JP2010539900A - 貯蔵根を有する草本植物の形成層由来植物幹細胞株及びその分離方法 - Google Patents
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Abstract
本発明による貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株は高い分裂能を有し、均一な細胞株として、脱分化過程を経ずに、培養時に安定的である。そのため、この増殖を最適化することによって細胞株を短い時間内に大量に増殖させられるようになる。従って、本発明による貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株は耕作期間、耕作地の選定、耕作費などの様々問題によって露地では培養が困難な有用植物体を大量生産できるようにする。
Description
本発明の他の目的は、脱分化過程なしに前記細胞株を分離する方法を提供することである。
(a)貯蔵根を有する草本植物の形成層含有貯蔵根組織を取得する工程、
(b)前記取得された形成層含有貯蔵根組織をインドール−3−酢酸(Indole−3−acetic acid:IAA)またはインドール−3−酪酸(Indole−3−butyric acid:IBA)を含む培地で培養して、形成層由来細胞株を誘導する工程であって、
ここで、前記培養の遂行中または培養前または培養後において前記形成層含有貯蔵根組織に浸透圧ストレスを与える工程、及び
(c)前記誘導された形成層由来細胞株を回収する工程、
を含む前記分離方法を提供する。
(a)先天的未分化状態(innately undifferentiated)であり、
(b)均一な細胞株(homogeneous cell line)であり、及び
(c)多数の液胞(vacuole)を有する形態学的特徴を示す、
特性を有する貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株を提供する。
また、望ましくは、前記(c)工程は誘導された形成層由来細胞株を2、4-ジクロロフェノキシ酢酸(2、4-Dichlorophenoxyacetic acid:2、4-D)、ピクロラム(picloram)及びIBAのうちいずれか一つ以上を含む培地で増殖させた後、形成層由来細胞株を回収することを特徴とする。
(1)殺菌プロセス及び浸透圧ストレス処理プロセス
先に、草本植物の形成層含有貯蔵根組織を準備した後、殺菌プロセスに進む。この時、望ましくは、殺菌プロセスは二つの工程で行う。その後、殺菌プロセスを経た形成層含有貯蔵根組織に浸透圧ストレスを与えて、極限環境下において形成層以外の一般組織、即ち、皮層(cortex)、篩部(phloem)、木部(xylem)、髄(pith)においては分裂能を失って、その後、IAAまたはIBAのように形成層分裂特異的なホルモンで処理し培養して壊死させ、高い分裂能を有する形成層のみにおいて、特異的に分裂能を有する均一な細胞株を誘導する。この時、スクロースなどの糖類、マンニトール、ソルビトールなど糖アルコール及び塩化ナトリウムなどの塩類などを浸透剤として使えるが、これに限定されるのではない。
前記浸透圧ストレスの処理後、草本植物の形成層由来細胞株の誘導のために、前記浸透圧ストレスを受けた組織をIAAまたはIBAが含まれた細胞培養用培地に移して、形成層のみにおいて、特異的に細胞分裂を誘導して均一な形成層由来細胞株を取得した。この時、望ましくはIAAまたはIBAが0.5〜3.0mg/Lの含量で添加された細胞培養用培地に形成層を含む切片体を移す。
前記のように誘導された形成層由来均一性細胞株は、植物生長調節物質のオーキシンが含まれた増殖最適培地に移して増殖させて、均一性細胞株を大量に得ることができる。この時、生長調節物質として、望ましくは2、4-D(2、4-Dichlorophenoxyacetic acid)、ピクロラム(picloram)及びIBAの中いずれか一つ以上が使用でき、前記2、4-D、ピクロラム及びIBAの中いずれか一つは望ましくは1〜5mg/L、さらに望ましくは2mg/Lの含量で使用する。
(a)先天的未分化状態(innately undifferentiated)であり、
(b)均一な細胞株(homomogeneous cell line)であり、及び
(c)多数の液胞(vacuole)を有する形態学的特徴を示す、特性を持つ、貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株に関する。
