CN103430851A - 一种提高黄瓜远缘杂交组培苗驯化成活率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种提高黄瓜远缘杂交组培苗驯化成活率的方法，属于生物技术领域，主要用于黄瓜种属间杂交材料的扩繁保存和驯化成苗，为远缘杂交技术在黄瓜育种中的应用提供了一个技术保证。其步骤主要包括：胚拯救获取无菌苗、诱导分化不定芽、再生芽的伸长和生根培养、驯化移栽及在此过程中的特殊配制的培养基及外界环境条件的调控。本方法操作简便，对原材料及实验室设施要求较低，但成效极好，可使远缘杂交组培苗获得更强壮的功能根，且缩短了炼苗周期，提高了移栽成活率，不仅为黄瓜种属间杂交乃至甜瓜属内杂交提供了稳定高效的再生苗驯化体系，而且也可以用于甜瓜属珍惜野生种的保存和扩繁及普通黄瓜组培苗的移栽成苗。

Description

一种提高黄瓜远缘杂交组培苗驯化成活率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高黄瓜远缘杂交组培苗驯化成活率的方法，特别适宜于黄瓜种属间杂交材料的驯化成苗，属于生物技术领域。

背景技术

黄瓜是一种重要的世界性蔬菜，种质资源较多，但是种内变异有限，严重阻碍了黄瓜的育种实践。甜瓜属野生和近缘种质资源具有多种抗病、抗逆基因，是黄瓜品种改良的重要外源基因库。远缘杂交是转导、利用外源有用性状的重要途径。陈劲枫率先通过远缘杂交成功获得了黄瓜和同属野生种C.hystrix间的杂种，随后又获得了一系列种间异染色体系材料。这些材料中的很大一部分需要通过胚拯救获得，以及组培保存，并且需要驯化成苗后才能加以研究利用。基于甜瓜属种属内杂交的困难性，目前获得的唯一的种间杂种及其衍生材料是非常珍贵的，这些资源需要不断地继代保存，并且为了最大化材料的利用价值，那么就需要提高这些组培材料的驯化成活率。有关黄瓜组培苗移栽成活已有一些报道，例如：

1)赵军良等，《黄瓜子叶组织培养再生植株》[J]山西农业科学，1996,24(1)：23

2)陈穗云等，《一种提高组培植物材料生根率和移栽成活率的方法》专利公开号CN1709043A

3)张卫华等，《一种高效的黄瓜组培再生及其再生苗移栽成活方法》专利公开号CN101002540A

4)缪旻珉等，《苗龄与基质对黄瓜转基因组培苗驯化成活率的影响》，中国蔬菜，2008(10)：19-21

5)徐冉，《黄瓜(Cucumis sativusL.)遗传转化、植株再生及驯化技术研究》，博士论文

在上述这些报道中，人们主要是从转基因的角度进行了植株再生条件等研究，但是这些体系并不完全适合于黄瓜远缘杂交材料，尤其是在移栽驯化阶段，难以达到很高的成活率，从而造成了珍稀材料的浪费。因此，建立一种广泛适合于黄瓜种间杂种乃至甜瓜属远缘杂交组培苗驯化移栽并且能够大大提高其成活率的方法，是非常有意义的。这一方法是对本课题组先前的研究体系(1.陈劲枫等，异源三倍体黄瓜的离体繁殖和鉴定，植物生理学通讯，2003(02)；2.罗向东等，甜瓜属种间杂交中3种不同倍性资源的微繁，植物生理学通讯，2004(05)。)的优化和升华。

发明内容

本发明目的是提供一种提高黄瓜远缘杂交组培苗驯化成活率的方法，该方法可以使远缘杂交组培苗获得更强壮的功能根，缩短炼苗周期，提高移栽成活率。

具体步骤如下：

1)胚拯救获取无菌苗：从杂交果实中将幼胚夹出，去囊，接种于MS+0.2mg／L6-BA+60g／L蔗糖的培养基上。置于25℃的组培室中培育6-10天后，将萌发出芽的胚转接于新鲜的MS培养基上，一周左右得到无菌苗。

2)诱导分化不定芽：将无菌苗的顶芽接种于MS+0.5mg／L6-BA+30g/L蔗糖的分化培养基上，置于25℃，光照2000-2500lx的组培室中培养2周左右。

3)再生芽的伸长培养：将丛生不定芽转接于MS+2mg／L6-BA+30g/L蔗糖的培养基上继续培养，促进芽的伸长生长。

4)生根培养：当不定芽伸长至1.0cm时，选取健壮的芽接至1／2MS+0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖的培养基上生根，10-15天左右长出大量不定根。

5)炼苗和移栽：将培养瓶的瓶盖掀起适应3天左右后，洗去培养基，将其移栽至育苗穴盘，基质为营养土／蛭石=1∶1，再将穴盘置于大周转箱或小拱棚中覆膜驯化，湿度85％以上，温度25℃，一周后揭膜，二周后可定植于试验田，成活率为98％以上。

