子叶的愈伤组织(KCTC10224)在光学显微镜下以单细胞水平被观察；

图5(a)显示具有分裂能力的同质细胞系在含有野山参形成层的外植体的形成层中特异性地被诱导，图5(b)显示来自形成层的细胞系被分离并允许大量增殖，并且图5(c)显示单细胞水平的来自形成层的细胞系的光学显微照片；

图6示出了来自形成层的同质细胞系在含有胡萝卜根部形成层的外植体中被诱导；

图7示出了根据培养阶段的来自人参形成层的细胞系(A)和来自人参子叶的细胞系(B)的生长曲线；

图8(a)是显示来自人参形成层的细胞系以单细胞种群存在的显微照片，图8(b)是显示来自人参子叶的同质细胞系以大细胞团种群存在的显微照片；

图9示出了来自野山参形成层的细胞系的摇瓶培养(图9(a))、3L生物反应器培养(图9(b))和20L生物反应器培养(图9(c))的照片；

图10是示意性示出了通过紫外线(UVB)照射而增加的MMP-1表达在使用不同浓度的来自野山参形成层的同质细胞系提取物或其培养物处理并使用UVB照射的正常人皮肤成纤维细胞(NHF)中是否受到野山参形成层的同质细胞系提取物或其培养物的抑制的图表。在图10中，人参湿细胞，人参干细胞，培养人参细胞的培养基，E1:第一诱发期(elicitation1stage)，E2:第二诱发期，G:生长期，以及RA:维甲酸；

图11是示意性使出了由紫外线(UVB)照射引起的活性氧增加在使用变化浓度的来自野山参形成层的同质细胞系提取物或其培养物处理并使用UVB照射的正常人皮肤成纤维细胞(NHF)中是否受到野山参形成层的同质细胞系提取物或其培养物的抑制的图表。在图11中，人参湿细胞，人参干细胞，培养人参细胞的培养基，E1:第一诱发期(elicitation1stage)，E2:第二诱发期，G:生长期。

【具体实施方式】

除非特别限定，这里使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常所理解的具有相同含义。一般说来，这里使用的各种术语的定义在本领域是公知且常用的。

在一个方面，本发明涉及分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法。

当使用已经为分化组织的叶子、茎或根时，它们必需经历去分化过程，其中将分化组织恢复成未分化组织，以便形成愈伤组织。在去分化过程中，出现体细胞无性系变异，导致细胞不稳定。同时，本发明的发明人已经进行了有关具有很少或者没有体细胞无性系变异的植物细胞系统方面的研究。结果，本发明的发明人发现，当细胞系仅仅在作为分生组织的形成层中被专一性地诱导时，分生组织本身活跃的细胞分裂能力可被使用而不需要去分化，从而体细胞无性系变异不出现，因此遗传上高度稳定和生理学上均匀的同质细胞系可被诱导。在这个发现的基础上，本发明的发明人分离了来自形成层的细胞系。

根据本发明的分离方法包括下列步骤：

(a)得到含形成层的具有储藏根的草本植物的储藏根组织；

(b)通过在含有IAA(吲哚-3-乙酸)或者IBA(吲哚-3-丁酸)的培养基中培养得到的含有形成层的储藏根组织，其中在培养过程中、之前或之后将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织；以及

(c)收集诱导的形成层细胞系。

在本发明的方法的步骤(b)中，进行渗透压的施加以便专一性诱导形成层中的细胞系。优选地，其在含有IAA或IBA的培养基中培养组织之前进行，使形成层以外的一般组织(即皮层、韧皮部、木质部和木髓)失去分裂能力，由此当它们受到形成层分裂专一性激素诸如IAA或IBA处理时变得坏死。

优选地，步骤(c)通过在含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定和IBA中的一种或多种的培养基中增殖被诱导的来自形成层的细胞，然后收集来自形成层的细胞来进行。

现在将详细描述根据本发明的方法。

【(1)灭菌步骤和使用渗透压处理的步骤】

首先，制备草本植物的含有形成层的储藏根组织，然后进行灭菌步骤。这里，灭菌步骤分两步进行。然后，使用渗透压处理进行了灭菌步骤的含有形成层的储藏根组织，使形成层以外的一般组织(即皮层、韧皮部、木质部和木髓)在极端环境下失去分裂能力，由此当使用形成层专一性激素诸如IAA或IBA处理时变得坏死，并且仅仅在具有活跃细胞分裂能力的形成层中具有分裂能力的同质细胞系被专一性诱导。这里，糖诸如蔗糖、糖醇诸如山梨醇和盐诸如氯化钠可被用作渗透剂，但不限于此。

这里，优选地，渗透剂以0.5～2M的量被使用，并且渗透剂以冷却状态或者在室温下使用16～24小时，然后将其除去。但是，本发明的范围不限于此，因为渗透剂的浓度、处理时间和温度可根据植物种类和组织状态而变化。

同时，本发明的特征在于，在使用渗透压处理之后，进行除去渗透压的步骤和使细胞适应诱导培养基的步骤。为了缓解渗透压，迅速将渗透剂的浓度降低到例如0.03～0.05M，然后对外植体进行处理。这里，处理时间优选为1～15分钟。而且，如果外植体连续暴露于上述的低浓度渗透剂，渗透剂的低浓度不同于诱导形成层专一性细胞系培养基的渗透剂的浓度，这种不同在培养过程中也可作为渗透压。出于这种原因，使外植体适应诱导培养基的步骤优选进一步进行。使外植体适应诱导培养基的步骤通过以与诱导培养基中相同浓度的渗透剂进行渗透剂除去步骤处理外植体来进行。这里，外植体优选使用浓度为0.08～0.1M的渗透剂处理1～15分钟。

