CN110214698A - 一种金线莲干细胞分离培养基及其培养方法 - Google Patents

一种金线莲干细胞分离培养基及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种金线莲干细胞分离培养基及其培养方法，通过在培养基中添加适量抗生素、在培养过程中将分离的组织先放入1M蔗糖溶液中超声处理4～24小时，之后放入0.05M蔗糖溶液中浸泡处理5min最后放入0.1M蔗糖溶液中浸泡处理5min，有效地分离和快速培养了金线莲干细胞，为超大体积的液体悬浮培养提供基础，可以显著减少生产成本。

Description

一种金线莲干细胞分离培养基及其培养方法
技术领域
本发明涉及植物干细胞分离及培养领域，特别涉及一种金线莲干细胞分离培养基及其培养方法。
背景技术
金线莲（Anoectochilus rox-burghii）又名花叶开唇兰，金蚕、金线兰等，是兰科开唇兰属的一种多年生草本植物全草均可入药，味平、甘，具有清凉解毒，滋阴降火，消炎止痛功能。对无名肿痛、发烧、止泻、蛇伤均有显著疗效，且无毒副作用，使用安全，其药用价值越来越受到青睐。金线莲含有生物碱、氨基酸、糖类、皂苷、甾体、挥发油等成，具有保肝、抗HBV、降压、强心、降血糖、镇痛、抗炎等药理活性。
金线莲喜阴凉、潮湿，通常生长在常绿阔叶林的石壁等潮湿地带，温度为20～25℃，光照约为正常日照的1/3，忌阳光直射，生产条件特殊，人为过度采收，导致野生资源濒临灭绝，已被列入中国台湾29种需要保护的稀有植物之一，福建省也将其列为省级药材保护品种。由于金线莲发育中形成的生物特性使其自然繁殖和人工栽培繁殖都很困难，为了更好的保护和开发金线莲，近年来利用细胞培养方式获得金线莲有效成分的方法越来越受欢迎。
尽管如此，植物细胞培养在工业生产中还存在很多局限性，如传统植物细胞培养需经历一个脱分化过程，但脱分化细胞的次生代谢产物丰度非常低，甚至根本没有，而且在这个过程中会发生体细胞突变，导致细胞系遗传稳定性降低；另外在长期培养过程中，细胞会受到环境的影响，增长慢、收益率低，阻碍其商业化生产。为了解决了传统细胞培养存在的易变异、细胞聚集等瓶颈问题，急需提供一个不同于传统细胞培养的新方案。
发明内容
本发明提供一种金线莲干细胞分离培养基，包括含有30g/L蔗糖、0.7g/L琼脂糖、1.0～10mg/L 2,4-D、1.0～10.0mg/L NAA的MS培养基或B5培养基；或者含有30g/L蔗糖、0.7g/L琼脂糖、1.0～5.0mg/L 吲哚丁酸（IBA）、0.1～1.0mg/L 6-糖基氨基嘌呤（6-KT）的MS培养基或B5培养基；每毫升所述培养基中还添加10-200U制霉菌素、10-200U卡那霉素、10-200U庆大霉素。
优选的，分离培养基为含有30g/L蔗糖、0.7g/L琼脂糖、3.0mg/L吲哚丁酸、0.5mg/L6-糖基氨基嘌呤的B5培养基。每毫升培养基中添加40U制霉菌素、40U卡那霉素、200U庆大霉素。
本发明还提供一种金线莲干细胞培养方法，包括如下步骤：
（1）消毒 将金线莲新生的茎或健康根冲洗消毒；
（2）防褐变 将灭菌的茎或根置于含有抗氧化剂的褐变抑制培养基中摇瓶培养，然后去除组织表面的水分；
（3）分离 在含抗氧化活性的切削液中，将组织切成块状，并接种到WPM培养基中进行预培养；然后将组织放入1M蔗糖溶液中，之后放入0.05M蔗糖溶液中浸泡处理5min，最后放入0.1M蔗糖溶液中浸泡处理5min，去除蔗糖，通过上述操作使除干细胞以外的组织（包括木质部、韧皮部等）生长受到抑制，只诱导干细胞生长；将获得的组织接种到分离培养基中培养；
（4）培养 两周后，将干细胞明显增殖的外植体取出，分离干细胞，继代培养基上培养。
其中，步骤（1）消毒包括：①将金线莲新生的茎或健康根用自来水冲洗30分钟，将洗涤的组织置于超净工作台的灭菌烧瓶中并用75%( v/v)的乙醇表面消毒1分钟，然后将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次；②然后将组织使用0.5%～10%次氯酸钠消毒10分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次；③再次使用0.5%～10%次氯酸钠消毒5分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。优选的，步骤（1）中次氯酸钠的浓度为2%。
步骤（2）中，防褐变培养基组成如下：
进一步的，步骤（3）中切削液组成如下：
步骤（2）中摇瓶培养30min，采用灭菌滤纸吸出组织表面水分。
步骤（3）中，分离培养基包括含有30g/L蔗糖、0.7g/L琼脂糖、1.0～10mg/L 2,4-D、1.0～10.0mg/L NAA的MS培养基或B5培养基；或者含有30g/L蔗糖、0.7g/L琼脂糖、1.0～5.0mg/L IBA、0.1～1.0mg/L 6-KT的MS培养基或B5培养基；为了防止真菌及细菌污染，每毫升所述培养基中还添加10-200U制霉菌素、10-200U卡那霉素、10-200U庆大霉素。
