DE69231890T2

DE69231890T2 - Desikkation von gymnosperm somatischen embryonen

Info

Publication number: DE69231890T2
Application number: DE69231890T
Authority: DE
Inventors: Stephen M Attree; Lawrence C Fowke
Original assignee: University of Saskatchewan
Current assignee: University of Saskatchewan
Priority date: 1991-12-19
Filing date: 1992-12-18
Publication date: 2002-03-28
Anticipated expiration: 2012-12-19
Also published as: AU3154193A; NO942324D0; FI942909A; WO1993011660A2; US5985667A; NZ246137A; WO1993011660A3; US6372496B1; US5464769A; FI942909A0; NO942324L; CA2125410C; CA2125410A1; ATE202261T1; DE69231890D1; EP0618766A1; AU679435B2; EP0618766B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung von somatischen Embryonen, insbesondere Verfahren zur Reifung und zum Trocknen von somatischen Gymnospermenembryonen, und reife getrocknete und eingekapselte Embryonen, welche durch solche Verfahren erhalten werden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Somatische Embryogenese bietet das Potential zur Herstellung mittels Klonen von großen Zahlen an kostengünstigen Pflanzen vieler Spezies. Somatische Embryonen entwickeln sich ohne das umgebende Nährgewebe und die schützende Samenumhüllung, so dass die Forschung in beträchtlichem Maße dahingehend ausgerichtet wurde, die somatischen Embryonen dazu zu bringen, dass sie es Samen im Hinblick auf eine effiziente Lagerung und auf Handhabungsqualitäten gleichtun. Die Entwicklung von Techniken für eine somatische Embryogenese bei Koniferen hat in großem Maße die Fähigkeit zur Kultivierung von Koniferengeweben in vitro verbessert und bietet nun die Mittel zur Fortpflanzung durch Klonen von wirtschaftlich wertvollen Koniferen einer Anzahl von Spezies. Jedoch leiden alle Koniferenspezies unter einer geringen Pflanzenwachstumskraft.
Es wurde vorgeschlagen, Abscisinsäure (ABA) oder ein Osmotikum für eine Erhöhung des Speicherniveaus in Pflanzenzellen zu verwenden. Es wurde zum Beispiel aufgezeigt, dass somatische Embryonen von Theobroma cacoa zur Ansammlung von Fettsäuren induziert werden konnten, deren Zusammensetzung der von handelsüblicher Kakaobutter nahekommt, indem die Sucrosekonzentration des Kulturmediums erhöht wurde. Eine Modifizierung der Kulturbedingungen durch eine Variation der osmotischen Konzentration und/oder des ABA-Gehalts verbesserte gleichermaßen eine Lipidansammlung in somatischen und aus Mikrosporen entwickelten Embryonen von Brassica napus L. ebenso wie somatischen Embryonen von Karotten und Sellerie. Auch das Niveau von Speicherlipiden in somatischen Embryonen von P. abies wurde durch eine Optimierung des ABA-Niveaus auf zwischen 10-20 um verbessert, jedoch enthielten die somatischen Embryonen ungefähr 4% des Lipidniveaus, welches durch zygotische Embryonen erhalten wird.
Auch die Japanische Offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 1-218520 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von regenerativem Pflanzenkörpergewebe. Das Verfahren umfasst einen Schritt des Kultivierens eines regenerativen Pflanzenkörpergewebes in einem Medium, welches ABA enthält und einen osmotischen Druck von 180 bis 2500 besitzt. Um den osmotischen Druck innerhalb des spezifischen Bereichs zu steuern, wird eine nichttoxische Substanz wie Zucker, Alkohol, eine Aminosäure oder Glykol zugegeben.
Wasserentzug (Wasserstress) spielt eine bedeutende Rolle beim Halten von Embryonen in einem Reifestadium (Kermode, 1990, Crit. Res. Plant Sci., 9, 155-194). Viel mehr als ABA verhindert ein geringer Wassergehalt eine frühreife Keimung während späterer Entwicklungsstadien. Dies ist bedeutend, da eine frühreife Keimung von Embryonen während einer Entwicklung in Samen während einer Trocknung letal sein würde.
Ein herkömmlicher Weg zum Pflanzenzellenwachstum unter Wasserentzug in vitro ist eine Erhöhung der osmotischen Konzentration des Kulturmediums durch die Verwendung plasmolysierender Osmotika. Zum Beispiel wurden erhöhte Konzentrationen von plasmolysierenden Osmotika wie Sucrose verwendet, um eine Reifung von somatischen Embryonen vieler Pflanzenspezies zu unterstützen. Es zeigte sich, dass Sucrose bei Niveaus von bis zu 6% die Entwicklung von somatischen Embryonen bestimmter Koniferen verbessert, es wurde jedoch eine geringere Erhöhung der Sucrose von 1 bis 3% zuvor als optimal erachtet für die Reifung von somatischen Embryonen von Weißlichte und Norwegischer Fichte. Es scheint, dass eine höhere Konzentration im allgemeinen zu einer unterdrückten Embryoentwicklung führt. 3% Sucrose ist die Konzentration, die am häufigsten für eine Reifung von somatischen Embryonen von Koniferen verwendet wird. Mannitol besitzt einen ähnlichen Effekt hinsichtlich der Reifung von somatischen Embryonen von Koniferen (Roberts, 1991). Niedrige Niveaus an Mannitol (2-6%) führten zu einer Verdopplung der Anzahl an reifen Embryonen, die am Ende der Reifungsperiode gewonnen werden konnten; jedoch konnte die Behandlung lediglich als ein kurzer Impuls (1 Woche) angewendet werden, da eine längere Reifungsbehandlung mit Mannitol für eine weitere Embryoreifung nachteilig wurde.
Eine geringe Antwort bei einer Verwendung von Sucrose und Mannitol oder anderen einfachen Zuckern und Salzen mag davon herrühren, dass solche plasmolysierenden Osmotika durch den Symplast von Pflanzenzellen absorbiert werden. Eine derartige Absorption erleichtert ein Einstellen des osmotischen Potentials des Gewebes (osmotische Rückgewinnung) ohne den Wassergehalt des Gewebes zu verringern. Aufgrund einer Verwendung des gelösten Stoffs oder seiner toxischen Wirkungen können zusätzlich direkte oder indirekte metabolische Effekte bei spezifischen Pflanzenmetaboliten auftreten.
Alternativen zu plasmolysierenden Osmotika sind nichteindringende Verbindungen mit hohem Molekulargewicht wie Polyethylenglykol (PEG) oder Dextran. Diese Verbindungen sind für gewöhnlich in einem weiten Bereich von Molekulargewichten verfügbar. Zum Beispiel ist PEG in Molekulargewichten verfügbar, die von 200 bis 35.000 reichen. Es würden jedoch lediglich solche mit einem Molekulargewicht von über 1000 bis 3000 nichteindringend sein (Carpita et al., 1979). Dies rührt daher, dass die große Molekulargröße dieser gelösten Stoffe deren Durchgang durch Pflanzenzellwände ausschließt, so dass ein Eintritt in die Zellen und eine Plasmolyse verhindert wird, während dennoch Wasser entfernt wird. Folglich verringert deren nichtplasmolysierende Wirkung den Wassergehalt des Gewebes auf eine ähnliche Weise wie die Wirkungen von Wasserentzug, die bei Zellen oder Pflanzen beobachtet werden, welche Bedingungen einer Trockenheit ausgesetzt werden. Die Wirkung ist konstant, und der Turgor der Zelle kann lediglich durch Zellen wiederhergestellt werden, welche aktiv ihre Konzentration an gelösten Stoffen erhöhen. PEG wurde am üblichsten verwendet, um einen Wasserentzug auf die gesamten Pflanzen anzuwenden, um die gesamten Samen auf eine Synchronisierung der Keimung und eine Verbesserung der Wachstumskraft des Saatguts vorzubereiten.
Eine Embryotrocknung findet auf natürliche Weise bei den meisten Samen statt und hat eine maßgebende Rolle bei dem Entwicklungsübergang zwischen Reifung und Keimung. Somit führt eine Trocknung zu einer verbesserten Keimung von sowohl zygotischen als auch somatischen Embryonen. Eine Trocknung der gesamten somatischen Embryonen ist ebenfalls ein alternatives Verfahren der Keimplasmaspeicherung. Somatische Embryonen, welche über das ganze Jahr hinweg kontinuierlich erzeugt werden, könnten daher getrocknet und bis zur geeigneten Pflanzungssaison gelagert werden oder zu neuen Orten transportiert werden.
Eine beträchtliche Menge an Referenzen des Stands der Technik beschreibt Verfahren zur Trocknung von somatischen Angiospermenembryonen. Senaratna et al. beschreiben in der Anmeldung EP 0300730 ein Verfahren, durch welches in vitro geformte Pflanzenembryonen getrocknet werden, gefolgt von der Anwendung von ABA oder anderen Arten an Umweltstress, welche eine Trocknungsresistenz induzieren. Die Angiospermenembryonen werden im torpedoförmigen Stadium während einer ausreichenden Zeit mit der ABA-Quelle induziert, so dass eine Ausprägung einer Trocknungsresistenz bewirkt wird. Die induzierten Embryonen werden dann getrocknet, um stabile, lebensfähige künstliche Samen zur Verfügung zu stellen. In EP 0300730 betonen Senaratna et al. die Bedeutung einer Stimulierung des Embryos in geeignetem Zustand durch die Verwendung von Signalen zur Entwicklung einer Resistenz gegenüber Trocknung. Es wird behauptet, dass, wenn die Signale im falschen Entwicklungszustand gegeben werden, das Gewebe nicht geeignet reagieren wird. Angiospermenembryonen können in Abwesenheit von ABA einer Reifung unterliegen, und es wird vorgeschlagen, dass ABA so spät als möglich während des Reifungsprotokolls zugeführt und während eines relativ kurzen Zeitraums angewendet wird. Somit scheint der Zeitpunkt und die Zeitdauer der ABA-Anwendung kritisch zu sein.
Die Japanische Offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 2-31624 offenbart die Verwendung von ABA in Pflanzenkulturen. ABA wird als Teil eines Verfahrens zur Trocknung von Embryonen vor einer Lagerung verwendet.
In der PCT-Anmeldung Nr. WO 89/05575 ist ein Verfahren zur Herstellung von synthetischen Samen beschrieben, welches dehydratisierte somatische Embryonen umfasst. Das Verfahren, welches auf einkeimblättrige und zweikeimblättrige Embryonen anwendbar ist, umfasst das Halten der somatischen Embryonen in einer Atmosphäre mit einer relativen Feuchtigkeit (r. h.) von ungefähr 30 bis ungefähr 85% während eines Zeitraums, der ausreichend ist, um den Feuchtigkeitsgehalt der Embryonen von ungefähr 85 bis 65% auf ungefähr 4 bis 15% zu verringern. Die Verwendung von osmotisch aktiven Materialien wird vorgeschlagen, sobald die Embryonen gereift sind.
In Plant Science, 65, 1989, S. 253-259 beschreiben Senaratna et al. die Induktion einer Trocknungsresistenz in somatischen Alfalfaembryonen durch eine exogene Verabreichung von ABA in der Form von kurzen Pulsen. Die Embryonen werden dann auf 10 bis 15% ihres Feuchtigkeitsgehalts getrocknet und während mindestens 3 Wochen in dem trockenen Zustand gelagert. Senaratna et al. beschreiben auch ein Verfahren, durch welches eine Resistenz gegenüber Trocknung induziert wird, indem die somatischen Embryonen vor einer Trocknung subletalen Niveaus an niedriger Temperatur, Wasser, Nahrungsmittel oder Wärmestress ausgesetzt werden. Es wurde jedoch dargelegt, dass einige dieser Stressvorbehandlungen nachteilige Auswirkungen auf eine Embryonenreifung und Lebensfähigkeit des Saatguts besitzen.
Somit zeigt die Literatur des Stands der Technik bei somatischen Embryonen und künstlichen Samen, dass eine Trocknungsresistenz bei einigen angiospermen Pflanzenspezies wie Alfalfa, Geranien, Sellerie, Kohl, Karotten, Getreide, Salat, Bandgras (orchardgrass) und Sojabohnen erreicht wurde. Es wurden zahlreiche Verfahren vorgeschlagen, welche sich scheinbar alle entwickelt haben aus einem Fördern einer Trocknungsresistenz durch eine Verabreichung von ABA und anderen Stressfaktoren in einem späten Zustand der Reifung und einem anschließenden Reduzieren des Wassergehalts der Embryonen. Jedoch wurde derzeit ein Überleben nach einem Trocknen von somatischen Koniferenembryonen nicht berichtet, da diese Methoden nicht auf Koniferen anwendbar sind.
Die Erzeugung von künstlichen Samen, in welchen somatische Embryonen in einem hydratisierten Gel eingekapselt sind, wurde ebenfalls beschrieben. Die eingekapselten Embryonen können dann unter Verwendung herkömmlicher Sämaschinen gepflanzt werden. Der Hauptnachteil eines Einkapselns in einem hydratisierten Gel liegt in der Tatsache, dass lediglich eine begrenzte Lagerungsdauer ermöglicht wird. Es folgen Beispiele von hydratisierten Gelen für ein Einkapseln.
Die Japanische Offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 2-46240 offenbart ein Verfahren, durch welches eine sauerstoffliefernde Substanz zum Umhüllen eines Pflanzenembryos verwendet wird. Das Dokument betrifft auch die mögliche Verwendung einer wasserlöslichen polymeren Substanz zusammen mit der sauerstoffliefernden Verbindung. Bevorzugte sauerstoffliefernde Verbindungen sind Calciumperchlorat oder Bariumperchlorat. Die wasserlöslichen polymeren Substanzen werden angegeben als hydratisierte Gele von Natriumalginat, Gelatine, Mannan, Polyacrylamid und Carboxymethylcellulose.
In der Japanischen Offengelegten Anmeldung Nr. 63-133904 wird ein Verfahren zum Beschichten von Pflanzenembryonen und Nährstoffen mit einer wasserlöslichen polymeren Substanz wie Alginsäure und Polyacrylamid beschrieben. Als ein Beispiel für eine polymere Substanz wird Polyethylenglykol erwähnt, welches zusammen mit den wasserlöslichen polymeren Substanzen verwendet werden kann.
Die Japanische Offengelegte Patentanmeldung Nr. 61-40708 beschreibt eine Technik, durch welche ein Embryo mit Nährstoffen, einem antibakteriellen Mittel und einer wasserlöslichen polymeren Substanz, welche vernetztes Polyethylenglykol einschließen kann, eingekapselt wird. Es ist scheinbar die Rolle des wasserlöslichen Polymeren, die Feuchtigkeit während der Lagerung des eingekapselten Embryos aufrechtzuerhalten.
