CN1079000A - 紫杉属植物体细胞胚胎发生的诱导，以及由它生产含有紫杉烷环的生物碱 - Google Patents

紫杉属植物体细胞胚胎发生的诱导，以及由它生产含有紫杉烷环的生物碱 Download PDF

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Abstract

本发明提供了在紫杉属品种的组织培养物中诱 导体细胞胚发生的方法。另外，本发明还提供了利用 体外繁殖的体细胞胚组织获得紫杉酚及其前体的方 法。

Description

本发明属于植物细胞培养和药理学领域，尤其是涉及在紫杉属，特别是短叶红豆杉（T.brevifolia）的植物组织培养和初级外植体中诱导体细胞胚胎发生。
本发明还涉及一个惊人的发现：由短叶红豆杉的外植体诱导形成的体细胞胚能产生含有紫杉烷环（taxane-ring）的生物碱。利用这一发现，描述了由体细胞胚的体外繁殖培养物生产紫杉酚（taxol）或紫杉酚前体的方法。
A.紫杉酚和通过体外繁殖生产次级植物代谢物
紫杉酚在1964年首次被证实为一种二萜，随后又证明它具有抗癌作用，能抗卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、黑素瘤和结肠癌。紫杉酚和两种含有紫杉烷环的生物碱前体的结构如下：
Figure 93104538X_IMG1
                                                    10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ
紫杉酚主要产生于短叶红豆杉（T.brevifolia）的树皮和形成层组织。利用现有方法，生产1公斤紫杉酚需要约10，000公斤的树皮，这相当于2000-4000株六十年至七十年树龄的树木的树皮。最新的估计是，每年需要大约250公斤紫杉酚纯药。这相当于二千五百万公斤干树皮或是约750，000株树的产量。由于短叶红豆杉的缺乏，目前正在寻找其它的紫杉酚资源。
经过考证的一个紫杉酚的潜在资源是体外培养的细胞和组织。美国专利US-5，019，504描述了短时红豆杉外植体的愈伤组织细胞培养物的发生和增殖。由该方法所形成的愈伤组织细胞被证实能产生紫杉酚。
利用愈伤组织或是未分化的细胞培养物生产次级代谢物，如紫杉酚，还有一些障碍。通常，次级代谢物由异化的或分化的组织产生;最突出的是，树皮产生紫杉酚或是树叶产生诸如浆果赤霉素之类的其他紫杉烷。未分化的或愈伤组织培养物通常缺乏组建象紫杉烷这么复杂的分子的必要的生物合成能力，或者是缺乏一旦合成之后分离这些分子所需要的细胞分化程度。所以，其结果一直是，在愈伤组织培养物中没有发现次级代谢物，而且，即使偶尔在愈伤组织中测到次级代谢物，其浓度通常也是远低于植株中的。
虽然如此，对于用愈伤组织培养物生产次级代谢物的问题还是做了广泛的研究，因为这种愈伤组织易于建立和操作，并且生长速度快。通常，为了进行体外研究，快速生长的愈伤组织培养物是产生用于检测次级代谢物比如这种低浓度的紫杉酚所需的大量组织的最简便的方法。愈伤组织培养物快速生长的速度突出了它们的另一个缺陷：即，组成该培养物的细胞倾向于遗传上不稳定，表现出高度的遗传重组和不稳定的倍性水平。这种遗传学上的不稳性能最终会导致具有极低的紫杉酚生产能力的培养物的产生。为了避免这一问题的出现，就需要由一个遗传库连续地重建愈伤组织培养物。
为了大规模体外产生次级植物产品，将快的生长速度与具有分化的细胞或组织所固有的产生次级代谢物的能力的未分化的细胞培养物体的高生物量浓度的能力结合在一起是有利的。研究者已经认识到，以与未分化的细胞培养物（即：愈伤组织或细胞悬浮液）同原型的方式繁殖的、但是由分化的细胞或组织组成的培养物具有产生次级代谢物的潜力。例如，已经对幼芽培养物（由大量快速增殖的幼芽组成的组织培养物）作为在叶片或茎杆组织中发现的香精油和生物碱的来源进行了研究（Heble，in：Primary    and    Secondary    Metabolism    in    Plant    Cell    Cultures，Neumann等（ed.），Springer-Verlag，Berlin    Heidelberg，PP.281-289（1985））。在幼芽培养中，让能够产生并分离出香精叶子油的特异组织类型增殖，而且，芽的形态发生所要求的严格的发育程序也降低了遗传上的不稳定性。这样，已证实组织培养能综合未分化和已分化体系的诱人前景。