在本发明的一个实施例中，将使用渗透压处理的情形与没有使用渗透压处理的对照组进行比较。这里，形成层专一性细胞系的诱导在没有使用渗透压处理的对照组中没有出现，表明使用渗透压处理的步骤对于诱导来自具有储藏根的草本植物的形成层的细胞系来说是必须的。

【(2)来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的诱导】

在使用渗透压处理之后，为了诱导来自草本植物形成层的细胞系，将已经进行渗透压处理的组织置于含有IAA或者IBA的细胞培养基中，使得仅仅在形成层中专一性诱导细胞分裂，从而得到来自形成层的同质细胞系。优选地，将含有形成层的外植体置于含有0.5～3.0mg/L的IAA或IBA的培养基中。

如果将IAA加入到细胞系诱导培养基中，其结合包含在植物中的内源IAA以诱导形成层活性方面的协同作用(synergistic effect)。由于这种协同作用的原因，由于分化组织与作为形成层的分生组织之间的细胞分裂活性的差异，同质细胞系仅仅在形成层中被专一性诱导。同时，据报道IAA是初级天然植物生长素，而IBA是次级天然植物生长素(Andrew等人，Ann.Bot.，95:707，2005)。

在本发明的一个实施例中，在使用渗透压处理之后，使用另一种植物激素植物生长素诸如毒莠定、2,4-D，CPA和NAA处理外植体。但是，据显示，仅仅IAA和IBA对诱导来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系是有效的。

【(3)来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的增殖】

可将如上所述诱导的来自形成层的同质细胞系转移到含有植物生长调节激素的优化生长培养基中以便得到大量的同质细胞系。这里，作为生长调节剂，优选使用2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，毒莠定和IBA中的一种或多种。2,4-D、毒莠定和IBA中的任何一种优选以1～5mg/L的量使用，更优选以2mg/L的量使用。

在本发明中使用的培养基是用于植物组织培养的常用培养基，其例子可包括但不限于：N6培养基，SH培养基，MS培养基，AA培养基，LS培养基，B5培养基，WPM培养基，LP培养基，White培养基，GD培养基，DKW培养基，DCR培养基等等。

在另一方面，本发明涉及细胞系，其来自具有储藏根的草本植物形成层，并具有下列特征：

(a)其固有地处于未分化状态；

(b)其为同质细胞系；并且

(c)其以大量液泡为形态学特征。

另外，根据本发明的来自形成层的细胞系的特征在于：

(a)在悬浮培养过程中其以单个细胞存在；

(b)与来自具有储藏根的草本植物形成层以外的其他组织的细胞系相比，其在生物反应器中对剪切应力具有较低的敏感性；以及

(c)与来自具有储藏根的草本植物形成层以外的其他组织的细胞系相比，其具有较高的生长速度并被稳定培养。

在本发明的一个实施例中，看到根据本发明的来自形成层的细胞系不仅可在3L生物反应器中大规模培养，而且可在20L生物反应器中大规模培养。而且看到，与来自形成层以外的组织的细胞系相比，根据本发明的来自形成层的细胞系具有对剪切应力低5～9倍的敏感性，并且与来自形成层以外的组织的细胞系相比，具有高3～5倍的生长速度。同时，当将来自形成层的细胞系培养11个月或者更久时，其显示与来自形成层以外的组织的细胞系最大400倍的生长速度差异。

在本发明的另一实施例中，根据本发明的细胞系提取物和培养基具有抑制降解皮肤胶原以形成皮肤皱纹的MMP-1的表达的效果，因此表明它们具有防止并减少皱纹的效果。在本发明的再一实施例中，可以确定细胞系提取物和培养基具有抑制通过UV诱导的活性氧的效果，由此表明它们具有抗氧化效果。

在又一目的中，本发明涉及保藏草本植物细胞系的方法，包括冷冻来自具有储藏根的草本植物的形成层的细胞系的方法。

在本发明的一个实施例中，对来自人参子叶的非同质细胞系和来自人参形成层的同质细胞系进行低温储藏实验。结果看到，当解冻时来自人参子叶的非同质细胞系没有重新生长，而当解冻时来自人参形成层的同质细胞系开始重新生长并增殖。

如果细胞系可被低温储藏，则能够稳定提供原材料并构建丰富的总细胞系库(substantial master cell bank)。因此，本发明的来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系能够作为草本植物细胞系的长期稳定的供应源。

世界现在正处于保护研究材料(生物资源)的战争之中，并且用于开发各种新药和改善食物质量的生物资源包括人体组织、植物种子、微生物、细胞和基因的保存和鉴定已经变成了非常重要的国家财产(national properties)。因此，由于保护研究材料导致国家竞争，要求构建细胞系库用于开发、收集、保藏并分配在生物科学相关领域研究中用作必须材料的细胞系。因此，当所述植物细胞库被构建时，研究材料的供应可得到缓解，采用植物细胞系的研究周期可被缩短。

本发明的特征在于使用储藏根的形成层并可被应用于具有普通储藏根的所有种类的草本植物。换言之，在本发明的一个实施例中，将细胞系从人参、野山参和胡萝卜储藏根形成层中分离出来，但对本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的方法可被应用于任何草本植物，只要该草本植物具有储藏根。具有储藏根的草本植物的例子包括但不限于：轮叶党参(Codonopsis lanceolata)、羌活(Ostericum koreanumKITAGAWA)、桔梗(Platycodon grandiflorum)、野葛(Puerariathunbergiaana)、东北土当归(Aralia contonentalis Kitagawa)、防风(Ledebouriella seseloides)、朝鲜当归(Angelica gigas NAKAI)、胡萝卜、红薯、，玛咖(Maca)、木薯、人参，野山参，培养的野生人参等等。而且，本发明的具有储藏根的含有形成层的储藏组织意味着不仅包括户外植物的储藏根组织，而且包括组织培养物(不定根和来自不定根的细胞系)。