Im US-Patent 4,615,141 beschreiben Janick und Kitto ein Verfahren zum Einkapseln von asexuellen Pflanzenembryonen. In diesem Verfahren werden die Embryonen vorbehandelt durch ein Erhöhen der Sucrosekonzentration des Aufbewahrungsmediums von normalen Niveaus zu hohen Niveaus oder durch Anwendung von ABA. Die hydratisierten Embryonen werden dann in einem hydratisierten Beschichtungsmaterial eingekapselt. Das Beschichtungsmaterial trocknet unter Ausbildung eines dünnen nichttoxischen Films, welcher einen oder mehrere Embryonen einschließt, die Embryonen während der Lagerung schützt, sich jedoch in einer wässrigen Lösung einfach wieder auflöst. Es wird angenommen, dass die Verwendung von ABA und erhöhter Sucrose das Überleben der eingekapselten Embryonen verbessert. Sobald die Embryonen eingekapselt sind, werden sie während eines Zeitraums von mindestens 5 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 30ºC getrocknet.
In dem US-Patent 4,777,762 beschreiben Redenbaugh et al. ein Verfahren zur Herstellung von getrockneten Analogen von botanischen Samen, welche erzeugt wurden durch Entfernen eines Teils des Wassers durch ein langsames oder schnelles Trocknen, so dass das Pflanzengewebe nicht länger mit Wasser gesättigt ist. Das Verfahren beinhaltet auch ein Einkapseln von meristematischem Gewebe in einem hydratisierten Gel oder Polymer und Entfernen von Wasser durch langsames oder schnelles Trocknen. Die Bildung von somatischen Embryonen wird induziert und die Embryonen werden dann in dem Gel oder Polymer eingekapselt, gefolgt von einem Trocknen. Alternativ dazu werden die somatischen Embryonen auf weniger als eine vollständige Gewebesättigung während oder am Ende der Embryonenentwicklung getrocknet und dann eingekapselt.
Wenn die oben beschriebenen Gele zum Einkapseln der somatischen Embryonen entweder vor oder nach einem Dehydrieren verwendet werden, werden bevorzugte Gele aus Hydrogelen oder Polymeren ausgewählt, welche Wasser innerhalb der Grenzen der Gelmatrix enthalten, welche jedoch getrocknet werden können, wenn das Pflanzengewebe getrocknet wird. Einer der Nachteile eines solchen Verfahrens ist es, dass es schwierig ist, ein kontrolliertes Trocknen der eingekapselten Embryonen zu erreichen. In den meisten Fällen ist ein doppeltes Trocknen von Embryonen notwendig. Somit werden getrocknete Embryonen in dem Hydrogel eingekapselt, was zu einer Rehydratisierung führt, dann werden die Embryonen erneut getrocknet. Kürzlich veröffentlichte Daten zeigen auf, dass somatische Embryonen, welche in hydratisiertem Gel eingekapselt sind, ohne einem Trocknen eine Lagerungsdauer besitzen, die auf wenige Monate beschränkt ist, sogar wenn auf die obigen Gefriertemperaturen gekühlt wird.
In einem Übersichtsartikel von 1991 betreffend somatische Embryogenese und Entwicklung einer Technologie für synthetische Samen (Critical Reviews in Plant Sciences, 10, 33-61, 1991) erwähnten Gray et al., dass eine Technologie für synthetische Samen für die auf Waldprodukte ausgerichtete Industrie extrem nützlich wäre. Dies rührt daher, dass Waldfichten lediglich aus natürlichen Samen wirtschaftlich fortgepflanzt werden können und da eine Verbesserung über ein herkömmliches Aufziehen aufgrund des langen Lebenszyklus von Koniferen extrem zeitaufwendig ist.
Es bildete sich ein Trend hinsichtlich der Verwendung von zunehmend höheren Konzentrationen an ABA zur Förderung der Reifung von somatischen Koniferenembryonen. Dieser Trend resultiert wahrscheinlich aus einer Notwendigkeit zur Inhibierung einer frühreifen Keimung, welche in der Folge der verwendeten zunehmend längeren Reifungszeiten häufiger aufgetreten ist. Somit wurde ABA zuerst erfolglich verwendet von Hakman und von Arnold, 1988 (Physiol. Plant., 72, 579-587) und von Arnold und Hakman, 1988 (J. Plant Physiol., 132, 164-169) mit 7,6 uM. Anschließend fanden Dunstan et al., 1988 (Plant Sci., 58, 77-84), dass 12 uM an ABA besser seien. Kurz danach berichteten Attree et al., 1990 (Can. J. Bot., 68, 2583-2589), dass 16 mm optimal waren. Roberts et al., 1990 (Physiologia Plantarum, 78, 355-360) zeigten auf, dass für einige Spezies von Fichten 30-40 mm an ABA verwendet werden konnten, um eine Reifung zu unterstützen und reife Embryonen mit Speicherprotein-Polypeptiden zu ergeben, welche vergleichbar mit zygotischen Embryonen sind. Solche hohen Niveaus waren notwendig, um eine frühreife Keimung zu verhindern und um zu ermöglichen, dass die Reifung fortschreitet. Dunstan et al., 1991 (Plant Sci., 76, 219-228) fanden gleichermaßen heraus, dass hohe Niveaus eine Embryoreifung ermöglichen konnten. Unglücklicherweise erhöhen hohe Niveaus an ABA auch die Häufigkeit von hinsichtlich der Entwicklung abnormalen Embryonen. In den Koniferen betreffenden obigen Berichten war mit dem ABA ein erhöhtes Osmotikum nicht mit inbegriffen.
Somatische Koniferenembryonen scheinen verschieden zu sein zu somatischen Embryonen von einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Angiospermenspezies dahingehend, dass ABA so früh als möglich in den Reifungsprotokollen zugeführt werden sollte, um eine Embryonenreifung zu unterstützen. Lediglich eine Verringerung oder Eliminierung von Auxin- und Cytokinin-Niveaus, wie sie für eine Reifung von somatischen Embryonen von vielen Angiospermenspezies erfolgreich war (Ammirato, 1983, Handbook of Plant Cell Culture, Bd. 1, S. 82-123), führte zu einer seltenen oder geringen Reifung bei Koniferenembryonen und resultierte öfter in einer Braunverfärbung und einem Absterben der unreifen somatischen Embryonen. Ferner scheint es so zu sein, dass ABA über längere Zeiträume und bei höheren Niveaus verabreicht werden sollte, als allgemein für somatische Angiospermenembryonen angewendet.
Im US-Patent 5,036,382 beschrieben Gupta et al. ein Verfahren zur Entwicklung von Gewebekultur-induzierten somatischen Koniferenembryonen zu gut entwickelten Kotyledonarembryonen. Das Verfahren umfasst einen mehrstufigen Kultivierungsprozess, in welchem Embryonen eines frühen Stadiums kultiviert werden auf einem Medium eines späteren Stadiums, welches ein signifikant höheres osmotisches Potential zusammen mit ABA und einem Absorptionsmaterial umfasst, um allmählich das Niveau von verfügbarer ABA über die Zeit zu verringern. Ein kritischer Aspekt dieses Verfahrens liegt in dem Miteinbeziehen des Absorptionsmaterials in das Entwicklungsmedium des Embryos. Vorgeschlagene Absorptionsmaterialien umfassen Aktivkohle und Silicate. Das Absorptionsmittel wird verwendet, um die ABA langsam zu reduzieren und um metabolische Abfallprodukte zu entfernen.
Das Verfahren schlägt auch die Verwendung von Osmotika vor, um das osmotische Potential zu steuern. Ein bevorzugtes vorgeschlagenes Osmotikum ist Sucrose in Mengen im Bereich von 2 bis 3%. Ein anderes Osmotikum, das von. Gupta et al. vorgeschlagen wurde, ist PEG. Gupta et al. erwähnten, dass PEG 8000 untersucht wurde und sich als ein hervorragendes Osmotikum erwies, wobei angegeben wurde, dass die Gründe für dessen hervorragende Leistung im Vergleich mit anderen Materialien nicht vollständig klar sind. Gupta et al. brachten auch vor, dass Polyethylen- oder Polypropylenglykole mit anderen Molekulargewichten als gleichermaßen brauchbar erachtet werden. Gemäß dem US-Patent 5,036,007 wird die Kombination von Osmotika an bestimmten Punkten während des Entwicklungsstadiums modifiziert. In der Tat wird die osmotische Konzentration während der Entwickung allmählich erhöht.
In den US-Patenten 4,957,866 und 5,041,832 beschreiben Gupta et al. ein Verfahren zur Reproduktion von Koniferen mittels somatischer Embryogenese unter Verwendung von Pflanzengewebekulturtechniken. Das Verfahren besteht aus einem Plazieren von somatischen Koniferenembryonen in einem Reifungsmedium, welches anfänglich kein ABA und eine niedrige Konzentration an Osmotikum umfasst. Es wird dann ABA zugegeben und die Niveaus an Osmotikum werden für das letzte Stadium der Entwicklung erhöht. Die von Gupta et al. vorgeschlagenen Osmotika sind Zucker wie Sucrose, myo-Inositol, Sorbitol und Mannitol.
Im US-Patent 5,034,326 beschreiben Pulman et al. ein Verfahren zur Reproduktion von Koniferen mittels somatischer Embryogenese unter Verwendung von Adsorptionsmaterialien im Medium des Entwicklungsstadiums. Das Adsorptionsmaterial (Aktivkohle ist eine bevorzugte Ausführungsform) wird verwendet, um die Konzentration an ABA, die in dem im Entwicklungszustand verwendeten Medium vorhanden ist, allmählich zu reduzieren. Der Zweck dieser Reduktion hinsichtlich ABA ist es, der natürlichen Tendenz bei der Embryonenentwicklung zu folgen. Wenn sich die Entwicklung dem Ende nähert, ist das Vorkommen von geringeren Mengen an ABA erforderlich.
In der PCT-Anmeldung WO 91/01629 beschreibt Roberts ein Verfahren zur Unterstützung einer Keimung von somatischen Fichtenembryonen, welches ein teilweises Trocknen des Embryos bei Feuchtigkeiten von weniger als ungefähr 99,9% umfasst. Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zum Differenzieren von somatischen Embryonen von Koniferen, welches ein In-Kontakt-Bringen von embryonalen Kallussen mit einem Medium, welches ABA enthält, umfasst. Roberts schlägt auch vor, dass ein Medium mit einer Sucrosekonzentration von 2 oder 3, 4%, welches zwischen den Reifungsbehandlungen und dem Keimmedium verwendet wird, eine Wurzel- und Sprossverlängerung fördert. Roberts erwähnt, dass der Feuchtigkeitsbereich, der für ein teilweises Trocknen von somatischen Embryonen ohne einer letalen Wirkung verwendet werden kann, ungefähr 85 bis 99,9% beträgt, was zu einem lediglich sehr geringen Feuchtigkeitsverlust (5-10%) führt.
In einer im Can. J. Bot., Bd. 68, 1990, S. 1086-1090 veröffentlichten Studie erwähnen Roberts et al., dass somatische Koniferenembryonen (interior spruce) eine Trocknung bei Raumfeuchtigkeit nicht überleben, dass jedoch eine teilweise Trocknung bei einer sehr hohen Feuchtigkeit eine Keimung bis zu 90% fördert. Robert et al. verweisen auch auf die Tatsache, dass ein Trocknen von Embryonen über einen Bereich der relativen Feuchtigkeit anzeigte, dass eine relative Feuchtigkeit von 81% oder weniger für Koniferenembryonen letal war. Dies ist ferner ersichtlich aus Tabelle 3 des Berichts, wo die Wirkungen einer teilweisen Trocknung bei verschiedenen relativen Feuchtigkeiten auf die Keimung aufgezeigt sind. Es ist zu sehen, dass sehr geringe Niveaus an Keimung erhalten werden infolge einer Trocknung bei einer relativen Feuchtigkeit von 90% und dass keine Keimung beobachtet wird, wenn relative Feuchtigkeiten von 81% und 75% verwendet werden. Basierend auf diesen Ergebnissen schlussfolgerte Roberts, dass lediglich ein mildes Trocknen der somatischen Embryonen möglich war, um eine normale Keimung zu ermöglichen, und dass die somatischen Fichtenembryonen eine Trocknung zu zygotischen Niveaus nicht tolerierten. Somatische Fichtenembryonen überlebten und unterlagen einer verbesserten Wachstumskraft infolge einer teilweisen Trocknungsbehandlung in einer Umgebung von sehr hoher Feuchtigkeit (über 95% Feuchtigkeit), während welcher Zeit lediglich 5% der Feuchtigkeit entfernt wurden.
Später betonten Roberts et al. (J. Plant Physiol., 138, S. 1-6, 1991), dass somatische Embryonen aus einer Anzahl von Spezies, einschließlich Fichte, empfindlich gegenüber einem deutlichen Wasserverlust sind und ein verringertes Überleben in der Folge einer Trocknung aufzeigen. In diesem Bericht zeigte Roberts auf, dass somatische Embryonen der Sitka-Fichte eine Trocknung nicht überlebten, sogar obwohl mit hoher Häufigkeit eine synchronisierte Keimung erhalten werden konnte in der Folge einer teilweisen Trocknung der Embryonen.
Somit wurde trotz Versuche zur Trocknung von somatischen Koniferenembryonen in der Folge einer ABA-Reifung ein Überleben nicht beschrieben.
Eine Trocknung von somatischen Koniferenembryonen wäre wünschenswert, um es zu ermöglichen, somatische Embryonen über lange Zeiträume zu lagern. Lagerungszeiten von getrockneten Embryonen können durch Lagern von gefrorenen Embryonen weiter verlängert werden. Die Fähigkeit zum Überleben einer verlängerten Lagerung ist bedeutend im Hinblick auf die langen Lebenszyklen von Koniferen und die langen Zeiträume, die erforderlich sind, um in vitro erzeugte Bäume zu evaluieren. Dies wäre dann ein alternatives Verfahren zur Keimplasmalagerung, von welcher somatische Embryonen später reinduziert werden könnten. Gewebe, welche in der Lage sind, ein Einfrieren in flüssigem Stickstoff zu überleben, werden als fähig erachtet, eine nachfolgende Lagerung über einen unbegrenzten Zeitraum zu überleben.
Für nahezu alle Pflanzenspezies sind in vitro-Techniken teurer im Vergleich mit herkömmlichen Methoden des Aussäens. Somatische Embryonen benötigen für gewöhnlich auch eine Vorkeimung und eine Gewächshausakklimatisierung vor einem Auspflanzen ins Feld. Zur Überwindung dieser Probleme wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen.