尽管在未分化的细胞培养中检测到了紫杉酚的存在，但尚未在组织培养体系中描述过其产生过程。胚发生的组织培养物就是这样的体系之一。
从生物化学、组织学和宏观性状来看，胚发生的针叶树组织培养物显著不同于针叶树的愈伤组织培养物。尽管术语“愈伤组织”是用于描述细胞和组织培养物的一种普通术语，但是，针叶树体胚胎发生领域的许多研究人员都反对用“愈伤组织”来描述胚发生的针叶树组织（例如参见Gupta和Durzan的论文，Bio/Tech.5∶147-151（1987）;Rohr等，Amer.J.Bot.76∶1460-1467（1988）;Tautorous等，Can.J.bot.69∶1873-1899（1991））。反对使用“愈伤组织”一词的理由是，胚发生的针叶树组织培养物不是由未分化的细胞组成，而是由分化的细胞（类胚柄细胞）组成，且其结构类似于处于发育状态的种子的早期胚。因此，胚发生的针叶树组织培养物不适于愈伤组织或其液体对应物、细胞悬浮培养物的定义，它表示一种通过使具有组织培养体系的次级代谢物产生能力的细胞培养体系的有利的生长特性具体化来生产紫杉酚的改良途径。
B.针叶树的体细胞胚胎发生
尽管本领域中诱导体细胞胚胎发生的方法已公开了一段时间（Tisserat）等，Hort.Rev.1∶1-78（1979）），但直到最近才在具有松果的树种上成功地得到验证（见Hakman等，Plant    Sci.38∶53-59（1985））。自从首次报导在针叶树的细胞培养物中成功地诱导了体细胞胚胎发生一来，已证实了来自松属、云杉属、冷杉属、落叶松属、黄杉属的18个树种具有产生体细胞胚的能力（Tautorous等，Can.J.Bot.69∶1873-1899（1991））。
由针叶树生产体细胞胚并不是普遍的。一些重要的品种，如紫杉属的树种尚未培养成功。
C.转基因植物
重组DNA和遗传技术方面的最新进展使得在受体植物上理想基因序列的导入和表达成为可能。通过采用这种方法，经过遗传工程处理过的植物可以表达在天然植物中不是正常存在或者不是天然存在的基因序列。利用重组技术产生的植物被称为“转基因”植物。
转基因植物通常是通过转化单个的植物细胞，然后再通过体细胞胚胎发生由该细胞再生出全植株而产生的。由于从单细胞可以再生许多种属的植物（Friedt，W.等，Prog.Botany49∶192-215（1987））;Brunold，C.等，Molec.Gen    Genet.208∶469-473（1987）;Durand，J.等.Plant    Sci.62∶263-272（1989）;Attree等，Can.J.bot.67∶1790-1795（1989），所以要从一个广泛的植物种群中成功地产生转基因植物从理论上讲是可行的。
一些向植物细胞中导入外源基因并使之表达的方法已经发展起来。其中包括来自根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）的遗传工程的Ti质粒（Czako，M.等，Plant    Mol.Biol.6∶101-109（1986）;Feirer等，Proceedings    20th    Southern    Forest    Tree    Improvement    Conference，1989年6月26日-30日，Charleston，South    Carolina    Pg.381;Jones，J.D，G.等，EMBO    J.4∶2411-2418（1985））;遗传工程的植物病毒，如花椰菜花叶病毒（Shah，D.M.等，Science233∶478-481（1986））;Shewmaker，C.K.等，Virol.140∶281-288（1985））;将基因序列显微注射到植物细胞法（Crossnay，A.等，Molec.Gen.Genet.202∶179-185（1986）;Potrykus，I.等，Molec.Gen.Genet.199∶169-177（1985））;电激法（Fromm，M.E.等，Nature319∶791-793（1986）;Tautorus等，Theon.Appl.Genet.78∶531-536（1989）），以及DNA包覆粒子加速法（Bolik，M.等，Protoplasma162∶61-68（1991））。上述方法中的几种已成功地用于体外转化针叶树组织（Ellis等，Internationol    Society    of    Plant    Molecular    Biology，1991年10月6-11日会议，Tucson;Arizona）。