【实施例】

此后，将参照实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员来说容易想到的是，这些实施例仅仅用于解释的目的，而不是用于限制本发明的范围，因为这些实施例可被修改成其他各种形式。

【实施例1:从具有储藏根的草本植物形成层分离细胞系:(1)-人参】

【1-1:植物材料的制备】

图1示出了在本发明中使用的户外培养的人参的典型特征。如图1所示，仅仅选择并收集光滑且没有创伤的人参。将收集的人参在流动自来水下洗涤以从人参外表面除去土壤或者其他污染。然后，将人参的细根全部去除以便仅仅留下主根，并使用液体洗涤剂清洗主根的表面，然后将主根在流动的自来水中保持直立(left to stand)。将洗涤的组织置于洁净工作台中的灭菌烧瓶中并使用70%酒精灭菌30秒到1分钟。然后将组织使用灭菌蒸馏水漂洗，然后使用1～1.5%次氯酸钠(Junsei，Japan)消毒5～8分钟。然后，弃去消毒液，将组织使用灭菌蒸馏水漂洗一次或多次，然后使用消毒液第二次进行处理大约5-8分钟。这里，为了使消毒液渗透到组织中，将数滴TWEEN20(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，polyoxyethylenesorbitan monolaurate(Junsei，Japan))加入到消毒液中，然后将处理的组织使用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。然后，为了防止灭菌组织的褐变(browning)，将灭菌的主根置于含有抗氧化剂的BIM(褐变抑制培养基)，然后摇瓶培养大约30分钟到1小时。然后，使用灭菌滤纸从组织中除去湿气。

表1:BIM的成分和浓度(加入与1/4总浓度对应量的盐)

然后，为了防止材料变褐，将主根置于在下表2中显示的含有抗氧化剂的CS溶液(切削液)的灭菌盘中，将主根去掉很薄的皮然后切成两片。将切割下的部分切片成0.5～0.7cm(宽)x0.5～0.7cm(长)x0.2～0.5mm(高)的尺寸，使具有活跃细胞分裂能力的形成层被包括在切割部分中。图2示出了通过将人参储藏根切割成上面的特定尺寸制备的含有形成层的外植体。

表2:CS(切削液)

成分	浓度
		PVP(聚乙烯吡咯烷酮)	0.5%(w/v)
抗坏血酸	100mg/L
		柠檬酸	150mg/L

【1-2:使用渗透剂处理含有人参主根形成层的外植体】

使用渗透液处理在实施例1-1中制备的外植体以便使分化组织(韧皮部，木质部，木髓等)坏死并仅仅诱导形成层(分生组织)。将含有形成层的外植体涂抹在放置有滤纸的预接种培养基(培养基1)上，并将其置于含有1M蔗糖溶液(Duchefa，Netherland)的烧瓶中并在冷却状态下使用渗透压处理16～24小时。然后，在0.05M的蔗糖溶液中将外植体处理5分钟并在0.1M的蔗糖溶液中处理5分钟以除去由高浓度蔗糖引起的应力。将已经从除去渗透压的含有形成层的外植体置于放置有滤纸的预接种培养基(培养基1)上以除去湿气。

表3:预培养培养基(培养基1)

【1-3:在含有人参主根形成层的外植体中诱导来自形成层的同质细胞系】

为了诱导具有细胞分裂能力的含有形成层的同质细胞系，将实施例1-2中使用渗透压处理的外植体转移到细胞系诱导培养基上(培养基2)。使用的培养基组分在下表4中示出。将转移的外植体在22±1℃的黑暗条件下培养。

表4:诱导来自形成层的同质细胞系的培养基(培养基2)成分

成分	浓度和条件
		盐	全浓度(Full strength)WPM
蔗糖	3%(w/v)
		IAA(吲哚-3-乙酸)	2mg/L
pH	5.8
		固化剂(Gelrite)	0.3%(w/v)
抗坏血酸	100mg/L
		柠檬酸	150mg/L

在如上面描述的那样使用渗透压进行处理并除去之后，从接种到来自形成层的细胞系诱导培养基(培养基2)上的外植体观察到，仅仅在形成层中专一性诱导了同质细胞系而在其他组织中没有诱导。该观察结果在下表5中示出。特别是，在已经使用渗透压处理并从其上释放渗透压的转移的外植体中，外植体的形成层在培养3～7天之后开始转为浅黄色，并且在从此时开始大约7～14天之后，在变成浅黄色的部分开始诱导圆形细胞系。图3(a)示出了只在含有人参根部形成层的外植体的形成层中专一性诱导出同质细胞系。

但是，如下表5中所示，在直接转移到来自形成层的细胞系诱导培养基(培养基2)上而没有进行实施例1-2的渗透压处理步骤的外植体中，在转移后的初始阶段(2～3天)显示与形成层有关的黄色反应，然后随着时间的推移，整个外植体都变黄。将已经显示与形成层有关的黄色反应的外植体在用于分离并增殖来自形成层的细胞系的优化培养基(培养基3)中传代以便诱导并增殖来自形成层的细胞系，但是褐变现象变得严重，并且即便随着时间的推移，除了褐色反应之外的任何反应都不被显示。这表明使用渗透压进行处理的步骤对于诱导来自形成层的细胞系来说是必须的。