Fluiddrillen wurde für vorgekeimte Samen verwendet. Jedoch erfordert das Fluiddrillen neue Pflanzungstechniken, spezialisierte Maschinen und ermöglicht keine Präzision beim Pflanzen von Embryonen oder Sämlingen.
Schließlich würde der Stand der Technik offensichtlich vorschlagen, dass derzeit verfügbare Techniken beim Zur-Verfügung-Stellen von starken somatischen Koniferenembryonen und getrockneten somatischen Koniferenembryonen, welche für eine Einkapselung geeignet sind, versagt haben. Somatische Koniferenembryonen benötigen besondere Pflanzenwachstumsregulatorbedingungen, um sich zu entwickeln, und folgen nicht dem Entwicklungsmuster der fortgeschritteneren Angiospermen. Ferner wurde aufgezeigt, dass eindringende Osmotika sich als nachteilig im Hinblick auf späte Embryostadien erwiesen. Daher ist ein Anwenden von kurzzeitigen ABA-Behandlungen und osmotischen Behandlungen in der späten Embryoentwicklung zum Erreichen einer Trocknungsresistenz für Koniferen nicht durchführbar und es sind andere Verfahren erforderlich.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden lebensfähige reife trocknungsresistente somatische Gymnospermenembryonen mit einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 55% zur Verfügung gestellt. Die trocknungsresistenten Embryonen besitzen ein Trockengewicht und einen Lipidgehalt pro Embryo, welche ungefähr gleich oder höher sind als der Lipidgehalt und das Trockengewicht von entsprechenden zygotischen Embryonen. Die reifen somatischen Embryonen der vorliegenden Erfindung besitzen vorzugsweise wesentlich höhere Mengen an Speicherreserven als deren zygotische Gegenstücke. Wenn hierin verwendet, ist es beabsichtigt, dass der Begriff "Speicherreserven" Kohlehydrate, Proteine und Lipide bezeichnet, welche von einem reifen Embryo für eine Verwendung während des Wachstums nach einer Keimung abgelagert werden.
Die reifen somatischen Gymnospermenembryonen der Erfindung besitzen einen Feuchtigkeitsgehalt, der signifikant niedriger ist (mindestens ungefähr 5% niedriger) als der Feuchtigkeitsgehalt von entsprechenden reifen zygotischen Gymnospermenembryonen von imbibiertem Samen, welcher für gewöhnlich größer als 60% ist. Die "sanft getrockneten" Embryonen (trocknungsresistente Embryonen) sind dadurch charakterisiert, dass sie einen Feuchtigkeitsgehalt von gleich oder weniger als ungefähr 55% besitzen und in der Lage sind, einer Trocknung zu niedrigeren Feuchtigkeitsgehalten standzuhalten (und werden somit als "trocknungsresistent" bezeichnet). Die trocknungsresistenten Embryonen der Erfindung können dann weiter getrocknet werden, was zu "stark getrockneten" Embryonen führt, welche entweder einen Feuchtigkeitsgehalt besitzen, der gleich oder geringer als der Feuchtigkeitsgehalt von entsprechenden zygotischen Embryonen ist, oder in ausreichendem Maße frei von freiem ungebundenem Wasser sind, um ein Einfrieren zu überleben. Für gewöhnlich reichen Wassergehalte für "stark getrocknete" Embryonen von ungefähr 10% bis ungefähr 36%.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Entwicklung von somatischen Gymnospermenembryonen, umfassend ein Kultivieren von ausgewählten unreifen somatischen Gymnospermenembryonen in einem Medium, welches mindestens ein nichteindringendes wasserentziehendes Mittel, eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle und einen Pflanzenwachstumsregulator mit einem Einfluss auf eine Embryonenentwickung, wie Abscisinsäure und/oder analoge Verbindungen, Vorstufen oder Derivate davon, umfasst, wobei die Embryonen während eines Zeitraums einem Wasserentzug ausgesetzt werden, der ausreicht, um den Feuchtigkeitsgehalt der Embryonen auf weniger als ungefähr 55% zu reduzieren und um somit die Embryonen gegenüber einer weiteren Trocknung resistent zu machen, wodurch lebensfähige reife trocknungsresistente somatische Gymnospermenembryonen erzeugt werden. Die Embryonen werden vorzugsweise während eines Zeitraums einem Wasserentzug ausgesetzt, der ausreicht, um sanft getrocknete reife somatische Gymnospermenembryonen zu ergeben, welche einen Feuchtigkeitsgehalt besitzen, der von ungefähr 60 Gew.-% auf ungefähr 32-55 Gew.-% reduziert wurde. Solche Embryonen können vorteilhafterweise einen Lipidgehalt pro Embryo und ein Trockengewicht besitzen, welche höher sind als der Lipidgehalt pro Embryo und das Trockengewicht von entsprechenden zygotischen Gymnospermenembryonen. Bevorzugte somatische Gymnospermenembryonen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, umfassen somatische Koniferenembryonen.
Wenn einmal die trocknungsresistenten ("sanft getrockneten") reifen somatischen Embryonen mit reduziertem Feuchtigkeitsgehalt erhalten worden sind, erreicht eine zweite Trocknungsbehandlung niedrigere Feuchtigkeitsniveaus, wenn es wünschenswert ist, die Embryonen weiter zu trocknen. Dies kann bestehen aus entweder einem Unterziehen der sanft getrockneten Embryonen einem weiteren osmotischen Stress durch Erhöhen der Konzentration des nichteindringenden wasserentziehenden Mittels, das in dem Medium vorhanden ist, oder durch Trocknen der Embryonen, indem diese zumindest einer Umgebung von niedriger relativer Feuchte ausgesetzt werden, um getrocknete somatische Embryonen zu ergeben, welche einen Feuchtigkeitsgehalt besitzen, der wesentlich niedriger sein kann als der Feuchtigkeitsgehalt von entsprechenden zygotischen Embryonen. Bevorzugte Feuchtigkeitsgehalte liegen zwischen 10 und 36 Gew.-%. Eine starke Trocknung durch Trocknen kann erreicht werden entweder durch ein schnelles Trocknen oder langsame Trocknungsbehandlungen, bei welchen die Embryonen einer Reihe von abnehmenden relativen Feuchtigkeiten ausgesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden die Embryonen nach einem Trocknen eingekapselt. Das Verfahren umfasst ein Beschichten der Embryonen mit einer nichthydratisierten wasserlöslichen Verbindung, welche einen Schmelzpunkt im Bereich zwischen 20 und 70ºC besitzt. Die Verbindung wird dann verfestigt, um ausgehärtete Kapseln zu ergeben, welche den Embryo enthalten. Dies ergibt beschichtete Embryonen mit einer erhöhten Resistenz gegenüber Angriffen von Organismen wie Pilzen und Bakterien und tierischen Schädlingen.
Bevorzugte getrocknete somatische Gymnospermenembryonen, welche innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen, sind dadurch charakterisiert, dass sie einen Feuchtigkeitsgehalt von 10 und 36 Gew.-%, ein Trockengewicht zwischen 30 und 600% höher als dieser entsprechende getrocknete zygotische Embryo, ein Speicherlipid zwischen 50 und 700% höher als dieser entsprechende zygotische Embryo besitzen. Die getrockneten Embryonen der vorliegenden Erfindung können bei Raumtemperatur oder eingefroren im Kühlschrank oder in flüssigem Stickstoff entweder vor oder nach einer Einkapselung gelagert werden.
Die vorliegende Erfindung besitzt den Vorteil von erhöhten Ausbeuten an reifen Embryonen und von einem Zur- Verfügung-Stellen einer weiteren Reifung zu somatischen Embryonen, was wiederum die Wachstumskraft der gekeimten Pflänzchen verbessert. Die verbesserten Reifungs- und Trocknungsverfahren der vorliegenden Erfindung stellen auch eine Erhöhung der Menge an Speicherreserven der reifen oder getrockneten somatischen Embryonen zur Verfügung. Die Tatsache, dass der Wassergehalt der stark getrockneten Embryonen auf ein niedrigeres Niveau als das von reifen trockenen Samen verringert ist, verbessert eine Embryonengualität und Langzeitlagerung. In der Tat kann gemäß der Erfindung der Wassergehalt in ausreichendem Maße reduziert werden, so dass die stark getrockneten Embryonen über längere Zeiträume in gefrorenem Zustand ohne einer Schädigung aufgrund einer Eisbildung gelagert werden können.
Ferner ermöglichen die Verringerungen des Wassergehalts eine Langzeitlagerung von Keimbahnen ohne einer Notwendigkeit für eine komplexe Tieftemperaturkonservierungsausrüstung, wodurch aus gelagerten reifen somatischen Embryonen eine somatische Embryogenese wiedererlangt werden kann. Auch ermöglicht ein Einkapseln der getrockneten Embryonen der vorliegenden Erfindung in einem nichthydratisierten Polymer eine maschinelle Handhabung der beschichteten Embryonen, da der Polymerüberzug die Beständigkeit gegenüber Erschütterung verbessert.
Einer der wichtigen Aspekte der vorliegenden Erfindung liegt in der kombinierten Verwendung eines nichteindringenden wasserentziehenden Mittels und eines Pflanzenwachstumsregulators mit einem Einfluss auf eine Embryonenentwicklung wie ABA und/oder analoge Verbindungen, Vorläufer oder Derivate davon während mindestens eines Teils des Embryonenreifungsprozesses, um eine Reifungshäufigkeit zu stimulieren und eine weitere Reifung der Embryonen zu fördern und um das Trockengewicht zu erhöhen und den Feuchtigkeitsgehalt zu erniedrigen.
Die folgende Beschreibung bezieht sich im speziellen auf die Verwendung von ABA und analogen Verbindungen, Vorläufern und Derivaten davon als dem Pflanzenwachstumsregulator der Wahl für eine Kombination mit dem nichteindringenden wasserentziehenden Mittel zum Erreichen einer Reifung und einer sanften Trocknung von somatischen Embryonen. Die Begriffe "analoge Verbindungen von ABA, ABA- Vorläufer und ABA-Derivate" beabsichtigen, Verbindungen zu bezeichnen, welche die Wirkung von ABA in Pflanzen nachahmen, ohne notwendigerweise strukturell mit ABA verwandt zu sein. Beispiele von solchen Verbindungen sind zu finden in Dunstan et al. (1991, Plant Science, 76, 219-228 und 1992, Phytochemistry, 31, 1451-1454), deren Inhalte hiermit durch Referenz eingebracht sind. Diese Verbindungen umfassen Abscisylalkohol, Acetylenaldehyd und Dihydroacetylenalkohol.
Es ist verständlich, dass im Kontext der vorliegenden Erfindung jeglicher Pflanzenwachstumsregulator verwendet werden kann, welcher speziell mit dem Induzieren von Stress in Verbindung steht und somit einen positiven Einfluss auf eine Embryonenentwicklung besitzt. Beispiele von alternativen Stressregulatoren umfassen Verbindungen wie Phaseinsäure (PA), Dihydrophaseinsäure (DPA), 6'-Hydroxymethylabscisinsäure (HM-ABA), beta-Hydroxyabscisinsäure, beta-Methylglutarylabscisinsäure, beta- Hydroxy-beta-methylglutarylhydroxyabscisinsäure, 4'-Desoxyabscisinsäure, Abscisinsäure-beta-D-glucoseester und 2-2(2-p-Chlorphenyl- trans-ethyl)cyclopropancarbonsäure.
Auch umfasst ist Jasmonsäure oder deren Derivate. Der Einfluss von Jasmonsäure und einiger ihrer Derivate auf den Pflanzenmetabolismus wurde von Reinbothe et al. (1992) im Journal Plant Growth Regulation, 11, 7-14, und von Parthier et al. in Proceedings of the 14th Interna tional Conference an Plant Growth Substances, 1991, Kluwer Academic Publishers, S. 277-286, dargelegt, wobei beide Referenzen hiermit durch Verweis mit aufgenommen werden. Es ist auch möglich, das Reifungsmedium durch Einbringen von Pflanzenwachstumspromotoren mit einer auxinähnlichen und cytokininähnlichen Aktivität zu ergänzen.
Im wesentlichen konstante Niveaus von ABA können vorzugsweise während mindestens einem Teil der Entwicklung der Embryonen aufrechterhalten werden. Hinsichtlich des nichteindringenden wasserentziehenden Mittels ist dessen Wahl ebenfalls bedeutend. Es ist essentiell, dass es mindestens eine nichtplasmolysierende Verbindung mit hohem Molekulargewicht wie PEG mit einem Molekulargewichtsbereich von über 1000 (z. B. PEG 4000) oder andere Polymere mit hohem Molekulargewicht wie Dextran enthält.
Die vorliegende Erfindung bildet einen unerwarteten Fortschritt in der somatischen Gymnospermenembryonenforschung, insbesondere in der somatischen Koniferenembryonenforschung, im Hinblick auf die derzeit verfügbare Technologie, welche es nicht möglich macht, einfache und verlässliche Verfahren zum Erreichen einer effektiven Reifung und Trocknung von somatischen Embryonen aufzuzeigen. Die Verwendung eines nichteindringenden wasserentziehenden Mittels in Kombination mit ABA während dem Reifungsstadium hat nicht nur zu wesentlichen Zunahmen bei den Reifungshäufigkeiten, erhöhten Trockengewichten von Embryonen und verringerten Feuchtigkeitsgehalten in somatischen Gymnospermenembryonen und insbesondere somatischen Koniferenembryonen geführt, sondern hat auch eine erhöhte Ansammlung von Speicherreservenverbindungen wie Triacylglycerolen (TAG) und Proteinen stimuliert. Wenn speziell Verbindungen mit hohem Molekulargewicht als ein nichteindringendes wasserentziehendes Mittel verwendet werden, wurde in der Tat eine dreifache Zunahme bei den Speicherproteinen und eine neunfache Zunahme bei den Speicherlipiden für somatische Koniferenembryonen beobachtet. Im Gegensatz dazu hat die Verwendung eines eindringenden wasserentziehenden Mittels eine wesentlich geringere Zunahme bei den Speicherreserven zur Verfügung gestellt. Ferner führten eindringende wasserentziehende Mittel nicht zu einer erfolgreichen Trocknung, da deren Verwendung bei effektiven Konzentrationen über längere Zeiträume letal oder nachteilig für die Embryonenentwicklung war.
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezug auf die folgende Beschreibung ausführlicher dargestellt.

