CN103667171A

CN103667171A - 西红柿干细胞分离及培养方法

Info

Publication number: CN103667171A
Application number: CN201210336263.0A
Authority: CN
Inventors: 亓琴
Original assignee: LUGANG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: LUGANG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2014-03-26

Abstract

西红柿干细胞分离及培养方法，其特征在于：包含以下步骤；（1）将西红柿的茎经过0.1%的升汞消毒处理10分钟，然后切成1厘米长的茎段并从中间纵向剖开；（2）将上述处理后的茎段放置在含有0.2-2.0mg.^L-1萘乙酸与0.1-2.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤的通用MS培养基上，25℃黑暗下培养；（3）两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到含有0.2-2.0mg.^L-1萘乙酸与0.1-2.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤的继代培养基上培养，每两周继代一次。该方法采用未分裂的形成层干细胞进行分离及培养西红柿干细胞，其形成层干细胞进行无限增殖，可有效扩大生产。

Description

西红柿干细胞分离及培养方法

技术领域

本发明涉及一种蔬菜干细胞的分离及培养方法，特别涉及一种西红柿干细胞分离及培养方法。

背景技术

西红柿是消费量很大的果蔬，深受广大消费者喜爱，市场需求量很大。西红柿含有番茄红素等多种抗氧化物质和其它有效成份，这些有效成分可作为中间产品进行开发，用于保健食品和化妆品。目前生产上培育的西红柿品种丰富，种植面积大，产量也很高，是满足西红柿需求的主要途径。

虽然传统的种植技术及近年来发展的反季节栽培技术可以大量生产西红柿，但由于西红柿不耐储存，生产过程中又容易受到环境条件、病虫害和重金属污染的影响，所以西红柿产业总体上存在产品质量难以控制，保鲜期短，即使采用各种方法延长保存期也难以保持新鲜的口感和营养价值等问题，因此不能保持稳定的对西红柿有效成分进行提取，影响该中间产品的生产。

通过离体悬浮培养西红柿的细胞来生产西红柿的相关成份，这种方法不受生长季节的限制就可以通过规模化生产来获得大量的西红柿有效成分。在过去的生产实践中，通常取西红柿的茎或叶片为外殖体在特定培养基上培养，经过脱分化阶段诱导得到具有分裂能力的愈伤细胞，进一步将该细胞悬浮培养来扩大生产。

目前已有的技术在分离西红柿的细胞时，均采用已经分化的组织器官为外殖体，通过离体培养阶段的培养（脱分化过程）将其诱导为具有分化能力的愈伤细胞。但这种细胞的本质是来源于已经分化的体细胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不强。在工业化量产过程中，经常会出现细胞系退化，分裂能力弱，很难进行超大体积的培养等缺点。

针对已有的西红柿细胞悬浮培养体系中采用的体细胞的缺点，本发明则注重分离和培养西红柿的形成层干细胞。因为形成层干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，所以悬浮培养中如果采用形成层干细胞将可以避免脱分化体细胞的缺点。

发明内容

本发明提供一种西红柿干细胞分离及培养方法，目的是解决现有技术问题，提供一种提供一种采用未分裂的形成层干细胞进行分离及培养西红柿干细胞的方法，该方法仅使形成层干细胞进行无限增殖，而体细胞则不会增殖。

本发明解决问题采用的技术方案是：

西红柿干细胞分离及培养方法，其特征在于：包含以下步骤；

（1）将西红柿的茎经过0.1%的升汞消毒处理10分钟，然后切成1厘米长的茎段并从中间纵向剖开。

（2）将上述处理后的茎段放置在含有萘乙酸与苄氨基腺嘌呤的通用MS培养基上，25℃黑暗下培养。

（3）两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到含有萘乙酸与苄氨基腺嘌呤的继代培养基上培养，每两周继代一次。

步骤（2）中MS培养基上含有0.2-2.0mg.^L-1萘乙酸与0.1-2.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤。其中萘乙酸的含量优选0.5mg.^L-1，6-苄氨基腺嘌呤的含量优选1.0mg.^L-1。

步骤（3）中MS培养基上含有0.2-2.0mg.^L-1萘乙酸与0.1-2.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤。其中萘乙酸的含量优选0.5mg.^L-1，6-苄氨基腺嘌呤的含量优选1.0mg.^L-1。

本发明的有益效果：本发明中采用对西红柿的形成层干细胞进行分离和培养，由于形成层干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，所以悬浮培养中采用形成层干细胞可以避免脱分化体细胞的缺点，能够进行超大体积的培养，而且通过对培养基中萘乙酸与6-苄氨基腺嘌呤的浓度限定，可以控制体细胞的生长，只有形成层干细胞进行生长，能有效稳定的对西红柿有效成分进行生产。