表5:使用渗透压处理的外植体与没有使用渗透压处理的外植体之间的反应的比较

同时，为了检查在诱导培养基中使用的激素的影响，将外植体在含有2,4-D的培养基中进行培养，所述培养基不是来自形成层的细胞系的诱导培养基，并且已经在普通人参的常规培养中使用。在这种情况下，观察到在培养7～10天之后整个外植体开始变黄，自此时开始大约7～14天，在整个剖面细胞都被诱导(图3(b))。换言之，可以看到，当使用2,4-D时，细胞系在所有其他组织中都被诱导，没有对形成层的专一性。

如图3(b)所示，当在培养中使用含有2,4-D的普通培养系统时，细胞从整个剖面中存在的各种组织(皮层、韧皮部、木质部、形成层、木髓等)中被诱导，并且各种细胞彼此混合在一起。因此，诱导和增殖的细胞具有非同质性。但是，如图3(a)所示，当使用包括使用渗透压处理外植体，除去渗透压并将外植体转移到来自形成层的细胞系诱导培养基中的本发明的方法时，细胞系仅仅从形成层中被专一性诱导，因此仅仅包括形成层细胞。因此，诱导的细胞具有同质性。

【1-4:来自形成层的同质细胞系在含有人参主根形成层的外植体中的增殖】

如图3(a)所示，在将外植体在实施例1中的培养基2中培养使形成层以外的组织坏死之后，将其在培养基3中传代。培养基3对于来自形成层的细胞系来说是优化培养基，并以在表6中示出的基本盐组分为基础。该培养基在表7中示出。

表6:用于来自形成层的细胞系增殖的优化培养基的基本盐组分

表7:用于来自形成层的细胞系增殖的优化培养基(培养基3)成分

成分	浓度和条件
		盐	全浓度MS
蔗糖	3%(w/v)
		2,4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)	2mg/L
pH	5.8
		固化剂(Gelrite)	0.3%(w/v)
抗坏血酸	100mg/L
		柠檬酸	150mg/L

图4(a)示出了在转移到培养基2中的含有形成层的外植体的形成层中专一性诱导的同质细胞系在表7中示出的培养基3中传代并增殖。

当具有分裂能力的来自形成层的同质细胞系在培养基3中培养时，其连续分裂并增殖。在培养大约10～20天之后，分离来自形成层的细胞系，分离的细胞系允许在相同的培养基(培养基3)中再次增殖。

图4(b)示出了来自形成层的分离的细胞系在表7中示出的培养基3中增殖。同时，如果细胞系在含有IAA而不是2,4-D的生长培养基中培养，其不增殖并且显示分化的趋势，表明IAA不能在生长培养基中使用。图4(c)示出了在单细胞水平在光学显微镜下观察来自形成层的同质细胞系，并且图4(d)示出了在单细胞水平在光学显微镜下观察来自人参子叶的愈伤组织(KCTC10224)。

【实施例2:来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的诱导和增殖：(2)-野山参】

【2-1:来自野山参形成层的细胞系的诱导】

以与实施例1-1中描述的相同方式制备野山参并对其进行表面灭菌。而且，将保持在生物反应器中的100年生的野山参(true wildginseng)的不定根制备并置于含有表2中的CS溶液的灭菌盘中，并以与上面相同的方式从野山参中得到含有形成层的外植体。然后，将制备的两个样品以与实施例1-2和实施例1-3中相同的方式使用渗透压进行处理，然后诱导来自形成层的同质细胞系。

结果观察到，在已通过与实施例1中的处理人参的相同方式经进行渗透压处理、除去渗透压并转移到同质细胞系诱导培养基中的含有野山参形成层的外植体和含有野山参不定根形成层的外植体两者中，仅仅来自形成层的细胞被专一性诱导，在其他组织中则没有被诱导。图5(a)示出了在含有野山参形成层的外植体的形成层中具有专一性分裂能力的同质细胞系的诱导被诱导。

【2-2:来自野山参形成层的细胞系的增殖】

如图5(a)所示，使用渗透压处理和培养基2同质细胞系仅仅在形成层中被专一性诱导之后，在含有野山参形成层的外植体中诱导的同质细胞系以实施例2中相同的方式在表7的培养基3中传代。结果，来自形成层具有分裂能力的同质细胞系连续分裂并增殖，由此在大约10～20天的培养后具有分裂能力的来自形成层的同质细胞系可被分离。由此分离的来自野山参形成层的同质细胞系在培养基3中培养以再次增殖。如图5(b)所示，分离的形成层特异同质细胞系在表7中所示的培养基3中进行增殖。而且，图5(c)示出了来自野山参形成层的同质细胞系在光学显微镜下以单细胞水平被观察。

同时，在实施例2-1中的含有野山参不定根形成层的外植体中，细胞系以与实施例2中相同的方式增殖，但使用IBA代替表7中的2,4-D。结果，当细胞系在含有IAA的培养基中培养时，其不分化并显示分化的趋势，相反，当细胞系在含有IBA的培养基中培养时，其与使用含有2,4-D的培养基的情形不同的方式分化和增殖。

【实施例3:来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的诱导和增殖：(3)-胡萝卜】

以与实施例1-1中描述的相同方式制备胡萝卜(Daucus carota L.)并对其进行表面灭菌。然后将制备的样品以与实施例1-2和实施例1-3中相同的方式使用渗透压进行处理，然后从胡萝卜中诱导来自形成层的同质细胞系。

结果，以与实施例1和2中相同的方式，观察到形成层以外的其他组织坏死并且来自具有分裂能力的形成层的同质细胞系被诱导。图6示出了来自具有分裂能力的形成层的同质细胞系在胡萝卜中被诱导。

而且，其他植物生长激素，包括IAA、IBA、毒莠定、2,4-D、CPA和NAA以相同的浓度被使用以便检查在诱导培养基中使用的激素的影响。表8示出了当在诱导培养基中使用各种生长素时得到的结果。