IN DEN ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt den Einfluss der PEG-Konzentration und des osmotischen Potentials auf die Anzahl an reifen somatischen Weißfichtenembryonen, welche durch Replikation rückgewonnen wurden, und auf den Prozentsatz der Reifungshäufigkeit dar.
Fig. 2A stellt das Trockengewicht von somatischen Weißlichtenembryonen in direkter Nachfolge der Reifung in der Gegenwart verschiedener PEG-Konzentrationen (alle mit 16 uM ABA) dar.
Fig. 2B stellt den Feuchtigkeitsgehalt von somatischen Weißlichtenembryonen in direkter Nachfolge der Reifung in der Gegenwart von verschiedenen PEG-Konzentrationen (alle mit 16 uM ABA) dar.
Fig. 3A zeigt geschrumpfte trockene somatische Embryonen sofort nach einer Trocknung während 14 Tagen in einer Umgebung mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% auf.
Fig. 3B zeigt die somatischen Embryonen auf, die nach einer Imbibierung von 2 Stunden photographiert wurden.
Fig. 3C zeigt regenerierende Pflänzchen 7 Tage nach einer Rehydratisierung in der Folge einer Trocknung in einer Umgebung mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% auf.
Fig. 3D zeigt ein aberrantes typisches Pflänzchen auf, das in der Gegenwart von PEG gereift ist, dann während 28 Tagen ohne einer vorausgehenden Trocknungsbehandlung keimte.
Fig. 4 zeigt die hohe Überlebenshäufigkeit des Kotyledonarenstadiums bei somatischen Weißlichtenembryonen in der Folge von 8 Wochen auf einem Reifungsmedium, welches 16 uM an ABA und 7,5% an PEG enthält, dann getrocknet durch eine Behandlung bei geringer relativer Feuchtigkeit.
Fig. 5 zeigt drei Wochen alte somatische Weißfichtenpflänzchen, welche aus somatischen Embryonen regeneriert wurden, die während 8 Wochen auf einem Reifungsmedium, welches 16 uM an ABA und 7,5% an PEG enthält, reiften, dann durch Behandeln bei geringer relativer Feuchtigkeit trockneten.
Fig. 6 zeigt drei Wochen alte zygotische Weißfichtensämlinge.
Fig. 7-14 zeigen Materialschnitte von Weißlichte. Alle elektronenmikroskopischen Aufnahmen sind von Zellen, die benachbart sind zu dem Sprossapikalmeristem.
Fig. 7A ist eine lichtmikroskopische Aufnahme, welche den Sprossapikalmeristem (schwarzer Pfeil) und Prokambiumzellen (weiße Pfeile) eines reifen zygotischen Embryos aufzeigt, der aus einem Samen geschnitten wurde, welcher während 16 Stunden imbibierte.
Fig. 7B ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen in dem in Fig. 7A gezeigten zygotischen Embryo.
Fig. 8 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen in einem zygotischen Embryo, der aus einem Samen geschnitten wurde, welcher während 65 Stunden imbibierte.
Fig. 9 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen in einem nichtgetrockneten somatischen Embryo sofort nach einer Reifung während 8 Wochen mit 16 uM an ABA und 7,5% an PEG.
Fig. 10A ist eine lichtmikroskopische Aufnahme, welche einen Medianschnitt durch den Sprossapikalmeristem eines während 2 Stunden imbibierten somatischen Embryos in der Folge einer Reifung während 8 Wochen mit 16 uM an ABA und 7,5% an PEG, dann Trocknen durch Behandeln bei niedriger relativer Feuchte zeigt.
Fig. 10B ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen in dem somatischen Embryo aus Fig. 10A.
Fig. 11A ist eine lichtmikroskopische Aufnahme, welche einen Medianschnitt durch einen Sprossapikalmeristem eines somatischen Embryos aufzeigt, welcher während 4 Wochen mit 16 uM an ABA aber ohne PEG reifte.
Fig. 11B ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen in dem somatischen Embryo aus Fig. 11A.
Fig. 12A ist eine lichtmikroskopische Aufnahme, welche einen Medianschnitt durch einen Sprossapikalmeristem eines somatischen Embryos aufzeigt, der während 4 Wochen mit 16 uM an ABA und 7,5% an PEG reifte.
Fig. 12B ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen in dem somatischen Embryo aus Fig. 12A.
Fig. 13A ist eine lichtmikroskopische Aufnahme, welche einen Medianschnitt durch den Sprossapikalmeristem eines 4 Wochen alten zygotischen Sämlings aufzeigt, der aus einem isolierten Embryo gewachsen ist.
Fig. 13B ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen in dem zygotischen Sämling aus Fig. 13A.
Fig. 14A ist eine lichtmikroskopische Aufnahme, welche einen Medianschnitt durch den Sprossapikalmeristem (großer Pfeil) eines 4 Wochen alten somatischen Pflänzchens aufzeigt, welches aus einem somatischen Embryo regeneriert wurde, der während 8 Wochen mit 16 mm an ABA und 7,5% an PEG reifte, dann trocknete.
Fig. 14B ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen in dem somatischen Pflänzchen aus Fig. 14A.
Fig. 15 stellt die Trocknungsresistenz von somatischen Weißlichtenembryonen als eine Funktion der Reifungszeit dar.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft getrocknete reife somatische Gymnospermenembryonen und ein Verfahren zur Herstellung von getrockneten reifen somatischen Gymnospermenembryonen. Das Verfahren umfasst im allgemeinen eine Entwicklung von unreifen somatischen Embryonen in einem Medium, welches mindestens ein nichteindringendes wasserentziehendes Mittel, eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle und einen Pflanzenwachstumsregulator wie ABA und/oder analoge Verbindungen, Vorstufen oder Derivate davon umfasst, während eines Zeitraums, der ausreichend ist, um sanft getrocknete reife somatische Embryonen zu ergeben, welche einen Feuchtigkeitsgehalt im Bereich von zwischen 32 und 55 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 35 und 45 Gew.-% besitzen.
Wenn es gewünscht ist, eine weitere Trocknung der somatischen Embryonen zu erhalten, werden die zuvor erhaltenen getrockneten reifen somatischen Embryonen einer zweiten Trocknungsbehandlung unterzogen, welche entweder einen osmotischen Stress oder mindestens eine Umgebung mit einer niedrigen relativen Feuchtigkeit beinhaltet, während eines Zeitraums, der ausreicht, um stark getrocknete somatische Embryonen zu erhalten, welche einen Feuchtigkeitsgehalt im Bereich zwischen 10 und 36 Gew.-% besitzen. Die resultierenden getrockneten somatischen Embryonen können dann in einer nichthydratisierten wasserlöslichen Verbindung beschichtet werden und können entweder gefroren oder bei Raumtemperatur gelagert werden.
Es besteht eine auffallende Ähnlichkeit im Entwurf von Embryonen aller Gymnospermenspezies. Es existiert in der Tat ein Grundplan für eine Embryonenentwicklung, welcher mehr oder weniger für alle Gymnospermen gleich ist. Als erstes gibt es eine freie Kernphase von variierender Derivatisierung. Dann gibt es eine Wandbildung, gefolgt von der Organisation von zwei Reihen, von denen die obere gebenüber dem Archegonium offenbleibt. Danach teilt sich die Zelle der letzteren für gewöhnlich noch einmal, was resultiert in der oberen Reihe, welche wiederum offenbleibt, und der mittleren Reihe, welche als der Suspensor fungiert. Eine somatische Embryogenese beinhaltet eine Reaktivierung von einem Großteil des Entwicklungsprogramms einer normalen Embryogenese, und derzeit sind dieselben Bereiche der Bedingungen, welche sich als unterstützend für eine Induktion, Proliferation und Reifung von Weißlichte erwiesen, dieselben wie bei allen anderen Koniferen und sind verschieden von den für Angiospermen entwickelten Verfahren. Zygotische Embryonen von allen Gymnospermen, der Gruppe, zu der die Koniferen gehören, zeigen eine Ähnlichkeit in ihrem Modus der Entwicklung auf, welcher einheitlich gegenüber allen anderen Pflanzengruppen ist, insbesondere den Angiospermen. Obwohl die folgende Beschreibung sich speziell auf Verfahren bezieht, die zur Herstellung von getrockneten somatischen Koniferenembryonen verwendet werden, ist es somit selbstverständlich, dass diese Verfahren ein breiteres Anwendungsgebiet besitzen, welches alle Gymnospermen einschließt.
Die vorliegende Erfindung erfordert das Verständnis und die Steuerung bestimmter kritischer Faktoren wie der Konzentration von ABA und der Natur und Konzentration des in der Entwicklung des sanft getrockneten reifen Embryos verwendeten nichteindringenden wasserentziehenden Mittels, der Umgebung und des Verfahrens, durch welches die sanft getrockneten reifen somatischen Embryonen weiter getrocknet werden können, und des Verfahrens, durch welches die getrockneten somatischen Embryonen anschließend eingekapselt werden. Jeder dieser Aspekte wird zusammen mit ausführlicheren Betrachtungen der Reifungs- und Trocknungsverfahren getrennt diskutiert.