为了生产紫杉酚以及相关的紫杉烷，针叶树（即紫杉属）的胚发生的组织培养物综合了快速生长和具有分化细胞所固有的次级代谢物积累能力的愈伤组织培养物的生物量生产能力。尽管在短叶红豆杉（T.brevifolia）的愈伤组织培养物中检测到了紫杉酚的存在（Christen等，US-5，019，504），但未报导其产量。紫杉属的胚发生的组织培养物与常规的愈伤组织培养物的生长相似，并能以相同的方式处理。但是，由于它含有能产生和分离紫杉烷的组织，所以这种组织培养物具有产生更多紫杉烷的能力。
胚发生的针叶树组织即使对体细胞胚胎发生领域来说也是一种独特的组织，这种组织在植物繁殖和次级代谢物生产方面的潜力尚未进行鉴定。因此，本发明描述了如何利用紫杉属胚发生的组织培养物的独特能力来生产紫杉酚及相关的紫杉烷。
本发明是基于这样的观察结果：由紫杉属植物经体外培养所获得的初级外植体能产生并分泌出抑制体细胞胚胎发生的化合物。根据这一观察结果，本发明提供了从紫杉属植物的培养物和初级外植体诱导体细胞胚胎发生的方法。具体地说，通过首先在一种培养基上培养紫杉属植物的外植体，随后又在培养过程中不断将外植体转移到新的培养基上以获得早期体细胞胚的办法，可以由紫杉属植物的外植体得到胚发生的组织。
本发明还涉及到培养的紫杉属的胚胎发生的组织。
本发明还提供了无性繁殖紫杉属植物的方法。具体地说，紫杉属的植物可以这样无性繁殖：（1）在一种培养基上培养紫杉属植物的外植体，（2）在培养过程中将该外植体不断转移到新的培养基上，以获得胚发生的组织，（3）将胚发生的组织转移到能将其内所含的体细胞胚诱导成植株的培养基中。
本发明还提供了生产遗传上变异了的紫杉属植物的方法。利用本发明的诱导体细胞胚发生的方法，现在可以由遗传上变异了的单个的紫杉属植物细胞再生出全植株。以这种方式产生的植株，可以选择其产生较多紫杉酚或含紫杉烷环的生物碱的能力，或是选择其在特殊生理状态下生长的能力。具体地说，本发明涉及一种繁殖能大量生产含紫杉烷环的生物碱的紫杉属变种植株的方法。这些变种可以是从在体外繁殖过程中出现的自然发生的变种中筛选出来的，或是通过化学或物理诱变产生的，还可以是用外源DNA转化所获得的结果。
本发明还基于这样的惊人发现：体外繁殖的紫杉属植物的体细胞胚能产生含紫杉烷环的生物碱。这一结果之所以惊人，是因为从未见过在胚中发现紫杉酚的报道。而且，更没料到的是体细胞胚可以产生象含紫杉烷环的生物碱这样的次级代谢物，因为据信这种胚缺乏产生这些次级代谢物所必需的生物化学结构。
利用胚发生的组织的体外培养物，现在可以生产大量的含有紫杉烷环的生物碱。胚发生的组织具备愈伤组织培养物所有的快速生长的优点，可以产生大量的组织，同时，还能激增能分离紫杉烷的结构（体细胞胚）。来自紫杉属植物的体细胞胚培养物的含紫杉烷环的生物碱可以这样获得：首先在一种培养基上，在能够产生体细胞胚的条件下培养来自紫杉属植物的外植体，然后，从体细胞胚或其培养基中分离含紫杉烷环的生物碱。
附图的简要说明：
图1表示松柏目胚胎发育的几个典型时期;
图2a和2b表示生产体细胞胚的连续流体系统（a）和生产含紫杉烷环的生物碱的连续流体系统;
图3是从若干紫杉属品种诱导体细胞胚发生的总结;
图4表示系列的三条HPLC曲线，其中，曲线1是表示通过在液体培养基中培养短叶红豆杉所获得的提取物的成份分离的HPLC曲线。曲线2是短叶红豆杉提取物与紫杉酚标准样品混合物的HPLC曲线（3∶1;参见20.000分钟时的峰值）。曲线3是上述提取物与紫杉酚标准样品1∶1混合物的HPLC曲线。
下面详述本发明。
Ⅰ.在来自紫杉属植物的外植体中诱导体细胞胚的发生
本发明基于这样的观察结果：来自紫杉属植物，尤其是短叶红豆杉的初级外植体和体外细胞培养物，能产生抑制体细胞胚发生的化合物。根据这一观察结果，可以推判，那是产生了含紫杉烷环的生物碱。因此，本发明提供了由紫杉属品种，尤其是短叶红豆杉的初级外植体诱导体细胞胚发生的方法（图3）。
具体地说，该方法包括以下步骤：在一种能促进体细胞胚发生的诱导的培养基上培养来自紫杉属植物的外植体;在培养期间将外植体转移到新的培养基上以除去培养的细胞上所产生的抑制剂;分离培养物中所产生的体细胞胚。