表8:当使用各种生长素以相同的浓度处理胡萝卜时的细胞系诱导模式

+:阳性；和-:阴性

如表8中所示，当在诱导培养基中使用IAA或者IBA时，与形成层有关的同质细胞系被诱导，相反，当在诱导培养基中使用毒莠定、CPA、2,4-D或者NAA时，在整个外植体中细胞系都被诱导，而不是与形成层有关。特别是，当在诱导培养基中使用NAA时，观察到随着时间的推移(大约4周以后)，在形成层中根部被诱导并分化。因此，确定用于来自形成层的细胞系诱导的激素限于IAA或IBA。

【实施例4:分离细胞系的特征观察】

【4-1:对来自形成层的细胞系建立长期培养】

在实施例1中得到的来自人参形成层的具有分裂能力的同质细胞系中，将具有高生长速度的白且易碎的细胞(white and friable cell)传代同时以14天为间隔更换新鲜优化生长培养基(表7中的培养基3)。作为对照组，来自人参子叶的非同质细胞系在优化生长培养基中传代并以28天为间隔更换培养基。

结果，来自形成层的细胞系的白而且易碎的细胞连续增殖直到培养11个月。而且，即便当细胞培养11个月或者更久时，细胞仍被稳定保持而在生长速度、生长模式和凝集程度方面没有变化，并显示了比来自人参子叶的非同质细胞系高400倍的生长速度。

相反，黄色的、大而且易碎的组的来自人参子叶的非同质细胞系在培养的初始阶段即为微黄色，并显示以4周为间隔细胞数量的两倍增加的趋势，并且在培养5个月之后，其生长速度显示降低的趋势。然后，其显示不到1.5倍的细胞数量增加，另外黄色细胞、白色或者浅灰色含水细胞、褐色细胞以及类似细胞出现。这些细胞不再增殖，保持完整并在大量褐色物质的诱导下死亡。因此，当来自人参子叶的非同质细胞系培养11个月时，其生长速度显示下降的趋势。

图7示出了来自人参形成层的细胞系(A)和来自人参子叶的非同质细胞系的长期培养的生长曲线。

【4-2:细胞悬浮培养的建立】

将在实施例1和2中得到的来自人参形成层和野山参形成层的细胞系置于含有表9中所示的液体培养基的烧瓶中。然后，将烧瓶中的细胞系在摇床上100rpm在黑暗条件下在25±1℃下培养。这里，使用2,4-D对来自人参形成层和野山参形成层的细胞系进行培养，并且使用IBA对来自野山参不定根形成层的细胞系进行培养。传代间隔设置为2周，使培养的细胞可在指数生长阶段(exponential growth phase)始终保持高生命力。同时，作为非同质细胞系的来自人参子叶的愈伤组织(KCTC10224)也在表9中所示的培养基4中培养以便于与本发明的具有分裂能力的来自形成层的同质细胞系进行比较。

表9:用于来自形成层的细胞系的悬浮培养基(培养基4)

成分	浓度和条件
		盐	全浓度MS
蔗糖	3%(w/v)
		2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)或者IBA	2mg/L
pH	5.8

细胞凝集的定量在光学显微镜(生物学显微镜CX31，Olympus，Japan)下观察，结果可以看到，如表10中所示，根据本发明的来自形成层的细胞系在悬浮培养过程中以单个细胞存在。但是，可以看到90%以上的来自人参子叶的非同质细胞系以大的细胞团存在，不到1%的来自人参子叶的非同质细胞系以单个细胞存在。图8(a)是显示来自形成层的细胞系以单个细胞种群存在的光学显微镜图像，图8(b)是显示来自人参子叶的非同质细胞系以大的细胞团种群存在的显微照片。

表10:长期培养过程中来自形成层的细胞系的细胞团类型

大细胞团：尺寸大于1.5×10³μm;

中等细胞团：1×10³μm;

小细胞团：4×10²μm＜尺寸＜1×10³μm

同时，当在显微镜下观察时，如同在图4(c)或图5(c)中可以看到的那样，根据本发明的来自形成层的细胞系具有许多液泡的形态学特征，并处于未分化状态。但是，如在图4(d)中显示的那样，来自人参子叶的愈伤组织(KCTC10224)的观察结果显示，观察到少数或者一个大的液泡。

【4-3:大规模培养(Scale-up culture)】

为了检查大规模培养的可能性，将在实施例2和3中得到的来自人参子叶的非同质愈伤组织和来自形成层的细胞系在具有3L内部容积的气升式生物反应器(airlift bioreactor，Sung-Won Cytec，Korea)中培养。在培养中使用的培养基为在表9中所示的液体培养基并在25±1℃保持在黑暗条件下。

结果，如表11所示，本发明的具有分裂能力的来自形成层的同质细胞系的倍增时间为3～6天，这与在烧瓶中不同，或者与在烧瓶中相比倍增时间更短，相反来自人参子叶的非同质细胞系在烧瓶中的倍增时间为21天，在反应器中的倍增时间为28天。换言之，可以看出，当在烧瓶中培养时，与来自其他组织的细胞系相比，根据本发明的来自形成层的细胞系显示高达约3～5倍生长速度，并且当在反应器中培养时，与来自形成层以外的其他组织的细胞系相比，根据本发明的来自形成层的细胞系显示生长速度高达约5～9倍。这被认为是因为非同质细胞系的发育能力由于在反应器中生长环产生(growth ringproduction)、培养过程中植物细胞凝集以及坚硬的细胞壁对剪切应力的灵敏度而迅速降低。