Abscisinsäure

Der Zeitraum, während dem Abscisinsäure im Entwicklungsstadium zugeführt wird, variiert in Abhängigkeit von der Pflanzenspezies. Da zum Beispiel unreife somatische Koniferenembryonen sich auf einem hormonfreien Medium nicht zu funktionalen reifen Embryonen entwickeln, muß ABA zumindest am Beginn der Reifungsperiode zugeführt werden, auch wenn die Anwendung von ABA während eines Abschnitts der Entwicklung unterbrochen werden kann. Vorzugsweise sollte ABA am Anfang in dem Medium in ausreichender Konzentration vorhanden sein, um so eine Endkonzentration von ABA von mindestens 0,1 uM am Ende der Periode, während der die Embryonen sich entwickeln, zu besitzen. Das Vorhandensein von hohen Niveaus an ABA während dem Großteil der Reifungsperiode maximiert eine Entwicklung, während eine frühreife Keimung eingeschränkt wird. Es ist im allgemeinen bevorzugt, dass eine im wesentlichen konstante ABA-Konzentration während des Hauptteils der Reifungsperiode aufrechterhalten wird, jedoch können die Niveaus am Anfang oder Ende der Reifung allmählich angehoben oder verringert werden, insbesondere wenn ein Bioreaktor als ein Kultivierungsgefäß verwendet wird.
Eine Reifung der somatischen Embryonen kann sofort nach einem Transfer von einem Induktions- oder Vermehrungsmedium zu dem Reifungsmedium initiiert werden, jedoch kann eine Reifung verbessert werden, wenn unreife Embryonen auf einem hinsichtlich des Wachstumsregulator reduziertem oder einem Wachstumsregulator-freiem Vermehrungsmedium oder einem Vermehrungsmedium, welches alleinig in verringertem Maße Auxin oder Cytokinin enthält, vorkultiviert werden. Zusätzliche Details einer Vorkultivierung der Embryonen werden weiter unten zur Verfügung gestellt.
Eine Entwicklung der Embryonen findet während einer Zeit statt, die im allgemeinen von 1 bis 15 Wochen reicht. Handelsübliches ABA besteht aus razemischen Formen, jedoch ist lediglich die (+)-Form wirksam bei der Förderung der Reifung. Die Konzentrationen an (+) ABA, welche während der Entwicklung verwendet werden können, sowohl für die Zwecke der Reifung als auch letztendlich für die Zwecke der Trocknung, reichen von 0,1 bis 100 uM. Konzentrationen von (±) ABA zwischen 12 uM bis 60 uM sind bevorzugt. Optimale Ergebnisse werden erhalten, wenn somatische Koniferenembryonen während 6 bis 8 Wochen auf einem Medium reifen, welches 16-24 uM (±) ABA enthält.