优选的，将组织切成厚度为2毫米的块状，并接种到WPM预培养基中培养30min。用无菌抽滤器抽滤以去除蔗糖。分离培养基为含有30g/L蔗糖、0.7g/L琼脂糖、3.0mg/L吲哚丁酸、0.5mg/L 6-糖基氨基嘌呤的B5培养基。每毫升培养基中添加40U制霉菌素、40U卡那霉素、200U庆大霉素。超声处理时间5min，超声频率20kHz；1M蔗糖溶液中浸泡4h。分离培养基中培养条件为20℃黑暗下培养。
步骤（4）中，继代培养基为下述1）或2）的培养基：
1)含有30g/L蔗糖、1.0～10.0mg/L 2,4-D、1.0～10.0mg/L NAA的MS培养基或B5培养基；
2) 为含有30g/L蔗糖、1.0～5.0mg/LIBA、0.1～1.0mg/L 6-KT的MS培养基或B5培养基。优选的，继代培养基为含有30g/L蔗糖、3.0mg/L 2,4-D和6.0mg/L NAA的B5培养基。
进一步的，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
步骤（3）1M蔗糖浸泡处理时间为6h
本发明的有益效果：本发明中提供的金线莲干细胞培养方法可以有效地分离金线莲干细胞，干细胞为未分化的细胞，具有无限分裂能力，生长快速，抗逆能力强，为超大体积的液体悬浮培养提供基础，可以显著减少生产成本。而且通过高渗透处理和控制培养基中激素浓度，使干细胞增殖的同时体细胞不会进行增殖。防褐变处理又会减少培养过程中细胞褐化的产生。抗生素抑菌在动物细胞培养中早已被广泛应用，但在植物组织培养中尚处于开始阶段，复合抗生素的应用，可以有效抑制细菌和霉菌的生长，增加了成功的可能。超声处理的细胞组织更易分散，防止细胞聚集。同时，超声可以利用其振动能量改变细胞膜的通透性，加速高渗处理对组织的破坏能力，缩短高渗处理的时间，降低染菌概率，增加成功的可能。
采用本发明的方法所分离的细胞系具有以下特征：
①悬浮培养时，以单细胞水平存在，解决了细胞集聚生长时生长速度下降且容易分化成其他组织的缺陷。
②与金线莲其他组织来源的细胞系相比，对生物反应器中的剪应力具有低敏性；
③与金线莲其他组织来源的细胞系相比，生长速度更快，且可稳定的培养。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下仅是作为本发明实施方案的例子列举，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。
实施例1
⑴消毒：①将金线莲新生的茎或健康根用自来水冲洗30分钟，将洗涤的组织置于超净工作台的灭菌烧瓶中并用75%（v/v）的乙醇表面消毒1分钟，然后将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。②然后将组织使用0.5%（v/v）次氯酸钠消毒10分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。③再次使用0.5%（v/v）次氯酸钠消毒5分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。
⑵防褐变：将灭菌的茎或根置于含有抗氧化剂的褐变抑制培养基，然后摇瓶培养大约30分钟。然后，使用灭菌滤纸吸出组织表面的水分。
其中，防褐变培养基组成如下：
WPM培养基配方如下：
1.无机盐 NH4NO3 400 mg/L Ca(NO3)2.4H2O 556mg/L K2SO4 990 mg/L CaCl2.2H2O96 mg/L KH2PO4 170 mg/L Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L MgSO4.7 H2O 370 mg/L MnSO4 .H2O 22.4mg/L ZnSO4.7 H2O 8.6mg/L CuSO4.5 H2O 0.25mg/L FeSO4.7 H2O 27.8 mg/LNa2-EDTA 37.3 mg/L 2.有机物 肌醇 100 mg/L 维生素B1 1.0mg/L 烟酸 0.5 mg/L维生素B6 0.5 mg/L 甘氨酸 2.0 mg/L
⑶分离：将枝条放入含抗氧化活性的切削液的灭菌盘中，将组织切成厚度为2毫米的块状，并接种到WPM预培养基中培养30min。然后将组织放入1M蔗糖溶液浸泡处理4小时，之后放入0.05M蔗糖溶液中浸泡处理5min，最后放入0.1M蔗糖溶液中浸泡处理5min，用无菌抽滤器抽滤以去除蔗糖，使特异组织坏死，只诱导未分化组织。将获得的组织接种到含有30g/L蔗糖与0.7g/L琼脂糖与1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)与1.0mg/L萘乙酸(NAA)的MS培养基中，为了防止真菌及细菌污染，每mL培养基中分别加入10 U制霉菌素、10 U卡那霉素、10 U庆大霉素。20℃黑暗下培养。