具有分裂能力并且同质的本发明的来自形成层的细胞系在生物反应器中形成非常小的生长环区，并且当对培养箱施加简单刺激以摇动培养基时，内壁上的环被简单消除。而且，显示本发明的细胞系具有较低的凝集并且包含大量的液泡，因此具有对剪切应力的较低的灵敏性，使细胞发育能力不降低。换言之，可以看到根据本发明的来自形成层的细胞系对来自用于大量生产的生物感应器中的摇动产生的剪切应力具有较低的灵敏度，因此可在生物反应器中迅速大量生产。因此，可以看到与来自形成层以外的其他组织的细胞系相比，根据本发明的来自形成层的细胞系具有低5～9倍的灵敏性。

表11:来自形成层的细胞系和来自人参子叶的非同质细胞系在液体悬浮培养基和生物反应器中的倍增时间

另外，可以看到根据本发明的来自形成层的细胞系还可在具有20L内部容积的气升生物反应器(Sung-Won Cytec，Korea)中培养(图9)，因此可以大量培养。

【4-4:低温储藏】

低温储藏是长期安全保藏被选择用于工业化的有用细胞系的非常理想的方法。

安全保藏有用细胞系的方法如下。将来自人参子叶的非同质愈伤组织和来自形成层的细胞系冷藏。将悬浮培养物培养6～8天，并且低温储藏剂为含有0.5M甘油(DUCHEFA，The Netherlands)，0.5MDMSO(DUCHEFA，The Netherlands)和1M蔗糖(DUCHEFA，TheNetherlands)的培养基并被转移到5～ml冷冻瓶(cryovial，Duran，USA)中。接种到低温储藏剂的细胞量为200mg/mL。通过将它们保持在冷冻机中30分钟将使用低温储藏剂处理的悬浮细胞冷冻，将它们储藏在冰柜中3小时，然后将它们浸泡在液氮中。

然后，为了融化，取出液氮中保持在20分钟或者更长时间的培养的细胞，将它们置于40℃的恒温水浴中并融化1～2分钟。为了让细胞重新生长，通过灭菌漏斗和滤纸过滤细胞悬浮液。将过滤的细胞施加到包括滤纸的固体生长培养基上，然后将它们在室温下固定30分钟，然后转移到新鲜的固体生长培养基上。

结果，来自人参子叶的非同质细胞系不重新生长，而来自形成层的细胞系在4周以后开始重新生长并增殖，并且在低温储藏之前和之后不显示生长速度的差别。

【4-5:使用诱导子(elicitor)处理】

将如在实施例4-2中描述的在含有2,4-D的培养基中已经悬浮培养14天的来自野山参形成层的细胞系分成三组用于实验。

换言之，悬浮培养14天获得的细胞系(1)(生长阶段)；通过在黑暗条件下在培养基(含有无菌水、3～5wt%粗糖和100μM甲基茉莉酮酸酯)中培养悬浮培养14天获得的细胞系(2)(诱发1)；通过黑暗条件下在培养基(含有100μM甲基茉莉酮酸酯)中培养悬浮培养14天获得的细胞系(3)(诱发2)分别被收集接着进行下面的测试。

【实施例5:分离细胞系的抗老化和抗氧化效果的检查】

【5-1:来自野山参形成层的细胞系的提取物的制备】

按照如下方式由实施例4-5的细胞系制备提取物。将已经除去培养基500g的细胞系(湿)和冷冻干燥的细胞系(干)分别在50℃下溶解在500mL DMSO中并搅拌6小时。将得到的细胞溶液3,000g离心10分钟，收集上清液以得到蒸馏水溶解的物质。使用真空旋转蒸发仪将得到的DMSO-溶解物质浓缩，并使用冷冻干燥器干燥浓缩的样品，从而得到DMSO提取物。

【5-2:来自野山参形成层的细胞系的培养基和提取物的抗衰老效果检查:由紫外光引起的MMP-1表达抑制效果的检查】

当MMP由于曝光于紫外光中而增加时，增加的MMP降解皮肤胶原形成皮肤皱纹。因此，进行下面的测试以便检查由于紫外光而增加的MMP-1表达是否由来自野山参形成层的细胞系的提取物或培养基抑制。

将在测试中使用的NHF(正常人成纤维细胞)从婴儿阴茎包皮中分离并培养。通过56℃加热30分钟失活的10%胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，Utah，USA)、100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素和300μg/mL谷氨酰胺加入到DMEM培养基(Invitroge Gibco lifetech.Vienna，Austriea)中制备培养基。将细胞在培养基中在37℃和95%湿度下在5%CO₂恒温箱中培养并在细胞彼此即将融合之前以3～4天为间隔传代。

将NHF(p6)细胞以75,000细胞/孔的密度分散到12-孔板中并使其饥饿(starved)24小时。然后，将细胞使用40mJ的UVB照射并分别使用不同浓度的每种样品处理48小时。然后，使用试剂盒(Amersham，RPN2610)进行实验。作为阳性对照，使用10μM维甲酸。

诱发1表示使用3～5wt%(g/L)的粗糖和100μM甲基茉莉酮酸脂处理的实施例5-3的细胞系的DMSO提取物，诱发2表示使用100μM甲基茉莉酮酸脂处理的实施例5-4的细胞系的DMSO提取物，生长表示实施例5-4中悬浮培养14天的细胞系(生长阶段)的DMSO提取物，湿表示已经将培养基从其中除去的细胞系的DMSO提取物，干表示冷冻干燥的细胞系的DMSO提取物，并且培养基表示在细胞系提取物制备过程中除去的培养基。