Nichteindringendes wasserentziehendes Mittel

Wie zuvor erwähnt, können zwei Arten an osmotischem Stress auf Pflanzenzellen angewendet werden. Die erste Art ist ein eindringender osmotischer Stress, welcher für gewöhnlich durch Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht wie Sucrose oder Mannitol induziert wird. In diesem Fall durchwandert das eindringende osmotische Mittel die Zellwand und bewirkt, dass Wasser aus dem Symplast (Zellzytoplasma) durch Osmose austritt. Jedoch kann das eindringende Mittel frei in den Symplasten der Zelle eintreten. Im Verlauf der Zeit kann eine ausreichende Menge an eindringendem Mittel eintreten, um das osmotische Potential der Zellen zu verändern, was dazu führt, dass Wasser dann durch Osmose wieder in die Zelle eintritt. Somit werden Gewebewassergehalte während einer längeren Inkubation mit eindringenden Osmotika nicht notwendigerweise verringert. Ferner können die internen Osmotika direkt oder indirekt den Zellmetabolismus beeinflussen. Zum Beispiel können einfache Zucker und Salze durch die Pflanzenzellen absorbiert und verwendet werden, was zu einer nahrungsbezogenen oder osmotischen Anpassung führt. Es können auch toxische Wirkungen auf den Metabolismus resultieren.
In dem Fall eines nichteindringenden osmotischen Stresses sollten Verbindungen wie PEGs oder Dextrane ein ausreichend hohes Molekulargewicht besitzen, um ein Eindringen des Mittels durch die Matrix der Zellwand zu verhindern. Nichteindringende Osmotika entfernen gleichermaßen durch Osmose Wasser aus der Zelle, jedoch kann das osmotische Mittel nicht frei in das Zytoplasma eintreten.
Die Wirkungen sind daher langandauernd und simulieren einen nichtosmotischen Stress (z. B. Trockenheit) auf dem Zellniveau. Wenn nichteindringende oder weniger bereitwillig eindringende gelöste Stoffe verwendet werden, kann das negativere osmotische Potential des externen Mediums aufgrund dieser gelösten Stoffe lediglich durch eine Dehydratisierung des Gewebes oder eine aktive Aufnahme von anderen externen gelösten Stoffen und der Biosynthese von organischen Osmotika ausgeglichen werden. Letztere können dann zu Speicherprodukten umgewandelt werden.
Da der Durchmesser der Poren in den Wänden von lebenden Pflanzenzellen, durch welche Moleküle frei hindurchgehen können, durch eine "Solute-Exclusion"-Technik auf zwischen 30 und 45 Ångström bestimmt wurde, was abhängig ist von der Pflanzenspezies und der Gewebeart (z. B. Wurzel oder Blatt usw.), ist es scheinbar so, dass Moleküle mit Durchmessern, die größer als diese Poren sind, hinsichtlich ihrer Fähigkeit zum Eindringen durch solch eine Zellwand eingeschränkt sind. Es hat somit den Anschein, dass Moleküle mit einem Durchmesser von mehr als 30 Angström entweder allein oder in Kombination mit anderen Arten von Osmotika verwendet werden könnten, um einen nichteindringenden Wasserentzug in somatischen Koniferenembryonen zu induzieren. Polyethylenglykole mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 oder Dextrane mit einem Molekulargewicht von mehr als 4000 sind bevorzugte nichteindringende wasserentziehende Mittel, obwohl es selbstverständlich ist, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung dieser Produkte beschränkt ist. Tatsächlich könnte die Klasse an gelösten Stoffen oder Verbindungen, welche zum Induzieren eines nichteindringenden Wasserentzugs verwendet werden könnte, eine beliebige wasserlösliche Verbindung mit hohem Molekulargewicht, welche eine Molekülgröße von mehr als 30 Angström besitzt, einschließen. Geeignete Alternativen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, komplexe Kohlenwasserstoffe wie Cellulosen, Pectine, Galactane, Ficcole, Polypropylenglykole, Agare, Gummis und Oligosaccharide ebenso wie Proteine, Aminosäuren (insbesondere Polyaminosäuren), Lipoproteine, Nukleotide, Oligonukleotide und Lipopolysaccharide.
Die Verwendung von nichteindringenden gelösten Stoffen zur Verursachung eines nichtosmotischen Feuchtigkeitsentzugs in ganzen bodenwachsenden Pflanzen zur Kompensation von Salzeffekten oder zum Bewirken einer osmotischen Initialreaktion von Samen wurde in großem Umfang dokumentiert. Verbindungen mit hohem Molekulargewicht wurden auch als Komponenten in hydratisierten Gelen zum Einkapseln von zuvor getrockneten meristematischen Geweben, somatischen Embryonen oder gewebekultivierten Pflanzen vorgeschlagen. Die spezifische Verwendung von nicht- eindringenden gelösten Stoffen wie PEGs oder Dextranen in Kombination mit ABA für den Zweck der Reduzierung der Feuchtigkeitsgehalte, einer Verbesserung der Reifung und letztendlich der Ermöglichung einer starken Trocknung für somatische Embryonen wird jedoch zum ersten Mal im Kontext der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung erwiesen sich Konzentrationen von nichteindringenden Verbindungen im Bereich zwischen 1 und 30 Gew.-% als brauchbar für eine Unterstützung der Embryonenreifung. Die Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 1000 und 35.000, vorzugsweise PEG mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 3500 und 10.000 und am meisten bevorzugt PEG 4000 bis 8000 in Konzentrationen von 1 bis 30 Gew.-% ist bevorzugt. Am meisten bevorzugt sind Konzentationen von PEG 4000 und PEG 8000 im Bereich von 2 bis 15,0 Gew.-%. Eine Konzentration an PEG 4000 von 7,5 Gew.-% führt im Vergleich mit Kontrollen zu einer dreifachen Erhöhung der Reifungshäufigkeit und erwies sich als optimal für eine Ansammlung von Speicherreserven.
Mit PEG wurde beobachtet, dass bei den Arten mit höherem Molekulargewicht es notwendig war, sie in größeren Mengen anzuwenden, um vergleichbare osmotische Potentiale zu erreichen als bei Arten mit niedrigerem Molekulargewicht. Somit können die PEGs mit sehr hohem Molekulargewicht einen größeren Anteil des Mediums beanspruchen, was ein Gelieren des Mediums verhindert. Wenn Embryonen auf Agargelmedien kultiviert werden, ist PEG 4000 bevorzugt für das Anwenden eines nichteindringenden Wasserentzugs, während ein Gelieren des Mediums bei geeigneten Konzentrationen ermöglicht wird. Ein Bioreaktor mit kontinuierlichem Fluß ermöglicht es, dass ein größerer Bereich an Verbindungen mit hohem Molekulargewicht verwendet wird.
Hinsichtlich Dextran hat sich Dextran mit einem Molekulargewicht von bis zu 80.000 als geeignet erwiesen, wobei ein Molekulargewicht von über 6000 bevorzugt ist. Dextrane sollten im allgemeinen in dem Medium in Mengen in Bereich zwischen 1 und 30 Gew.-% vorhanden sein, wobei 5 bis 20 Gew.-% bevorzugt und 10 Gew.-% am meisten bevorzugt sind.
Es ist erforderlich, eine nichteindringende Verbindung in einer solchen Konzentration zu verwenden, dass das gewünschte osmotische Potential in dem Medium erreicht wird. Allgemein kann das osmotische Potential des Mediums zwischen -0,3 und -2,0 MPa variieren, wobei -0,6 bis -1,0 MPa bevorzugt sind.

Verfahren zur Herstellung von getrockneten somatischen Embryonen

Vorkultivieren von somatischen Embryonen

Eine Vorkultur mit einem Vermehrungsmedium, welches Cytokinin als den einzigen Wachstumsregulator enthält, dann ein Transfer zu einem Reifungsmedium, das ABA enthält, förderte eine Reifung von somatischen Embryonen aus Linien, welche sich zuvor als widerstandsfähig gegenüber Standard-ABA-Reifungsbehandlungen erwiesen. Gleichermaßen verhinderte die Einbeziehung von Cytokinin mit ABA während der ersten wenigen Wochen der Reifung vor dem Transfer auf ein Reifungsmedium, welches nur ABA enthält, eine frühreife Keimung während der Reifungsphase. Dies resultierte in verbesserten Reifungshäufigkeiten und führte auch zu der Rückgewinnung von reifen Embryonen aus Zellinien, die sich vorher als widerstandsfähig gegenüber Reifungsbehandlungen erwiesen.
Untersuchungen mit Weißlichte zeigten auf, dass eine Vorkultur während einer Woche in einem Pflanzenwachstumsregulator-freien flüssigen Vermehrungsmedium nachfolgende Reifungshäufigkeiten förderte, was häufig die Rückgewinnung von reifen Embryonen verdoppelte. Eine nachfolgende Embryonenentwicklung auf ABA-haltigem Reifungsmedium war auch schneller, da Embryonen des frühen Kotyledonarstadiums bis zu einer Woche eher auftraten als bei ABA-Kulturen, die nicht vorbehandelt wurden. Diese optimale Dauer der Vorkulturperiode variierte scheinbar mit dem Alter der Suspensionskultur. Somit zog eine neu etablierte Suspensionskultur (< 1-3 Monate) in der Folge einer Kryolagerung einen Nutzen aus einer Pflanzenwachstumsregulatorfreien Kultur von 1-3 Tagen, während eine einwöchige Vorkultur zu einer verringerten Rückgewinnung von reifen Embryonen führte. Jedoch dieselbe Zellinie, die aus der Kryolagerung 18 Monate früher rückgewonnen wurde, erforderte eine Vorkultur von mindestens 1 Woche für eine optimale Reifung. Das beste und am meisten beständigste Verfahren zur Vorkultivierung war es, das Auxin aus dem Vermehrungsmedium während einer Periode von 1 Woche vor einem Ausplattieren auf ein Medium, welches ABA und kein eindringendes Osmotikum enthält, um mindestens 1/10 zu verringern. Ein alternatives Verfahren ist es, die gesamten Wachstumsregulatorniveaus zu reduzieren, ohne sie vollständig zu eliminieren. Diese Vorbehandlung plus ein nachfolgender ABA/Feuchtigkeitsentzug besaßen einen synergistischen Effekt auf die Reifungshäufigkeit von somatischen Embryonen, welche im Vergleich zu keiner Vorbehandlung mindestens verdoppelt wurden.
Sogar obwohl das Vorkultivieren der somatischen Embryonen vor einer Trocknung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung optional bleibt, kann es somit in einigen Fällen nützlich sein, eine Reifung von ausgewählten Zellinien, welche auf eine direkte ABA-Reifung nicht so ansprechen wie andere, zu erhöhen.

Reifung und sanfte Trocknung von somatischen Embryonen

Getrocknete reife somatische Embryonen werden erhalten durch Entwickeln von unreifen somatischen Embryonen in einem Medium, welches mindestens ein nichteindringendes wasserentziehendes Mittel, eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle wie Sucrose und ABA und/oder analoge Verbindungen, Vorstufen oder Derivate davon umfasst während eines Zeitraums, der von 1 bis 15 Wochen reicht, wobei 4 bis 10 Wochen bevorzugt sind und 6 bis 8 Wochen am meisten bevorzugt sind. Wie zuvor erwähnt, kann die Konzentration an verwendeter (+) oder (-) ABA während des Reifungsprozesses von 0,1 bis 100 uM reichen, wobei jedoch (±) ABA vorzugsweise im Bereich von 12 bis 60 uM liegen sollte. Hinsichtlich des nichteindringenden wasserentziehenden Mittels ist PEG 4000 bis 8000 in Konzentrationen von 1 bis 30 Gew.-% bevorzugt, wobei eine Konzentration von 1 bis 15 Gew.-% bevorzugt ist. Es ist wichtig, anzumerken, dass die Temperatur, bei welcher eine Reifung bewirkt wird, die Zeit beeinflussen kann, die für eine vollständige Reifung notwendig ist. Der Prozess ist besonders geeignet für eine Reifung von somatischen Koniferenembryonen.