这里所用的“体细胞胚”是由具有沿着模拟种子内的合子胚胎的发育路线发育成植株的潜力的细胞或细胞群组成的。针叶树与大多数植物一样，其体细胞胚发生的细胞可以分成两个阶段（见图1）。第一阶段包括胚发生前的团块和早期成形的体细胞胚（见图1中第一阶段），第二阶段包括早期成形的胚进一步分化和发育成胚（阶段3-6）。胚发生前的团块是一种具有成为胚的潜力但缺乏明显的分生组织器官原基的细胞群。正是这些胚发育的不成熟的阶段，才使得只要将培养物保持在含有2，4-D和BA的培养基上即可进行增殖。
通过将胚发生的组织培养物转移到支持胚成熟的培养基上，使胚的发育沿与种子胚的类似的途径进行。该发育途径的各个阶段如图1所示。
在胚发生的最后阶段（阶段7），形成了成熟的子叶状的胚，它具有发育完好的伸长的双极结构，在一端包含潜在的分生组织和子叶原基，另一端则包含潜在的基团。这种胚里的细胞通常具有如下特征：含有储存蛋白质和脂类，而且细胞质浓稠。
胚发生的针叶树组织明显有别于愈伤组织细胞培养物，因此很多人认为不能称之为愈伤组织培养物。愈伤组织培养物被认为是一种未分化的细胞的无组织的生长体，这些细胞是不相边连接的或是松散连结的，且通常可以由培养各种外植体而产生。与胚发生的培养物中的细胞不同，愈伤组织细胞倾向于圆形、等径、高度液泡化，以及具有不稠的细胞质。愈伤组织细胞被认为是晚分化的或未分化的细胞，因为它是通过分化的植物外植体的快速细胞分裂而产生的。
另一方面，胚发生的组织是由（1）非常早期的胚的，（2）正处于产生早期胚状态的细胞（即，胚发生前的团块）的或（3）从早期的胚上脱落下来的胚柄细胞的团块组成。因此，该培养物具有自己的组织特点，而且在低倍显微镜下检查发现，它是由明显不同的类型的细胞和组织组成。
除了物理特性的不同之外，愈伤组织细胞与胚发生的细胞在生物化学和组织学水平上也不相同，上述不同可以由如下生化标记的差异看出：如乙烯增长速度、谷胱甘肽浓度、还原铁离子的能力，蛋白质合成速度以及质体结构（Wann等，Plant    Cell    Reports    6∶39-42（1987）;Wann等，Tree    3∶173-178（1989））。
在这里，“初级外植体”是指从植物上获得的任何组织或细胞。它包括但并不限于合子胚组织、根或芽的分生组织、以及形成层组织。最好的组织是从未成熟的假种皮获得的和由合子胚细胞、子叶细胞以及下胚轴细胞组成的组织。
任何紫杉属的品种均可用作外植体的来源。包括短叶红豆杉（T.brevifolina）、欧紫杉（T.baccata）、T.xmedia和硬尖红豆杉（T.cuspidata），但不局限于比。
培养之前，对外植体进行表面消毒，以杀灭可能存在于外植体表面的污染物，如细菌或真菌。最常采用的方法是将外植体浸入漂白粉和湿润剂（如Tween-20TM）的溶液中。这样浸泡一下既可以消毒外植体的表面，又不致于影响内在的细胞。为了帮助消毒剂渗入外植体表面可以在浸泡时抽真空。一旦得到外植体并经过消毒处理以后，就立即将其放入液体培养基中或放在固体培养基上。
一般，大多数经过证实的能有效诱导其它针叶树体细胞胚发生的植物生长培养基都可以用来由紫杉属的品种产生体细胞胚。这些培养基包括BLG（Wann等，Trees    3∶173-178（1989），在这里作为参考）、MS（Gupta等，Bio/Technology    5∶141（1987），在这里作为参考）、BMI（Krogstrup，Can.J.For.Res.16∶664-668（1986），在这里作为参考）、以及DCR（Gupta等，Plant    Cell.Rep.4∶177（1985），这里作为参考），但不局限于此。最理想的是含有植物激素2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、苄腺嘌呤（BA）和酪蛋白水解物的培养基。本领域熟练技术人员无须过多的实验即可轻易地改变这些培养基将其用于本发明。在下面所举的一个例子中，采用了BLG培养基。
在培养初级外植体时可以采用各种条件。根据植物品种的不同以及组织来源的不同，其温度和光照等条件也稍有不同。对短叶红豆杉来说，培养最好在黑暗中进行，温度在20-25℃之间。本领域技术人员可轻易地改变培养条件，以使细胞繁殖和胚胎发生同时达到最佳状态。
外植体在被诱导体细胞发生之前所需要培养的时间取决于外植体的来源、培养条件和转移频率。对于短叶红豆杉的未成熟的外植物体来说，以22℃、无光照的条件下于BLG-酪蛋白培养基中培养，每隔2-4周转移一次，大约6周之后便可诱导胚发生的组织。