表12:来自野山参形成层的同质细胞系的提取物或培养基对由紫外光引起的MMP-1表达的抑制效果

结果，如表12和图10所示，与阴性对照组(对照UV)相比，根据本发明的细胞系提取物和培养基有效地抑制了MMP-1的表达，表明它们具有防止并减少皱纹的效果。特别是，当使用0.1%的用粗糖和甲基茉莉酮酸脂处理的诱导1的细胞系培养物以及仅仅用茉莉酮酸酯处理的诱导2处理NHF(p6)时，与在现有技术的已知材料中已知对皱纹减少具有最强抑制效果的维甲酸相比，这些细胞系培养物培养基显示了极佳的效果。

【5-3:来自野山参形成层的细胞系的培养基和提取物的抗氧化效果的检查：对由紫外光引起的活性氧的抑制效果的检查】

为了检查通过紫外光增加的活性氧是否被来自野山参形成层的同质细胞系的提取物或培养基抑制，将HaCaT细胞以30,000个细胞/孔的密度分散到黑色96-孔板中并使用不同浓度的每种样品处理3小时。3小时以后，使用HBSS将板洗涤一次，使用50μM DCF对每个孔进行处理并在37℃下培养20分钟。在使用HBSS将板洗涤两次之后，使用光度计(luminator)测定细胞的初始吸光度。将细胞使用30mJ的UVB照射，37℃下培养2小时，然后测定吸光度。对照表示没有使用样品和UVB处理的组，UVB表示仅仅使用UVB处理而没有添加样品的组。

表13:来自野山参形成层的同质细胞系的提取物或培养基对由紫外光引起的活性氧的抑制效果

结果，如表13和图11所示，在其中已经将培养基从其中除去的本发明的细胞系(湿)被使用和其中本发明的冷冻干燥细胞系(干)被使用的情况下，诱发1的细胞系提取物显示了极佳的抗氧化效果。然后，诱发2和生长阶段显示了类似的抗氧化效果。而且，使用50ppm的诱发1的冷冻干燥的细胞系提取物处理的组显示了最佳抗氧化效果。

【5-4:人参皂苷成分分析】

已知野山参提取物的人参皂苷成分在皮肤防老化和抗氧化方面是有效的。因此，为了检查根据本发明的细胞系提取物和培养基的皮肤老化效果和抗氧化效果是否归功于所述人参皂苷成分的效果，测定了人参皂苷的含量。特别是，在实施例2中制备的来自野山参形成层的同质细胞系和野山参被冷冻干燥，并将20mg的冷冻干燥细胞系在600μl甲醇中提取1小时。将提取物离心并收集上清液。分离的提取物中人参皂苷的含量使用UPLC测定，测定的含量与标准Re，Rb1，Rb2和Rd相比较而示出。而且，将诱发1的培养基使用0.2μm针筒过滤器过滤，并且使用UPLC测定其中人参皂苷的含量。测定的含量与Re，Rb1，Rb2合Rd相比较而示出。

表14:来自野山参形成层的同质细胞系、培养基和野山参之间人参皂苷含量的比较

结果，如同在表14中看到的那样，在来自野山参形成层的同质细胞系中，诱发2的细胞系显示了最高的人参皂苷含量，但是作为对照组的野山参提取物的人参皂苷含量仍然比来自野山参形成层的同质细胞系的人参皂苷含量高167倍。而且，在生长阶段的来自野山参形成层的同质细胞系或者细胞系培养基中没有检测到人参皂苷。这表明根据本发明的细胞系提取物和培养物的皮肤抗老化和抗氧化效果不是依赖于人参皂苷的，并且根据本发明的方法分离的细胞系含有与常规野山参细胞不同的活性成分。此外，即便与在现有技术的已知物质中已知对皱纹减少具有最强效果的维甲酸相比，根据本发明的细胞系提取物和培养基的皮肤抗老化和抗氧化效果也是极佳的，表明与常规野山参提取物的效果相比，根据本发明的细胞系提取物和培养基具有明显更高的效果。

【工业实用性】

如上所述，本发明的来自具有储藏根的草本植物的形成层的细胞系具有活跃的细胞分裂能力并且是同质的。而且，其在培养过程中是稳定的，因为其不经历去分化过程。因此，通过其增殖的优化，细胞系可被允许短时间内大量增殖。因此，本发明的来自具有储藏根的草本植物的形成层的细胞系能够生产由于与培养周期、培养土壤的选择、培养成本以及类似因素有关的各种问题而难以在户外培养的大量有用植物。

此外，本发明的来自具有储藏根的草本植物的形成层的细胞系显示了抑制通过暴露于作为皮肤老化的主要原因的紫外光而引起的活性氧的抗氧化效果，并有效减少或抑制了老化相关因子。因此，本发明的来自形成层的细胞系对于防止并抑制皮肤老化来说是有用的。

虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，对本领域技术人员来说容易想到的是该描述仅仅用于优选实施方式而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围由随附的权利要求书及其等同物限定。

本说明书还包括以下内容：

1、一种分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)得到含形成层的具有储藏根的草本植物的储藏根组织；

(b)通过在含有IAA(吲哚-3-乙酸)或者IBA(吲哚-3-丁酸)的培养基中培养得到的含有形成层的储藏根组织而诱导来自形成层的细胞系，其中在培养过程中、之前或之后将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织；以及

(c)收集诱导的形成层细胞系。

2、根据项目1所述的分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(c)通过在含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定和IBA中的一种或多种的培养基中增殖诱导的来自形成层的细胞，然后收集来自形成层的细胞来进行。

3、根据项目1所述的分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(b)中IAA或IBA的含量为0.1～5mg/L。

4、根据项目2所述的分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，其特征在于，2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定和IBA中任何一种的含量为1～5mg/L。