其中，MS培养基配方如下：
1.无机盐 KNO3 1900mg/L
NH4NO3 1650 mg/L
KH2PO4 170 mg/L
MgSO4 370 mg/L
CaCl2 440 mg/L
KI 0.83 mg/L
H3BO3 6.2 mg/L
MnSO4.H2O 22.4mg/L
ZnSO4.7 H2O 8.6mg/L Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L
CuSO4 0.025mg/L
CoCl2·6H2O 0.025 mg/L
Na2-EDTA 37.3 mg/L Ca(NO3)2.4H2O 556mg/L
FeSO4.7 H2O 27.8 mg/L 2.有机物 肌醇 100 mg/L 维生素B1 1.0mg/L 烟酸0.5 mg/L 维生素B6 0.5 mg/L 甘氨酸 2.0 mg/L
⑷培养：两周后，将形成层明显增殖的外植体取出，分离形成层细胞并转移到继代培养基上培养，继代培养基为含有30g/L蔗糖与0.7g/L琼脂糖与1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)与1.0mg/L萘乙酸(NAA)的MS培养基中，每两周继代一次。
实施例2
⑴消毒：①将金线莲新生的茎或健康根用自来水冲洗30分钟，将洗涤的组织置于超净工作台的灭菌烧瓶中并用75%（v/v）的乙醇表面消毒1分钟，然后将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。②然后将组织使用1%（v/v）次氯酸钠消毒10分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。③再次使用1%（v/v）次氯酸钠消毒5分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。
⑵防褐变：将灭菌的茎或根置于含有抗氧化剂的褐变抑制培养基，然后摇瓶培养大约30分钟。然后，使用灭菌滤纸吸出组织表面的水分。
其中，防褐变培养基组成如下：
WPM培养基配方如下：
1.无机盐 NH4NO3 400 mg/L Ca(NO3)2.4H2O 556mg/L K2SO4 990 mg/L CaCl2.2H2O96 mg/L KH2PO4 170 mg/L Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L MgSO4.7 H2O 370 mg/L MnSO4 .H2O 22.4mg/L ZnSO4.7 H2O 8.6mg/L CuSO4.5 H2O 0.25mg/L FeSO4.7 H2O 27.8 mg/LNa2-EDTA 37.3 mg/L 2.有机物 肌醇 100 mg/L 维生素B1 1.0mg/L 烟酸 0.5 mg/L维生素B6 0.5 mg/L 甘氨酸 2.0 mg/L
⑶分离：将枝条放入含抗氧化活性的切削液的灭菌盘中，将组织切成厚度为2毫米的块状，并接种到WPM预培养基中培养30min。然后将组织放入1M蔗糖20℃处理6小时，之后放入0.05M蔗糖溶液中浸泡处理5min，最后放入0.1M蔗糖溶液中浸泡处理5min，用无菌抽滤器抽滤以去除蔗糖，使特异组织坏死，只诱导未分化组织。将获得的组织接种到含有30g/L蔗糖，0.7g/L琼脂糖与3.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸与6.0mg/L NAA B5培养基，为了防止真菌及细菌污染，每mL培养基中加入40 U制霉菌素、10 U卡那霉素、40 U庆大霉素。20℃黑暗下培养。
其中，B5培养基配方如下：
1.无机盐 KNO3 2500mg/L
NH4(SO4) 134 mg/L
NaH2PO4·4H2O 150 mg/L
MgSO4·7H2O 250 mg/L
CaCl2 ·2H2O 150 mg/L
KI 0.75 mg/L
H3BO3 3 mg/L
MnSO4 . 4H2O 10mg/L
ZnSO4.7 H2O 2mg/L Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L
CuSO4·5H2O 0.025mg/L
CoCl2·6H2O 0.025 mg/L
Na2-EDTA 37.3 mg/L FeSO4.7 H2O 27.8 mg/L 2.有机物 肌醇 100 mg/L维生素B1 1.0mg/L 烟酸 1.0 mg/L 维生素B6 10mg/L 谷氨酰胺 800 mg/L