在这里，“转移外植体”是指为外植体提供新鲜培养基的过程。转移可以有效地除去外植体上抑制胚发生的抑制剂，多种紫杉属的外植体都可分泌这种抑制剂。为了诱导和维持体细胞胚发生而要进行的这种转移，在针叶树中是独一无二的。
转移被培养的组织的方法要根据所用的培养基的类型而变化。当外植体保持在固体培养基上时，转移时是将外植体从老培养基上取出再放到新鲜培养基上。由生长中的紫杉属培养物产生的胚胎发生抑制剂不会在固体培养基中迅速扩散。因此，只需将培养的外植体转放到培养皿的新鲜表面上即可除去外植体上分泌的抑制剂。
从紫杉属的液体培养物中也可诱导体细胞胚的发生。通过过滤或沉淀可以从液体培养基中分离出胚发生的组织，以便为其更换新鲜培养基。或者采用连续流动系统给培养的组织提供新鲜培养基。在这种系统中，是将组织保持在这样的环境中：即，允许培养基在环境中流动，但限制培养的细胞流动（见图2a）。
转移的间隔时间根据外植体的来源、培养条件、培养基以及培养物中细胞浓度而变化。通常，当采用固体培养基时，每隔2-3周需做一次转移。本领域熟练技术人员仅通过肉眼观察体细胞胚的发生速率即可确定转移间隔时间。
一旦获得了发生体细胞胚的培养物，这种胚就能够成熟、分离并发芽生成幼苗。可以采用本领域任何已知的胚成熟方法。通常包括将胚发生的组织转移到渗透性提高了的且含脱落酸（ABA）的培养基上（Becwnar等，Tappi    Journal    70（4）∶155-160（1987））。
本发明还提供了培养的紫杉属胚发生的组织，这种组织是通过上述方法获得的。任何紫杉属胚品种都能用，其中包括短叶红豆杉、欧紫杉（T.baccata）.T.xmedia和硬尖红豆杉（T.cuspidata），但不局限于这些。
采用上述技术，可以用体细胞胚无性繁殖紫杉属植物。
如果需要某种植物的无性繁殖后代，那么就将这种植物用作初级外植体的来源。如上文所述，通过不断地培养转移，可以诱导初级外殖体体细胞胚的发生，由此所产生的胚可顺利地再生出全植株，而由此产生的植株就是由外殖体无性繁殖的后代（见Becwar等，Tapp：Journal    70（4）∶155-160（1987）;Durzan等，Plant    Science    52∶229-235（1987）;Krogstrup.等，Plant    Cell    Reports    7∶594-597（1988），这里引作参考）。
此外，上述方法还可用于繁殖该外植体源的变种的植物。
在这里，“变种”是指含有产生外植体的植物中所不具备的遗传变化的任何植物或组织。这种变化包括倍性水平的变化，特定DNA片段的序列的变化或外源DNA的导入。变种可以是组织培养过程中自然产生的，或者通过生化、物理或分子技术产生。
由于植物培养物倾向于遗传上不稳定，因此在延长培养中可产生自然发生的变种。可以对这种变种的生理学特征的变化进行试验，如加速了的生长，产生植物代谢或生物碱的能力，成倍性的变化。这种变种表现出较高的产生紫杉酚或紫杉酚前体的能力是理想的。一旦得到证实，即可分离这种变种的细胞，并将其用于生产无性繁殖的植株，这种植株具有较高含量的紫杉酚或紫杉酚前体（如前所述）。
除了自然出现的变种外，也可以通过本领域已知的多种方法产生变种。其中包括物理或化学诱变、原生质体融合或是直接用外源DNA转化，但不局限于这些方法。在体细胞胚发生开始之前可用以上方法在初级外植体中诱导变种，或是在用本发明方法所产生的体细胞胚中诱导变种。
物理或化学诱变需要在减数分裂和有丝分裂期间让培养的细胞或初级外植体接触能诱发DNA损坏或抑制染色体分离的媒体。这些媒体包括紫外线、甲基磺酸乙酯、氧化亚氮、吖淀橙、秋水仙素和亚硝基胍。这些媒体已被用于各种系统中使生物的DNA发生随机的变化，从而产生变种（Chaleff，R.S.Science    219∶676-682（1983））。
尽管突变位点和所产生的变种无法预先确定，但本领域熟练技术人员可以顺利地将已知的诱变和选择方法用于本发明的外植体和胚发生的培养物。
被诱变的细胞，可以就其在产生次级代谢物，如本发明中的含紫杉烷环的生物碱方面的变异进行筛选。这种突变型最好能大量产生含紫杉烷环的生物碱。检测含紫杉烷环化合物含量的方法包括HPLC（参见实施例），以及让培养基样品与对含紫杉烷环的生物碱有专一性的抗体发生免疫反应。参见Stephen    M.Edington，Bio/Technology9∶993-938（1991）。