本発明による形成層由来細胞株は、追加的に(a)懸濁培養時に単細胞状態で存在し、(b)貯蔵根を有する草本植物の形成層以外の組織由来細胞株と比べて、生物反応器においてシェアストレス(shear stress)に対して感受性が低く、そして、(c)貯蔵根を有する草本植物の形成層以外組織由来細胞株と比べて、生長速度が速く、かつ安定的に培養されることを特徴とする。
従って、このような植物細胞銀行を構築するために研究素材の供給を円滑にできて、植物細胞株を利用する研究期間を短縮できると期待される。
1-1:植物材料の準備
図1は本発明において使った露地高麗人参の典型的な例を示す。図1に示したように、なめらかで傷がない高麗人参だけを選別・収集して、流水で収集された高麗人参の表面の土やその他の汚れを取り除いた。その後、主根部を使用するために細根を取り除いて、液体洗剤を利用して主根の表面を洗った後、流水に放置した。洗った組織はクリーンベンチ内の準備された滅菌フラスコに入れて70%エタノールで30秒〜1分程度殺菌した。その後、滅菌水で濯ぎ、1%〜1.5%次亜鉛素酸ナトリウム(sodium hypochlorite,Junsei,Japan)を利用して5分内〜8分程度消毒した。その後、消毒液を注ぎ出して滅菌水で1回程度濯ぎ、前記消毒液で5分内〜8分程度2次処理した。この時、消毒液が効果的に組織内に浸透するようにTWEEN20(Polyoxyethelenesorbitan monolaurate,Junsei,Japan)を何滴程度添加して処理した後、滅菌水で3回〜5回程度濯いだ。その後、殺菌処理した組織の褐変化防止のために抗酸化剤が含まれたBIM(browning inhibition medium)に殺菌した主根を入れて30分内〜1時間程度震盪培養した後に滅菌された濾過紙で水気を取り除いた。
その後、前記材料の褐変化防止のために、表2の抗酸化剤を含むCS solution(cutting solution)が入れられた滅菌皿の上に置いて表面皮を薄く剥がして半分に分けて、高い分裂能を有する形成層の部分が含まれるように横×縦×高さ=0.5〜0.7cm×0.5〜0.7cm×0.2〜0.5mmの大きさに切断した。図2は植物の貯蔵組織中の高麗人参類貯蔵根から前記大きさに切断して、形成層を含む切片体を製造した例を示す。
実施例1-1で準備した切片体において、分化された組織、即ち、篩部、木部、髄等は壊死させて、分裂組織の形成層だけを誘導させるために浸透圧ストレス処理を行った。前記形成層含有切片体を濾過紙が敷かれた前培養培地(培地1)にブロッティング(blotting)して、1Mスクロース(DUCHEFA,Netherland)溶液が入れられたフラスコに入れて冷蔵状態で16〜24時間浸透圧ストレスを処理した。その後、0.05Mスクロース溶液(sucrose solution)で5分間、0.1Mスクロース溶液で5分間処理して、高濃度のスクロースによるストレスを解除した。前記浸透圧ストレスが解除された形成層を含む切片体は、濾過紙が敷かれた前培養培地(培地1)に置いて水気を取り除いた。
分裂能を有する均一な形成層由来細胞株を誘導するために、前記実施例1の2の浸透圧ストレス処理した切片体を細胞株誘導培地(培地2)に移した。培養に使われた培地は下記表4に示したとおりである。移した切片体は22±1℃、暗条件で培養した。
図3(a)に示したように、前記実施例1の培地2で培養して形成層以外の他の組織が壊死した後、培地3で継代し培養した。培地3は形成層由来細胞株の増殖最適培地として下の表6に示された基本塩(salt)造成を基にしたものであって表7に示した。
2-1:山参の形成層由来細胞株の誘導
露地山参を準備して、前記実施例1-1と同様の方法で表面殺菌した。また、生物反応器(bioreactor)で保持中である100年もの山参不定根を準備して表2のCS solutionが入れられた滅菌皿に置いて前記と同様の方法で形成層を含む切片体を取得した。その後、準備した二つの試料に対し実施例1-2及び実施例1-3と同様の方法で浸透圧ストレス処理を行った後、形成層由来の均一な細胞株を誘導した。
図5(a)に示したように浸透圧ストレス処理と培地2を使って、形成層のみにおいて、特異的に均一性細胞が誘導された後、露地山参の形成層を含む切片体に対し実施例2と同様の方法で表7に示された培地3で継代した結果、形成層由来の分裂能を有する均一性細胞が分裂及び増殖を繰り返し、培養して約10〜20日後に形成層由来の分裂能を有する均一性細胞株を分離することができた。このように分離した山参形成層由来均一性細胞株を同一培地で培養して、分裂能を有する均一性細胞株を再度増殖させた。図5(b)は分離した形成層特異的均一性細胞株を表7に示された培地3で増殖させた例を示す。また、図5(c)は山参の形成層由来均一性細胞株を光学顕微鏡下単細胞レベルで観察した例を示す。