有益效果

本发明包括胚拯救获得无菌苗、不定芽的分化和伸长、再生芽生根、炼苗和移栽等一系列过程，可以提高杂种胚的萌发率，加快不定芽的繁殖，降低愈伤化和玻璃化的程度，易获得根系旺盛且健壮的组培苗，驯化成活率可达到98％以上。此方法在40天左右就可以获得发育良好，生长旺盛的苗子。这一方法不仅为黄瓜种属间杂交乃至甜瓜属内杂交提供了稳定高效的再生苗驯化体系，而且也可以用于甜瓜属珍惜野生种的保存和扩繁及普通黄瓜组培苗的移栽成苗。

附图说明

图一：技术流程图

图二：胚拯救远缘杂交种子

图三：不定芽分化

图四：再生芽转接并生根

图五：驯化组培苗

图六：移栽成活、生长健壮的黄瓜种间杂种苗

具体实施方式

1.胚培养：将一个以栽培种黄瓜‘白丝条’为母本，黄瓜近缘野生种C.hystrix为父本的杂交果实用清水洗干净，再用脱脂棉蘸取75％的乙醇对其表面消毒后，在超净工作台上铺上高温灭过菌的滤纸，用镊子夹出果实中不饱满的种子，去囊，纵切去除1／2种皮后，将胚插入MS+0.2mg/L6-BA+60mg／L蔗糖的培养基上进行胚培养，温度25℃，光照2500lx。培育6天后，将萌发出芽的胚转接于新鲜的MS基本培养基上，其他条件不变，一周后可得到无菌苗。

2.丛生不定芽的诱导：将上述无菌苗的顶芽抑或腋芽(约0.5-1.5cm)在铺有无菌滤纸的超净工作台上小心切下，转接于MS+0.5mg／L6-BA+30g／L蔗糖的分化培养基上进行芽的诱导，温度和光照不变，2周后可以在切口边缘见大量的丛生不定芽。

3.再生芽的伸长和生根：将丛生不定芽转接于MS+2mg/L6-BA+30g/L蔗糖的培养基上继续培养，以促进芽的伸长生长，温度和光照不变；当不定芽伸长至1.0cm左右时，选取长势良好且整齐的芽切下，转接至1／2MS+0.2mg／L IBA+30g/L蔗糖的培养基上生根，15后长出了大量健壮的不定根。

4.移栽驯化：选择生根后生长旺盛的组培苗，将其瓶盖掀起适应外界环境三天，用清水小心洗去根上的培养基。将育苗穴盘装上混好的基质(营养土／蛭石＝1∶1)，并且用加了低浓度生根剂(例如根苗生物肽)的清水一次性浇透，再将小苗移栽至穴盘中，如果根较多且过于发达，也可以直接移入小的育苗营养钵中，再将穴盘或营养钵置于大周转箱中驯化，周转箱上方要覆上薄膜，将薄膜用镊子扎少量小孔用于透气，在箱底部放一小烧杯清水保湿，将整个周转箱置于白天湿度85％／温度25℃，夜晚湿度80％／温度20℃的光照培养箱中。

5.定植：驯化5天后，可逐渐揭开薄膜，一周后就可以完全揭开，组培苗在光照培养箱(白天湿度75％／温度25℃，夜晚湿度70％／温度20℃)中再生长一周后，就可直接定植于试验田。

Claims (2)

1.一种提高黄瓜远缘杂交组培苗驯化成活率的方法，主要包括：

胚拯救获取无菌苗、诱导分化不定芽、再生芽的伸长和生根培养、驯化移栽及在此过程中的特殊配制的培养基及外界环境条件的调控。其特征在于：

(1)胚培养：接种时种子要去囊，纵切去除1／2种皮，培养基为MS+0.2mg/L6-BA+60mg/L蔗糖，高浓度的蔗糖有利于杂种胚的萌动，出芽后及时转接到新鲜的MS培养基上继续培养；

(2)丛生芽的诱导：切取无菌苗的顶芽或腋芽，培养基为MS+0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖，此时要降低蔗糖浓度为胚培养时的一半；

(3)再生芽的伸长培养：将丛生不定芽接种到MS+2mg/L6-BA+30g/L蔗糖的培养基上，提高细胞分裂素的浓度，促进其生长；

(4)再生芽的生根：将大于1cm的不定芽转接于1／2MS+0.2mg／L IBA+30g／L蔗糖的培养基上，此时将激素6-BA换成IBA，促进其不定根的萌发；

(5)驯化：选择生根后健壮的苗子，将瓶盖掀起适应3天后，洗净培养基，将其移栽入育苗穴盘或育苗钵中，基质要提前用加了低浓度生根剂的清水浇透，可以使苗子生长更快更健壮，成活率更高，转入简易周转箱后，在箱底部放一小烧杯清水保湿，上面再覆上一层薄膜(保鲜膜即可)，用镊子在膜上扎些小孔，密度要小可透气，防止苗子在密闭湿润的环境中染病，将整个周转箱置于白天湿度85％／温度25℃，夜晚湿度80％／温度20℃的光照培养箱中，保持一个稳定的外界条件；

(6)定植：驯化5天后，可逐渐揭开薄膜，一周后就可以完全揭开，组培苗在光照培养箱(白天湿度75％／温度25℃，夜晚湿度70％／温度20℃)中再生长一周后，就可直接定植于试验田。

2.根据权利要求1所述的过程就可以获得一种提高黄瓜远缘杂交组培苗驯化成活率的方法。

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