原生质体融合可用于产生倍性增加的变种以及产生含有来自其它品种染色体的植物。例如，通过融合产生紫杉酚或紫杉酚前体的紫杉属品种和不产生上述物质的品种的原生质体，就可以产生出兼具两个品种特性的变种。
还可由导入外源DNA产生变种（Ellis等，International    Society    of    plant    Molecular    Biology，1991年10月6-11日会议，Tuscon，Arizona）。如前文所述，已有多种将DNA导入植物细胞的方法。其中包括来自根癌土壤杆菌（A.Tumefaciens）的遗传工程Ti质粒（Czako，M.等，Plant    Mol.Biol.6∶101-109（1986）;Jones，J.D.G.等，EMBOJ.4∶2411-2418（1985）;Feirer等，Proceedings    20th    Sonthern    Forest    Tree    Improvement    Conference，1989年，6月26-30日，Charlestown，South    Carolina，P381）;遗传工程的植物病毒，如花椰菜花叶病毒（Shah，D.M.等，Science    233∶478-481（1986）;Shewmaker，C.K.等，Virol.140∶281-288（1985））;将基因片段显微注射到植物细胞（Crossway，A.等，Molec.Gen.Genet.202∶179-185（1986）;Potrykus，I.等，Molec.Gen.Genet.199∶169-177（1985））;电激法（Fromm，M.E.等Nature    319∶791-793（1986）;Tautorus，T.E.等，Theor    Appl.Genet.78∶531-536（1989））;和DNA包覆粒子加速法（Bolik，M.等，Protoplasma162∶61-68（1991）），但并不局限于上述方法。
利用上述方法中的一种，本领域技术人员就能顺利生产出含有外源基因结构的变种。通过这种方式，就可以生产出具有预定特性，如抗菌能力的变种。本领域普通技术人员无须太多实验便可顺顺当当地筛选出这一特征。
Ⅱ.由胚发生的组织产生含紫杉烷环的生物碱
本发明的另一个实施例基于这样的观察结果：体外繁殖的紫杉属体细胞胚能产生含紫杉烷环的生物碱。这一发现是惊人的，因为紫杉酚通常存在于液泡中，而体细胞胚并无发达的液泡。而且也没料到能从这些生化上未成熟的细胞中获得象含紫杉烷环的生物碱这样的次级代谢物。利用这种体外培养物，现在可以大量生产含紫杉烷环的生物碱。另外，现在还可以大规模生产紫杉属幼苗并从中分离含紫杉烷环的生物碱。这一点之所以显得突出是因为幼苗是仅次于树皮的一个紫杉酚及其前体的来源（Vidensek，N.等，J.Natural    Prod.53∶1609-1610（1990））。
具体地说，可以从由紫杉属的外植体生成的体细胞胚的培养物中获得含紫杉烷环的生物碱，外植体的来源包括：短叶红豆杉（T.brevifolia）、欧紫杉（T.baccata）、T.xmedia和硬尖红豆杉（T.cuspidata）。
详细地说，外植体是由能产生所需的含紫杉烷环的生物碱的紫杉属品种获得。用前面所述的方法由该外植体生成含有体细胞胚的培养物。采用本领域众所周知的技术，如柱色谱法，可以从培养基或组织中分离出含紫杉烷环的生物碱（Wani等，J.Am.Chem.Soc.93∶2325（1971）;M.Boyd，Personal    Communication（1991年8月）;Witherup，K.M.等，J.Liq.Chromatgr.12∶2117-2132（1989））。图2b表示这样一个系统。
最好将经过高压灭菌的真菌细胞或提取物添加到培养基中，以促进含紫杉烷环的生物碱的产生。当把这种真菌细胞提取物添加到培养基中时，胚发生的组织活动，通过生成紫杉烷化合物以抵御假设的感染。
用来分离含紫杉烷环的生物碱的最佳的胚是第7阶段至发芽期的胚（图1）。处于第1和第2阶段的胚，虽然也可能含有含紫杉烷环的生物碱，但是难于将其从非胚发生的组织中分开或分离。而第7阶段的胚易于同非胚发生的组织分离，因而是理想的。本领域技术人员可利用已知方法顺利地分离胚，以便获得任何特定时期的胚用于生产含紫杉烷环的生物碱。
另一方面，由胚发生的培养物产生的充分发育的幼苗也可用作含紫杉烷环生物碱的来源。