Charakteristiken von sanft getrockneten reifen somatischen Embryonen

Die durch den oben beschriebenen Prozess erhaltenen somatischen Embryonen werden dadurch charakterisiert, dass sie einen Feuchtigkeitsgehalt im Bereich zwischen 32 und 55 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 35 und 45 Gew.-%, und einen Gesamtlipidgehalt pro Embryo und ein Trockengewicht besitzen, welche höher sind als der Lipidgehalt pro Embryo und das Trockengewicht von entsprechenden zygotischen Embryonen. Tatsächlich kann das Gewicht der gesamten Lipide und Triacylglycerole (TAG) pro Embryo bis zu fünfmal höher sein als bei entsprechenden zygotischen Embryonen.
Im Fall von sanft getrockneten reifen somatischen Koniferenembryonen liegt der Feuchtigkeitsgehalt für gewöhnlich im Bereich zwischen 32 und 55 Gew.-%, wobei ein Feuchtigkeitsgehalt zwischen 35 und 45 Gew.-% bevorzugt ist. Hinsichtlich TAG können sie in Mengen in einem Bereich zwischen 70 und 350 uM vorhanden sein, wobei 70 bis 150 uM für gewöhnlich erhalten werden. Hinsichtlich der Trockengewichte von somatischen Koniferenembryonen variiert es für gewöhnlich zwischen 0,2 und 1,5 mg, wobei für gewöhnlich 0,2 bis 0,8 mg erhalten werden. Bevorzugte somatische Koniferenembryonen sind solche von der Familie Pinaceae.
Wenn zum Beispiel somatische Weißlichtenembryonen, welche mit 7,5% an PEG und 16 uM an ABA während 4-8 Wochen reiften, verglichen werden mit entsprechenden zygotischen Embryonen, besitzen beide ähnliche TAG-Fettsäure und Speicherpolypeptidprofile, eine ähnliche Struktur und ähnlich getrocknete und imbibierte Feuchtigkeitsgehalte. Jedoch sind somatische Embryonen nach einer Reifung von nur 4 Wochen größer, was durch ihre größeren Trockengewichte belegt wird, und enthalten bei der 6. Woche der Reifung beträchtlich mehr Speicherreserven wie beispielsweise Lipide. Somit haben sich bei 6 Wochen die Niveaus von TAG pro Embryo nahezu verdoppelt im Vergleich mit zygotischen Embryonen, und bei 8 Wochen haben sich die Niveaus mindestens verdreifacht, wie nachfolgend in Tabelle 1 aufgezeigt. Sekundäre Trocknungsbehandlungen zum Erzielen von geringereren Feuchtigkeitsgehalten können die Werte weiter verringern. Tabelle 1

Starke Trocknung von reifen somatischen Embryonen zu niedrigen Feuchtigkeitsgehalten

Das durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellte Verfahren zur Trocknung von somatischen Embryonen wird in zwei Hauptschritten durchgeführt. Der erste Schritt besteht aus einer Verringerung des Wassergehalts von unreifen somatischen Embryonen während deren Entwicklung durch Reifung dieser Embryonen in einem Medium, welches mindestens ein nichteindringendes wasserentziehendes Mittel, eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle und ABA und/oder analoge Verbindungen, Vorstufen oder Derivate davon umfasst während eines Zeitraums, der ausreicht, um sanft getrocknete reife somatische Embryonen zu ergeben, welche einen Feuchtigkeitsgehalt im Bereich von zwischen 32 und 55 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 35 und 45 Gew.-%, besitzen. Der zweite Schritt besteht aus einem Trocknungsprozess im späten Stadium. Die sanft getrockneten reifen somatischen Embryonen werden dann einer zweiten Trocknungsbehandlung unterzogen, welche entweder ein Unterziehen der Embryonen einem weiteren osmotischen Stress oder zumindest einer Umgebung mit einer niedrigen relativen Feuchte beinhaltet, um stark getrocknete somatische Embryonen zu ergeben, welche einen endgültigen Feuchtigkeitsgehalt im Bereich zwischen 10 und 36 Gew.-% besitzen, wobei ein Feuchtigkeitsgehalt von 20 bis 30 Gew.-% der am meisten bevorzugte Bereich ist.

1. Verringerung des Wassergehalts und Erhöhung der Speicherreserven bei unreifen somatischen Embryonen

Um erfolgreich eine starke Trocknung zu geringen Feuchtigkeitsgehalten von reifen somatischen Embryonen und insbesondere somatischen Koniferenembryonen zu erzielen, ist es notwendig, zuerst den Feuchtigkeitsgehalt der Embryonen während einer Reifung auf einen Prozentsatz zwischen 32 und 55 Gew.-%, idealerweise zwischen 35 und 45 Gew.-%, zu reduzieren. Eine Reduzierung des Wassergehalts der Embryonen während einer Reifung führt zu einer erhöhten Resistenz gegenüber einer weiteren starken Trocknung anhand der folgenden Gründe. Eine Resistenz gegenüber einer Trocknung zu geringen Feuchtigkeitsgehalten scheint nahe verwandt zu sein mit dem Niveau an Speicherreserven. Behandlungen, welche eine Ansammlung von Speicherreserven fördern, wie ABA, nichtplasmolysierender Feuchtigkeitsentzug und eine erhöhte Reifungszeit, fördern auch eine Trocknungsresistenz. Dies rührt daher, dass vakuolisierte Zellen, welche wenig an Reservematerial enthalten, einer mechanischen Zerstörung und einem Reißen von Membranen während einem starken Wasserverlust unterliegen können, während die Gegenwart von ausreichenden Reserven solche Veränderungen begrenzen. Zusätzlich wird eine frühreife Keimung inhibiert, welche eine starke Trocknungsresistenz weiter verstärkt.
Eine Behandlung der Embryonen mit einem nichteindringenden wasserentziehenden Mittel verbessert die Reifungshäufigkeit der Embryonen. Der fördernde Effekt wird als eine Folge des induzierten nichtplasmolysierenden Wasserentzugs angesehen. Wie nachfolgend dargelegt wird, stimulieren nichteindringende wasserentziehende Mittel wie PEGs mit hohem Molekulargewicht und Dextrane bei einer Verwendung in geeigneten Konzentrationen, welche im allgemeinen bei Konzentrationen von 1 bis 30 Gew.-% liegen, wesentliche Zunahmen der Reifungshäufigkeit, wenn sie mit Kontrollen verglichen werden. In einer der bevorzugten Merkmale der vorliegenden Erfindung stimulierten 5 bis 7,5% PEG 4000 oder 10% Dextran 80.0000 im Vergleich mit Kontrollen tatsächlich eine dreifache Erhöhung der Reifungshäufigkeit von somatischen Koniferenembryonen.
Der Feuchtigkeitsgehalt von reifen stark getrockneten somatischen Embryonen, welche durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt wurden, ist gleich dem von reifen zygotischen Embryonen. Regenerierte Pflänzchen aus mit nichteindringenden Wasserentzug behandelten und dann stark getrockneten somatischen Embryonen sind von besserer Qualität als die nichtosmotisch behandelten Kontrollen. Ein möglicher Grund dafür ist es, dass somatische Embryonen, welche in Abwesenheit von wasserentziehenden Mitteln reifen, in den ersten wenigen Tagen der Trocknung der zweiten Stufe frühreif keimen, während die Feuchtigkeitsgehalte noch hoch sind. Es ist wahrscheinlich, dass in diesen Fällen ein nachfolgendes Überleben von Geweben wie Wurzel- und/oder Sprossmeristem, Hypokotyl und Kotyledone in somatischen Embryonen nicht einheitlich ist, was zu unregelmäßigen Pflänzchen führt.
Im Vergleich besaßen somatische Embryonen, welche in der Gegenwart von nichteindringenden wasserentziehenden Mitteln reiften, einen niedrigeren Feuchtigkeitsgehalt und waren daher bereits beträchtlich trockener vor einer weiteren starken Trocknung. Diese Embryonen verbleiben ruhend in der Folge eines Transfers aus dem ABA-Medium, und eine Trocknung eines jeden Embryos ist gleichmäßiger wodurch die Pflänzchenqualität verbessert wird. Somatische Embryonen bleiben unter niedrigen osmotischen Bedingungen jedoch nur dann ruhend, wenn ABA vorhanden ist. Somit ist für somatische Koniferenembryonen eine Kombination von sowohl ABA als auch einem nichteindringenden wasserentziehenden Mittel wirksamer bei einer Förderung der Reifung und einer Verhinderung einer frühreifen Keimung, als wenn ABA und das nichteindringende wasserentziehende Mittel einzeln verwendet werden. Es scheint ein synergistischer Effekt aufzutreten, wenn ABA und PEG zusammen verwendet werden.
Während einer verlängerten Reifung (z. B. einer achtwöchigen Reifung) wird der nichteindringende Wasserentzug zunehmend bedeutend bei einer Verhinderung einer frühreifen Keimung, was ein Überleben in der Folge einer weiteren Trocknung verbessert. Eine frühreife Keimung tritt insbesondere bei Behandlungen mit niedrigen ABA-Konzentrationen und einem geringen Wasserentzug und während zweiten Trocknungsbehandlungen auf, was zu einem eingeschränkten oder keinem Überleben für alle diese Behandlungen führt. Nach einer achtwöchigen Reifung kann die erhöhte Neigung für eine frühreife Keimung während verlängerten Reifungsbehandlungen davon herrühren, dass somatische Embryonen einer Verringerung der ABA-Sensibilität während der Reifung unterliegen. Es wurde auch beobachtet, dass eine Verringerung der Resistenz gegenüber einer schnellen starken Trocknung (z. B. auf dem Labortisch) spät bei der Reifung auftritt (d. h. achtwöchige Reifung), was mit der Zeit übereinstimmt, bei welcher somatische Embryonen eine größere Neigung zur frühreifen Keimung aufzeigen.
Sowohl ABA als auch ein Osmotikum unterstützen die Ansammlung von Speicherreserven in Embryonen. Die Neigung zur Erhöhung eines Trockengewichts und zur Verringerung eines Feuchtigkeitsgehalts von osmotisch behandelten somatischen Weißlichtenembryonen zeigt auf, dass Speicherreserven innerhalb der Zellen abgelagert wurden, während Wasser ersetzt wurde. Wie zuvor erwähnt, sammeln die osmotisch behandelten somatischen Embryonen mehr Speicherreserven (z. B. Proteine und Lipide) an als vergleichsweise die unbehandelten Kontrollen.
Embryonen von vielen Pflanzenspezies keimen normalerweise nur, wenn zuvor getrocknet wird, was eine Aktivierung von neuen Genen nahelegt. In dem Fall von somatischen Koniferenembryonen wurde aufgezeigt, dass eine weitere starke Trocknung von somatischen Embryonen zur Förderung einer nachfolgenden Pflänzchenentwicklung nur notwendig ist, wenn die somatischen Embryonen unter Verwendung von erhöhten osmotischen Konzentrationen reiften. Unter niedrigen osmotischen Bedingungen gereifte Embryonen entwickeln sich anschließend ohne der Notwendigkeit für eine weitere Trocknung, zeigen jedoch eine Neigung in Richtung einer frühreifen Keimung.
Der Effekt einer PEG-Konzentration auf ein osmotisches Potential ist verschieden von dem von Lösungen von eindringenden wasserentziehenden Mitteln wie Salzen und Zuckern. Zum Beispiel tritt ein negativer krummliniger Abfall des osmotischen Potentials mit einer Zunahme der PEG-Konzentration auf und steht offensichtlich in Beziehung mit strukturellen Veränderungen im PEG-Polymer. Die Anwendung von Sucrose bei ähnlichen osmotischen Potentialen auf 5,0-7,5% PEG 4000 fördert die Reifung von somatischen Koniferenembryonen nicht besonders, was möglicherweise davon herrührt, dass eine Absorption dieses gelösten Stoffes durch die Gewebe zu einem veränderten Metabolismus führt.
Somit führt die Anwendung eines nichteindringenden wasserentziehenden Mittels auf das Reifungsmedium zu somatischen Embryonen, welche hinsichtlich eines niedrigen Feuchtigkeitsgehalts und eines hohen Grads an Quieszenz den zygotischen Pendants ähneln. Zusätzlich stimuliert das nichteindringende wasserentziehende Mittel die Reifungshäufigkeit und verbessert die Ansammlung von Speicherprodukten.
Um einen Wasserverlust (sanfte Trocknung) und eine Reifung während des Entwicklungsstadiums der somatischen Embryonen zu maximieren, wurden verschiedene Experimente aufgestellt, um die Auswirkungen verschiedener Kulturbedingungen auf die Reifung und den Wasserverlust zu beobachten. Es scheint so zu sein, dass die Embryonen während einer minimalen Periode von 1 Woche und einer maximalen Periode von 15 Wochen, vorzugsweise während 4 bis 8 Wochen und am meisten bevorzugt während 6 bis 8 Wochen auf einem Medium gehalten werden sollen, welches vorzugsweise zwischen 12 und 60 uM an ABA und vorzugsweise zwischen 1 und 30 Gew.-% eines nichteindringenden wasserentziehenden Mittels enthält. Die Konzentration des nichteindringenden wasserentziehenden Mittels kann in Abhängigkeit von dessen Natur variieren.
Im Fall von PEG mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000 wurden zum Beispiel Konzentrationen von 7,5% bei einem osmotischen Potential von -0,7 MPa als optimal für eine Reifung auf einem Agargelmedium bestimmt. Ist einmal der gewünschte Wassergehalt durch eine Reifung der somatischen Embryonen erreicht, wird eine starke Trocknung zur weiteren Verringerung der Feuchtigkeitsniveaus bewirkt, wodurch eine Langzeitlagerung verbessert wird, eine Beständigkeit der Embryonen gegenüber Frostschäden verbessert wird und eine anschließende Wachstumskraft der Pflänzchen verbessert wird.