人参(Daucus carota L.)を準備して、前記実施例1-1と同様の方法で表面殺菌して準備した。その後、準備された試料に対し実施例1-2及び実施例1-3と同様の方法で浸透圧ストレス処理を行った後、形成層由来細胞株を誘導した。
4-1:形成層由来細胞株に対する長期培養確立
前記実施例1において確保された高麗人参の形成層由来の分裂能を有する均一な細胞株のうち、生長率が良く白くて軟らかい細胞(white and friable cell)を毎14日目に新しい増殖最適培地(表7の培地3)で継代し、対照群として不均一な細胞株である高麗人参子葉由来の細胞株を毎28日目に増殖最適培地で継代した。
前記実施例1及び2の高麗人参及び山参の形成層由来細胞株を下記表9の液状培地が含まれたフラスコに入れて、暗条件、25±1℃、100rpmの回転攪拌機(shaker)で培養した。この時、高麗人参形成層及び露地山参の形成層由来細胞株は2、4-Dを使って培養し、山参不定根の形成層由来細胞株はIBAを使って培養した。継代培養周期は2週間に固定することによって培養細胞が常に対数生長期状態で高い活力を維持できるようにした。一方、不均一な細胞株の高麗人参子葉由来カルス(callus、KCTC 10224)も表9の培地4で培養して、本発明による分裂能を有する均一な細胞株の形成層由来細胞株と比較した。
大量培養の可能性を調べるために、3Lの内容積を有する空気浮揚式生物反応器(airlift bioreactor、ソンウォンサイテク、Korea)でヘテロジーニアスな細胞株の高麗人参子葉(cotyledon)由来カルスと実施例2及び3の形成層由来細胞株を培養した。培地は表9の液状培地を使い、暗条件で25±1℃と一定に維持した。
凍結保存は産業化のために選択された有用細胞株を長時間に亘り安全に保存する非常に理想的な方法である。有用な細胞株を安全に保存する方法は次のようになる。
前記実施例4-2のように露地山参形成層由来細胞株を2、4-D処理した培地で14日間懸濁培養した細胞株を利用して、三つの処理区に分けて、実験を行った。
5-1:山参形成層由来細胞株の抽出物製造
実施例4-5の細胞株から次のように抽出物を製造した。
即ち、培養液を取り除いた細胞株(Wet)及び凍結乾燥細胞株(Dry)500gに500mlのDMSOを加えて、50℃で6時間攪拌させながら溶解させた。前記溶解後、3,000gで10分間遠心分離させ上層液を取ることによって蒸溜水可溶性物質を得た。前記で得たDMSO可溶性物質を、回転真空濃縮機を利用して濃縮して、濃縮試料を凍結乾燥機を利用して乾燥させてDMSO抽出物を得た。
紫外線への暴露によってMMPが増加する場合、増加したMMPsは皮膚のコラーゲンを分解して、皮膚のシワを形成させるが、紫外線によって増加したMMP-1の発現が山参形成層由来均一性細胞株抽出物またはその培養液によって抑制される効果を確認するために次のような実験を行った。
紫外線によって増加した活性酸素が山参形成層由来均一性細胞株抽出物またはその培養液によって抑制される効果を確認するため、96ウェルブラックプレート(black plate)にHaCaT細胞(HaCaT cell)を30,000細胞/ウェルとなるように株分けし、各試料を濃度毎に3時間処理した。3時間後、HBSSで1度洗浄してDCF50μmを各ウェルに処理して37℃で20分間反応させた。HBSSで2度洗浄した後、ルミネイター(Luminator)を利用して、初期吸光度を測定した。これにUVB 30MJを照射後、37℃で2時間培養後吸光度を測定した。コントロール(Control)は試料及びUVBを添加しないものであり、UVBは試料の添加なしにUVBだけで処理したものを示す。
山参抽出物のジンセノサイド成分が皮膚老化防止及び抗酸化に効果があると知られているが、それで本発明による細胞株抽出物及びその培養液の皮膚老化防止及び抗酸化効果がこのようなジンセノサイド成分の効果によるものかを調べるためにジンセノサイド含量を測定した。即ち、実施例2において製造したステージ毎の山参の形成層由来均一性細胞株及び山参は凍結乾燥させた後、凍結乾燥された細胞株20Mgをメタノール600ulに1時間抽出して遠心分離後、上層液を分離する。分離した抽出物にジンセノサイド含量はUPLCを利用して測定し、含量はstandard Re、Rb1、Rb2、Rdと比較して示した。また、培養液はエリシテーション1(Elicitation 1)ステージの培養液を0.2μmシリンジ(Syringe)フィルターを利用して濾過(filtration)した後、UPLCを利用して測定し、含量はstandard Re、Rb1、Rb2、Rdと比較して示した。