可以从分批或连续更换下来的培养基中提取含紫杉烷环的生物碱。胚发生的培养物可以在自由的悬浮液中生长，或是固定在载体，如空心纤维上。Durzan等在Plant    Science    52∶229-235（1987）中提到了这样一些载体。
前面对本发明了做了概括性说明，参照下面的实施例将能更好理解本发明。这些实例是用于说明本发明的，并非用于限定保护范围。除非另有说明。本文所引用的全部专利和出版物在这里作为参考之用。
实施例
产生和保持紫杉属的胚发生的组织的方法以及随后的分析紫杉酚的方法
胚发生的紫杉属组织的产生和保持
在夏季（最好是7月）采集紫杉属树种的未成熟的假种皮，并通过与20%的家用漂白粉溶液（1.1%次氯酸钠）搅和30分钟来达到消毒，（每100ml消毒液）加几滴Tween20TM作为湿润剂。经用无菌水漂洗3次后，在无菌条件下将未成熟的胚从假种上切下来并水平地摆放在表1所示的培养基上。将培养物在22℃、黑暗中培养4周。在这一时期结束时，将外植体转移到新鲜培养基上，其实，只需将培养物转移到原培养皿上的新位点即可。再过2周（总共6周）之后，清点产生了胚发生的组织的培养物的数。胚发生的组织表现出胚发生的针叶树组织所具备的表型特征：半透明至白色、粘液状。
最常见的是，胚发生的组织发生于未成熟胚外植体的子叶或下胚轴区。将胚发生的组织用镊子从原始外植体上剔除，随后便可将其作为纯粹的胚发生的组织在与开始时相同的条件下，在相同的培养基上保持。通过每3周转移1次的方式将胚发生的组织连续保持下来。
由未成熟的紫杉属的胚产生胚发生的组织的频率以未成熟的短叶红豆杉（T.brevifolia）和种子群体作为特例（Corvalis，DR）进行说明（见表2）。正处于子叶形成期的胚产生胚发生的愈伤组织的频率比尚未发育到子叶期的幼胚的频率高（见图1）。包含有酪蛋白水解物（500ml/L）的培养基，不仅能提高子叶期胚胎的发生频率，而且使从幼胚产生胚发生的组织成为可能。
除短叶红豆杉以外的其它品种的培养物的胚发生的组织的发生频率示于表3中。这些品种包括欧紫杉（T.baccata）、T.xmedia和硬尖红豆杉（T.cuspidata）。
从胚发生的组织中提取和测定含紫杉烷环的生物碱
用一个改进的已知的方法（M.Boyd，Personal    Communication（1991年8月）分析胚发生的组织里的紫杉酚（Witherup，K.M.等，J.Liq.Chromotgr.12∶2117-2132，（1989））。简尔言之，将胚发生的紫杉属组织在Ten    Breock组织研磨器中用己烷匀浆。除去己烷，残留的植物组织用1∶1的二氯甲烷/甲醇抽提，室温下过夜。次日，将混合物过滤，并在氮气流中蒸发干燥。残余物用微量甲醇溶解，并分配于1∶1的二氯甲烷/水之间。弃掉水层，并将有机层蒸干。残余物用甲醇收集，并对其进行HPLC分析。
HPLC分析是用苯基键合的硅胶柱进行的，在异氰酸盐条件下实施，移动相是由甲醇∶乙腈∶50mM硫酸铵水溶液（20∶32∶48）组成的锾冲液，用乙酸将PH调至4.4。液速为1ml/min，流出物用波长228nm的光检测。
没有发现含有胚发生前团块的胚发生的组织和第一阶段的体细胞胚中产生紫杉酚。然而，观察到了几个吸收峰，峰的迁移证实它们是含紫杉烷的生物碱而不是紫杉酚。
这些结果通过多克隆抗体间接竞争抑制酶免疫测定得到了证实（CIEIA，Hawaii    Biotechnology    Group.Inc.）。
表1    用于胚发生的紫杉属组织培养物的培养基配方
成分    浓度(mg/L)
KNO3100
MgSO4.7H2O 320
KH2PO4170
CaCl2.2H2O 440
KCl    745
KI    0.83
H3BO36.2
MnSO4.H2O 16.9
ZnSO4.7H2O 8.6
Na2MoO4.2H2O 0.25
CuSO4.5H2O 0.025
CoCl2.6H2O 0.025
FeSO4.7H2O 27.8
Na2EDTA 37.3
肌醇    100
烟酸    0.5
吡哆醇    0.1
硫胺.HCL    0.1
蔗糖    20,000
谷酰胺    1,450
天门冬酰胺    100
2,4-D    2
苄腺嘌呤    1
细菌用琼酯    8,000
PH＝5.8
BLG    2/1培养基＝上述配方
BLCG2/1培养基＝上述配方+500mg/L酪蛋白水鲜物
表2
短叶红豆杉（T.brevifolia）的未成熟胚发育阶段体细胞胚发生的发生频率6周）