⑷培养：两周后，将干细胞明显增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到继代培养基上培养，继代培养基为含有30g/L蔗糖，0.7g/L琼脂糖与3.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸与6.0mg/L NAA B5培养基，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
实施例3-15
实施例3-15除如文后附表中所列试验条件不同外，其他试验条件均与实施例1相同。
测试例1-9
超声处理的细胞组织更易分散，防止细胞聚集。同时，超声可以利用其振动能量改变细胞膜的通透性，加速高渗处理对组织的破坏能力，故对超声波的频率和处理时间，以及高渗处理时间进行正交试验分析，以探索最佳的处理方式，提高干细胞的诱导效率，降低染菌风险。具体试验方法参见试验方案和试验数据分析表。
试验方案和试验数据分析表
注：*干细胞诱导率：指只诱导出松散干细胞，无明显愈伤组织细胞，无感染杂菌。干细胞诱导率=长出健康干细胞外植体数/总的外植体数×100%。
K：为因素试验结果之和；
k：为因素实验结果之和的平均值；
R：为k中最大值与最小值之差。
通过试验数据可得，高升处理时间对干细胞的诱导率影响最大，超声时间次之，超声频率最小。
根据试验数据可看出，适当的增加超声频率和超声时间可有效的缩短高渗处理时间，而超声频率过大或时间太长反而会降低干细胞的诱导率，本实验优选的处理方式为：超声波频率20 kHz ，超声波处理时间5min，1M蔗糖高渗处理时间4h。

Claims (9)

1.一种金线莲干细胞分离培养基，包括：含有30g/L蔗糖、0.7g/L琼脂糖、1.0～10mg/L2,4-D、1.0～10.0mg/L NAA的MS培养基或B5培养基；或者含有30g/L蔗糖、0.7g/L琼脂糖、1.0～5.0mg/L吲哚丁酸IBA、0.1～1.0mg/L 6-糖基氨基嘌呤KT的MS培养基或B5培养基，其特征在于，每毫升所述培养基中还添加10-200U制霉菌素、10-200U卡那霉素、10-200U庆大霉素。
2.根据权利要求1所述的金线莲干细胞分离培养基，其特征在于，每毫升培养基中添加40U制霉菌素、40U卡那霉素、200U庆大霉素。
3.根据权利要求1或2所述的金线莲干细胞分离培养基，其特征在于，所述培养基为含有30g/L蔗糖、0.7g/L琼脂糖、3.0mg/L吲哚丁酸、0.5mg/L 6-糖基氨基嘌呤的B5培养基。
4.一种金线莲干细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）消毒 将金线莲新生的茎或健康根冲洗消毒；
（2）防褐变 将灭菌的茎或根置于含有抗氧化剂的褐变抑制培养基中摇瓶培养，然后去除组织表面的水分；
（3）分离 在含抗氧化活性的切削液中，将组织切成块状，并接种到WPM培养基中进行预培养；然后将组织放入1M蔗糖溶液中超声处理4～24小时，之后放入0.05M蔗糖溶液中浸泡处理5min，最后放入0.1M蔗糖溶液中浸泡处理5min，去除蔗糖；将获得的组织接种到如权利要求1所述的分离培养基中培养；
（4）培养 两周后，将干细胞明显增殖的外植体取出，分离干细胞，继代培养基上培养。
5.根据权利要求4所述的金线莲干细胞培养方法，其特征在于，所述超声处理时间5min，超声频率20kHz；1M蔗糖溶液中浸泡4h。
6.根据权利要求4所述的金线莲干细胞培养方法，其特征在于，所述继代培养基为下述1）或2）的培养基：
1)含有30g/L蔗糖、1.0～10.0mg/L 2,4-D、1.0～10.0mg/L NAA的MS培养基或B5培养基；
2) 为含有30g/L蔗糖、1.0～5.0mg/L IBA、0.1～1.0mg/L 6-KT的MS培养基或B5培养基。
7.根据权利要求6所述的金线莲干细胞培养方法，其特征在于，继代培养基为含有30g/L蔗糖、3.0mg/L 2,4-D和6.0mg/L NAA的B5培养基。
8.根据权利要求4所述的金线莲干细胞培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述防防褐变培养基组成如下：
步骤（3）中切削液组成如下：
。
9.根据权利要求4所述的金线莲干细胞培养方法，其特征在于，所述消毒包括：①将金线莲新生的茎或健康根用自来水冲洗30分钟，将洗涤的组织置于超净工作台的灭菌烧瓶中并用75%( v/v)的乙醇表面消毒1分钟，然后将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次；②然后将组织使用0.5%～10%次氯酸钠消毒10分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次；③再次使用0.5%～10%次氯酸钠消毒5分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次；
所述步骤（2）中摇瓶培养30min。
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