Claims (11)
- 貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株の分離方法であって、
(a)貯蔵根を有する草本植物の形成層含有貯蔵根組織を取得するステップ、
(b)前記取得された形成層含有貯蔵根組織をインドール−3−酢酸またはインドール−3−酪酸を含む培地で培養して、形成層由来細胞株を誘導するステップであって、
ここで、前記培養の遂行中または培養前または培養後において前記形成層含有貯蔵根組織に浸透圧ストレスを与えるステップ、及び
(c)前記誘導された形成層由来細胞株を回収するステップ、
を含む前記分離方法。 - 前記ステップ(c)は誘導された形成層由来細胞株を2、4-ジクロロフェノキシ酢酸、ピクロラム及びインドール−3−酪酸のうちいずれか一つ以上を含む培地で増殖させ、そして形成層由来細胞株を回収することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(c)のインドール−3−酢酸またはインドール−3−酪酸の含量は0.1〜5mg/Lであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記2、4-ジクロロフェノキシ酢酸、ピクロラム及びインドール−3−酪酸のうちいずれか一つの含量は1〜5mg/Lであることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記草本植物は高麗人参、ツルニンジン、チョウセンオニウド、キキョウ、クズ、ウド、ボウフウ、トウキ、ニンジン、サツマイモ、マカ及びカッサバからなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 貯蔵根を有する草本植物の形成層から誘導され、且つ
(a)先天的未分化状態であり、
(b)均一な細胞株であり、及び
(c)多数の液胞を有する形態学的特徴を示す、
特性を持つ、貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株。 - 前記細胞株は、
(a)懸濁培養時に単細胞状態で存在し、
(b)貯蔵根を有する草本植物の形成層以外の組織由来細胞株と比べて、生物反応器においてシェアストレスに対して感受性が低く、そして
(c)貯蔵根を有する草本植物の形成層以外組織由来細胞株と比べて、生長速度が速く、かつ安定的に培養される、
特性をさらに有することを特徴とする、請求項6に記載の貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株。 - 前記細胞株は、
(a)貯蔵根を有する草本植物の形成層含有貯蔵根組織を取得するステップ、
(b)前記取得された形成層含有貯蔵根組織をインドール−3−酢酸またはインドール−3−酪酸を含む培地で培養して、形成層由来細胞株を誘導するステップであって、
ここで、前記培養の遂行中または培養前または培養後において前記形成層含有貯蔵根組織に浸透圧ストレスを与えるステップ、及び
(c)前記誘導された形成層由来細胞株を回収するステップ、
を含む方法により分離されることを特徴とする請求項6に記載の、貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株。 - 前記ステップ(c)は誘導された形成層由来細胞株を2、4-ジクロロフェノキシ酢酸、ピクロラム及びインドール−3−酪酸のうちいずれか一つ以上を含む培地で増殖させ、そして形成層由来細胞株を回収することを特徴とする請求項8に記載の貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株。
- 前記草本植物は高麗人参、ツルニンジン、チョウセンオニウド、キキョウ、クズ、ウド、ボウフウ、トウキ、ニンジン、サツマイモ、マカ及びカッサバからなる群より選択されることを特徴とする請求項6に記載の貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株。
- 請求項6〜10のいずれか1項に記載の、貯蔵根を有する草本植物の形成層由来細胞株を、凍結することを特徴とする草本植物細胞株の保存方法。
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