Figure 93104538X_IMG3
由液体培养基中培养的紫杉属的胚发生的组织培养物生产紫杉酚
从保持在由琼脂固化的上面刚叙述的BLG-酪蛋白培养基上的紫杉属物种的胚发生的培养物中未检测到紫杉酚。但是，当胚发生的组织在摇动（110转/分）的三角瓶中用相同配方的液体培养基培养时，在用过的培养基中测到了紫杉酚。胚发生的紫杉属组织的液体培养物是通过将生长在琼脂固化的培养基上的胚发生的组织的团块分散在少量的液体BLG-酪蛋白保持培养基中而产生的。在22℃、110转/分、在暗淡的荧光下（80英尺烛光）给以8小时光照的条件下，1-2月之后可得到由大小一致的组织团块构成的培养物。在获得由大小一致的组织团块构成的培养物之前，液体培养基要每10-21天换一次，所谓更换是滗去用过的培养基并添加等体积的新鲜培养基。
一旦得到分散良好的液体培养物，便可以下述方法生产紫杉酚。将培养物接种到新的培养基上，即：用移液管把一定体积的培养物移至新鲜培养基中，接种浓度为1份母液培养物接10份新鲜培养基。将培养物在上述条件下振荡培养，21天后收集用过的培养基。将用过的培养基在真空条件下浓缩、干燥，提取紫杉酚并进行HPLC检测（图4）。
如图4所示，曲线1显示紫杉属提取物含有若干个在与紫杉酚标准试样大致相同的地方洗脱的峰值。曲线2是表示紫杉属提取物与紫杉酚标准样品的3∶1混合物的分离的HPLC。可以看出，接近20.00分钟时洗脱的肩峰在尺寸上增大了。当分离1∶1的紫杉属提取物和紫杉酚标准样品混合物时，该肩峰进一步增大，从而证实了紫杉酚的存在。还证实了其它含紫杉烷环的化合物，如cephalomannine的存在。
至此已对本发明做了全面的说明，本领域技术人员可以想到，用很大范围内的任何等同的操作方式和不影响本发明或其实施例的其它参数均可实施本发明。

Claims (14)

1、一种由紫杉属的外植休生产含有体细胞胚的胚发生的组织的方法，包括以下步骤：
在一种培养基上培养紫杉属外植体；
在培养期间，不断将外植体转移到新鲜培养基上；以获得早期体细胞胚。
2、一种由紫杉属无性繁殖植株的方法，包括以下步骤：
在一种培养基中培养紫杉属外殖体;
在培养期间，不断将外植体转移到新鲜培养基上以获得早期胚;以及
将早期胚转移到一种能诱导小植株形成的培养基上。
3、一种由紫杉属胚发生的组织培养物生产含紫杉烷环的生物碱化合物的方法，包括以下步骤：
在一种培养基中，在能产生体细胞胚或体细胞幼苗的条件下培养紫杉属的外植体;
从所述胚或培养基中分离含紫杉烷环的生物碱化合物。
4、一种生产遗传上变异的紫杉属植物的方法，包括如下步骤：
在一种培养基中，在能产生体细胞胚的条件下培养紫杉属的外植体;
将DNA导入上述的胚中，以产生遗传上变异的胚;以及
由变异的胚再生植株。
5、一种生产遗传上变异的紫杉属植物的方法，包括以下步骤：
从紫杉属获取外植体;
将DNA导入外植体;
在一种培养基中，在能产生体细胞胚的条件下培养带有上述DNA的外植体，以及
由体细胞胚再生植株。
6、如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于外植体得自未成熟的假种皮。
7、如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于培养在黑暗中进行，而转移大约每2-3周进行一次。
8、如权利要求4或5所述的方法，其特征在于DNA是通过显微注射导入胚中的。
9、如权利要求4或5所述的方法，其特征在于DNA是由Ti质粒或其修饰体导入胚中的。
10、如权利要求4或5所述的方法，其特征在于DNA是通过电激法导入胚中的。
11、如权利要求4或5所述的方法，其特征在于DNA是通过粒子加速导入胚中的。
12、培养的紫杉属胚发生的组织。
13、如权利要求12所述的培养的胚发生的组织，其特征在于上述组织是从选自短叶红豆杉（T.brevifolia）、欧紫杉（T.baccata）、T.x  media和硬尖红豆杉（T.cuspidata）的植物上得到的。
14、一种生产紫杉属植物的、能产生较高含量的含紫杉烷环的生物碱的变种的方法，包括以下步骤：
在一种培养基中，在能产生体细胞胚的条件下培养紫杉属的外植体;
用一种可行的诱变剂诱导外植体发生突变;
筛选能产生较高含量的含紫杉烷环的生物碱的胚;以及
由选出的胚再生植株。
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