附图说明

图1中表示的是接种在培养基上的西红柿茎段；

图2中表示的是西红柿茎段上增殖的干细胞团块；

图3中表示的是西红柿干细胞的继代增殖。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明西红柿干细胞分离及培养方法，包括以下步骤：

（1）将西红柿的茎经过0.1%的升汞消毒处理10分钟，然后切成1厘米长的茎段并从中间纵向剖开，（见图1）。

（2）将上述处理后的茎段放置在含有0.2-2.0mg.^L-1萘乙酸与0.1-2.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤的通用MS培养基上，25℃黑暗下培养。其中萘乙酸的含量优选0.5mg.^L-1，6-苄氨基腺嘌呤的含量优选1.0mg.^L-1。由于形成层的干细胞分裂速度快，导致形成层干细胞团在外殖体上显著积累而形成一团细胞（见图2），这种干细胞团质地致密，表面较光滑平整。

（3）两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到含有0.2-2.0mg.^L-1萘乙酸与0.1-2.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤的继代培养基上培养，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞(图3)。其中萘乙酸的含量优选0.5mg.^L-1，6-苄氨基腺嘌呤的含量优选1.0mg.^L-1。

实施例1

（2）将上述处理后的茎段放置在含有0.2mg.^L-1萘乙酸与0.5mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤的通用MS培养基上，25℃黑暗下培养。

（3）两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到含有0.5mg.^L-1萘乙酸与1.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤的继代培养基上培养，每两周继代一次。

实施例2

（2）将上述处理后的茎段放置在含有1.0mg.^L-1萘乙酸与1.5mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤的通用MS培养基上，25℃黑暗下培养。

（3）两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到含有2.0mg.^L-1萘乙酸与1.5mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤的继代培养基上培养，每两周继代一次。

下述表格1中数值为实施例3至实施例15采用的MS培养基和继代培养基中萘乙酸和6-苄氨基腺嘌呤的浓度。

表1

本发明中将含形成层干细胞的西红柿茎段放置到适当的诱导培养基上进行干细胞培养，该培养基可以特异性地诱导形成层干细胞快速增殖，而已分化的体细胞由于其生理状态的不同而不能在此培养基上被诱导增殖，这样就可以得到较多的形成层干细胞，为进行下一步的继代增殖培养提供基础。同时控制步骤（2）中MS培养基和步骤（3）中继代培养基上的萘乙酸和6-苄氨基腺嘌呤的浓度范围，可以控制西红柿体细胞的增殖，即采用本方法进行西红柿干细胞的培养时，仅形成层干细胞进行增殖，而体细胞不会进行增殖，这样，在西红柿茎段上，可以清晰的分辨出形成层干细胞的增殖体，方便将形成层干细胞增殖体分离出来，并继续进行培养。由于形成层干细胞具有无限分裂的能力，生长速度快，抗逆能力强，为超大体积的液体悬浮培养提供基础，可以显著减少生产成本。

Claims

1.西红柿干细胞分离及培养方法，其特征在于：包含以下步骤；

（1）将西红柿的茎经过0.1%的升汞消毒处理10分钟，然后切成1厘米长的茎段并从中间纵向剖开；

（2）将上述处理后的茎段放置在含有萘乙酸与6-苄氨基腺嘌呤的通用MS培养基上，25℃黑暗下培养；

（3）两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到含有萘乙酸与6-苄氨基腺嘌呤的继代培养基上培养，每两周继代一次。

2.如权利要求1中所述的西红柿干细胞分离及培养方法，其特征在于：步骤（2）中MS培养基上含有0.2-2.0mg.^L-1萘乙酸与0.1-2.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤。

3.如权利要求2中所述的西红柿干细胞分离及培养方法，其特征在于：萘乙酸的含量优选0.5mg.^L-1，6-苄氨基腺嘌呤的含量优选1.0mg.^L-1。

4.如权利要求1中所述的西红柿干细胞分离及培养方法，其特征在于：步骤（3）中MS培养基上含有0.2-2.0mg.^L-1萘乙酸与0.1-2.0mg.^L-16-苄氨基腺嘌呤。

5.如权利要求4中所述的西红柿干细胞分离及培养方法，其特征在于：萘乙酸的含量优选0.5mg.^L-1，6-苄氨基腺嘌呤的含量优选1.0mg.^L-1。