5、根据项目1-4任意之一所述的分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，其特征在于，所述草本植物选自下组，包括人参、轮叶党参(Codonopsis lanceolata)、羌活(Ostericum koreanumKITAGAWA)、桔梗(Platycodon grandiflorum)、野葛(Puerariathunbergiaana)、东北土当归(Aralia contonentalis Kitagawa)、防风(Ledebouriella seseloides)、朝鲜当归(Angelica gigas NAKAI)、胡萝卜、红薯、玛咖(Maca)和木薯。

6、一种细胞系，其来自具有储藏根的草本植物形成层，并具有下列特征：

(a)其固有地处于未分化状态；

(b)其为同质细胞系；并且

(c)其以大量液泡为形态学特征。

7、根据项目6所述的细胞系，其特征在于，另外具有如下特征：

(i)其在悬浮培养过程中以单个细胞存在；

(ii)与来自具有储藏根的草本植物形成层以外的其他组织的细胞系相比在生物反应器中对剪切应力具有较低的灵敏度；和

(iii)与来自具有储藏根的草本植物形成层以外的其他组织的细胞系相比具有较高的生长速度并可被稳定地培养。

8、根据项目6所述的细胞系，其特征在于，通过下列方法分离，所述方法包括如下步骤：

(a)得到含形成层的具有储藏根的草本植物的储藏根组织；

(c)收集诱导的形成层细胞系。

9、根据项目8所述的细胞系，其特征在于，所述步骤(c)通过在含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定和IBA中的一种或多种的培养基中增殖诱导的来自形成层的细胞，然后收集来自形成层的细胞来进行。

10、根据项目6所述的细胞系，其特征在于，所述草本植物选自下组，包括人参、轮叶党参(Codonopsis lanceolata)、羌活(Ostericumkoreanum KITAGAWA)、桔梗(Platycodon grandiflorum)、野葛(Pueraria thunbergiaana)、东北土当归(Aralia contonentalisKitagawa)、防风(Ledebouriella seseloides)、朝鲜当归(Angelica gigasNAKAI)、胡萝卜、红薯、玛咖(Maca)和木薯。

11、一种保藏草本植物细胞系的方法，包括冷冻来自项目6-10中任一项的具有储藏根的草本植物形成层的细胞系。

Claims

1.一种分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，所述方法包括下列步骤：

（a）得到具有储藏根的草本植物的储藏根组织，其中所述组织含形成层；

（b）处理所述组织，从而使形成层以外的一般组织失去分裂能力；

（c）通过在含有形成层分裂特异性激素的诱导培养基中培养得到的含有形成层的储藏根组织而诱导形成层细胞增殖；以及

（d）收集诱导的形成层细胞系。

2.权利要求1的方法，其中所述形成层分裂特异性激素是植物生长素。

3.权利要求1的方法，其中所述步骤（b）通过用产生渗透压的制剂处理所述组织来实施。

4.权利要求1的方法，其中所述诱导培养基含有吲哚-3-乙酸或吲哚-3-丁酸作为形成层分裂特异性激素。

5.权利要求4的方法，其中所述诱导培养基以0.1～5mg/L的浓度包含吲哚-3-乙酸或吲哚-3-丁酸。

6.权利要求1的方法，还包括将所述诱导的形成层细胞系转移到支持所述诱导的形成层细胞系持续增殖的维持培养基中，其中所述维持培养基包含植物生长素。

7.权利要求1的方法，还包括将所述诱导的形成层细胞系转移到支持所述诱导的形成层细胞系持续增殖的维持培养基中，其中所述维持培养基包含2,4-二氯苯氧乙酸、毒莠定或吲哚-3-丁酸中的一种或多种。

8.权利要求7的方法，其中所述维持培养基以1～5mg/L的浓度包含2,4-二氯苯氧乙酸、毒莠定或吲哚-3-丁酸。

9.权利要求1的方法，其中所述草本植物选自下组，包括人参、轮叶党参（Codonopsis lanceolata）、羌活（Ostericum koreanumKITAGAWA）、桔梗（Platycodon grandiflorum）、野葛（Puerariathunbergiaana）、东北土当归（Aralia contonentalis Kitagawa）、防风（Ledebouriella seseloides）、朝鲜当归（Angelica gigas NAKAI）、胡萝卜、红薯、玛咖（Lepidium meyenii）和木薯。

10.权利要求9的方法，其中所述人参植物选自培养的人参和野山参。

11.权利要求1的方法，还包括通过冷冻保藏所述来自形成层的细胞系，其中所述来自形成层的细胞系可解冻和再培养。

12.细胞系，其具有下列特征：

（a）其不经过去分化过程；或

（b）其在培养过程中没有体细胞无性系变异。

13.权利要求12的细胞系，其还具有下列特征：

（a）其固有地未分化；

（b）其为同质的；和

（c）其以大量液泡为形态学特征。

14.权利要求12的细胞系，其还具有下列特征：

（i）其以单个细胞维持在悬浮培养物中；

（ii）与来自具有储藏根的草本植物形成层以外的其他组织的细胞系相比在生物反应器中对剪切应力具有较低的灵敏度；和

（iii）与来自具有储藏根的草本植物形成层以外的其他组织的细胞系相比具有较高的生长速度并可被稳定地培养。

15.权利要求12的细胞系，其中所述草本植物选自下组，包括人参、轮叶党参（Codonopsis lanceolata）、羌活（Ostericum koreanumKITAGAWA）、桔梗（Platycodon grandiflorum）、野葛（Puerariathunbergiaana）、东北土当归（Aralia contonentalis Kitagawa）、防风（Ledebouriella seseloides）、朝鲜当归（Angelica gigas NAKAI）、胡萝卜、红薯、玛咖（Lepidium meyenii）和木薯。

16.一种保藏草本植物细胞系的方法，包括冷冻来自权利要求12～15中任一项的具有储藏根的草本植物形成层的细胞系。