Reifung von somatischen Embryonen unter Verwendung eines Feststoffbioreaktors mit kontinuierlichem Fluß

Heutige Experimente beinhalten für gewöhnlich eine Reifung von somatischen Embryonen auf halbfestem Medium oder auf Trägern über einem flüssigen Medium in Petrischalen. Dies ist arbeitsaufwendig für eine Fortpflanzung im großen Maßstab, insbesondere wenn häufige Änderungen des Mediums erforderlich sind. Eine Rückgewinnung von reifen Embryonen direkt aus flüssigen Submersionssuspensionen ermöglicht eine einfachere Handhabung von größeren Mengen an Material; jedoch gibt es derzeit keine Berichte über eine erfolgreiche Reifung in Submerskulturen. Es scheint, dass in allen Berichten, in denen Embryonen in Flüssigkeit oder Agar untergetaucht wurden oder lediglich in umgebenden embryogenetischen Geweben eingeschlossen sind, eine Reifung inhibiert ist. Somatische Koniferenembryonen wurden in flüssigen Suspensionen während anfänglichen Reifungsstadien kultiviert, jedoch benötigten sie dann einen Transfer auf feste Träger über einem Medium, um den Reifungsprozess zu vollenden. Es ist somit wahrscheinlich, dass ein guter Gastransfer zu und von den entwickelnden Embryonen zusätzlich zu einer feuchtigkeitsentziehenden Umgebung wichtig ist. Diese Parameter sind jedoch in einer flüssigen Umgebung schwierig zu erzielen. Ein alternatives Verfahren zum Erhalt von großen Zahlen an reifen Koniferenembryonen, welche eine minimale Handhabung erfordern, ist die Verwendung von Festträgerbioreaktoren mit kontinuierlichem Fluß. Ein derartiges System wurde beschrieben in JP 87123756, welche hiermit durch Referenz mit aufgenommen wird. Der Bioreaktor umfasst eine Kulturkammer mit einem Mediumeinlaß- und -auslaßmittel für eine kontinuierliche Zuführung von frischem Medium in die Kulturkammer. Er umfasst auch einen Träger zum Halten der unreifen Embryonen oberhalb der Oberfläche des Mediums und Mittel zum Bereitstellen und Steuern eines Luftstroms in der Kammer. Somit können somatische Koniferenembryonen in einer großen Kammer über einem flüssigen Medium getragen gereift werden. In das eine Ende des Behälters wird frisches flüssiges Kulturmedium gepumpt, während verbrauchtes aus dem gegenüberliegenden Ende austritt. Auch können ein Wachstumsregulator und osmotische Änderungen allmählich angewendet werden, wenn das flüssige Medium zugegeben wird, und der Luftraum in der Kammer kann ebenfalls reguliert werden, um die optimale Gasumgebung zur Verfügung zu stellen. Die große Kulturkammer ermöglicht es, große Zahlen an somatischen Embryonen pro Durchlauf zu kultivieren, was die Kosten der Verwendung von Petrischalen reduziert.

2. Sekundäre Trocknungsbehandlung von reifen somatischen Embryonen auf niedrige Feuchtigkeitsgehalte

Es wurde anfänglich angenommen, dass die Trocknungsresistenz von somatischen Embryonen gegenüber einer starken Trocknung auf einem niedrigen Feuchtigkeitsgehalt insbesondere bei somatischen Koniferenembryonen von der Trocknungsrate beeinflusst war. Es wurde somit angenommen, dass langsame Trocknungsraten ein Überleben unter allen osmotischen Behandlungen, insbesondere für unvollständig gereifte Embryonen erhöhten. Es wurde jedoch dargelegt, dass gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene optimal gereifte Koniferenembryonen durch entweder eine schnelle oder langsame Trocknung weiter getrocknet werden können. Andere Trocknungsverfahren, welche Kammern mit kontrollierter Feuchtigkeit verwenden, die eine Luftzirkulation zur Verfügung stellen, können ebenfalls verwendet werden, und in diesem Fall können die unten aufgezeigten Behandlungszeiten variieren. Eine starke Trocknung kann auch erreicht werden durch eine verlängerte Einwirkung von hohen Konzentration an Osmotikum auf die Embryonen. Wenn der Begriff "niedriger Feuchtigkeitsgehalt" hierin verwendet wird, ist es beabsichtigt, somatische Embryonen zu bezeichnen, welche einen Feuchtigkeitsgehalt im Bereich zwischen 10 und 36% besitzen in der Folge einer Reifung und nachfolgenden Trocknung.

a) Graduelle sekundäre Trocknungsbehandlung

Embryonen werden auf Filterpapierträgern gereift. Eine graduelle Trocknung der Embryonen auf niedrige Feuchtigkeitsgehalte kann erreicht werden durch Transferieren von reifen somatischen Embryonen auf deren Filterpapierträgern durch eine Reihe von Umgebungen mit zunehmend niedrigerer relativer Feuchtigkeit. Diese Technik wird beschrieben von Senaratna et al. in Plant Science, 65, 253-259, 1989, welches hiermit durch Referenz mit aufgenommen wird. Es wurde anfänglich angenommen, dass ein gradueller Wasserverlust eine ausreichende Zeit ermöglichte, so dass die schützenden Veränderungen in den Zellen stattfinden und somit die Resistenz der Embryonen gegenüber einer starken Dehydratisierung ansteigt. Weitere Untersuchungen haben aufgezeigt, dass eine graduelle Trocknung nicht eine absolute Notwendigkeit ist, sogar obwohl die Technik erfolgreich verwendet werden kann.
Die Rate, bei welcher eine graduelle Trocknung durchgeführt wird, kann wesentlich variieren. Zum Beispiel bewirken Embryonen auf feuchten Filterpapierträgern, welche in Kammern mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% plaziert werden, eine anfängliche Zunahme der relativen Feuchtigkeit. Die relative Feuchtigkeit nimmt dann über die nächsten wenigen Tage auf den gewünschten Wert ab, wodurch eine sehr graduelle Trocknung erzeugt wird. Falls eine Trocknung auf eine geringere relative Feuchtigkeit gewünscht ist, kann die Rate, bei welcher Kulturen zu allmählich geringeren relativen Feuchtigkeiten transferiert werden sollten, wesentlich variieren, allgemein gesprochen, sollten jedoch die reifen Embryonen bei Intervallen von 1 bis 7 Tagen allmählich zu Exsikkatoren mit niedrigerer relativer Feuchtigkeit transferiert werden. Die verbleibende Zeit bei der endgültigen erforderlichen Feuchtigkeit hängt von der Rate ab, mit welcher die Embryonen zuvor zu der niedrigeren relativen Feuchtigkeit transferiert wurden. Somit können die Kulturen während einem Minimum von 1 bis 7 Tagen bei der endgültigen erforderlichen relativen Feuchtigkeit gehalten werden. Es sollte auch angemerkt werden, dass eine relative Feuchtigkeit im Bereich zwischen 30 und 95% liegen kann bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 30ºC. Die Gesamtbehandlungszeit der sekundären Trocknung kann im Bereich zwischen 7 und 21 Tagen liegen.
Die relative Feuchtigkeit kann visuell durch ein Meßgerät in den Trocknungskammern überprüft werden. In der Folge einer Stabilisation des Meßgeräts ist ein Zeitraum von 1 bis 7 Tagen bei der gewünschten relativen Feuchtigkeit zulässig. Eine visuelle Begutachtung der Embryonen kann auf einfache Weise bestätigen, dass sie auf niedrige Feuchtigkeitsgehalte getrocknet sind, da sie sich von den gequollenen Embryonen mit einer hellcremefarbenen Farbe zu einem geschrumpften und deformierten Äußeren und einer gelblichen, wachsförmig durchscheinenden Erscheinung verändern.

b) Schnelle sekundäre Trocknung

Experimente haben belegt, dass somatische Koniferenembryonen eine langsame sekundäre Trocknung mit hoher Häufigkeit überleben, vorzugsweise wenn sie mit dem Kallus oberhalb des Filterpapierträgers gehalten werden. Solche, welche von dem Kallus entfernt und horizontal auf dem Träger plaziert wurden, führten zu rückgewonnenen Pflänzchen, welche abnormal waren (die Embryonen verlängerten sich nicht auf normale Weise, sondern blieben verkümmert). Es ist scheinbar notwendig, dass somatische Koniferenembryonen während einer langsamen sekundären Trocknungsbehandlung innerhalb des gesamten Kallus gehalten werden, um sich nachfolgend auf normale Weise zu entwickeln. Somatische Embryonen können auch eine schnelle sekundäre Trocknung überleben, welche in einigen Fällen praktischer sein kann als eine graduelle sekundäre Trocknung.
Im Fall einer schnellen sekundären Trocknung beinhaltet die Technik eine relative Feuchtigkeit der Umgebung im Bereich zwischen 5 und 95%. Eine relative Feuchtigkeit der Umgebung im Bereich zwischen 20 und 63% bei einer Umgebungstemperatur im Bereich zwischen 20 und 25ºC ist bevorzugt. Eine relative Feuchtigkeit der Umgebung im Bereich zwischen 30 und 40% bei einer Temperatur von 25ºC erwies sich als geeignet. Reife somatische Embryonen aus sanften Trocknungsbehandlungen, welche auf Filterpapierträgern gehalten werden und einer schnellen sekundären Trocknung unterzogen werden, trocknen für gewöhnlich auf niedrige Wassergehalte innerhalb eines Zeitraums im Bereich von 24 bis 48 Stunden, wobei sie jedoch während eines Zeitraums von mindestens 3 Tagen, welcher auf 1 Woche oder mehr verlängert werden kann, auf einer relativen Feuchtigkeit der Umgebung gehalten werden sollten, falls eine verlängerte Lagerung gewünscht ist. Es scheint die Tendenz vorzuliegen, dass somatische Embryonen bei einer milden Trocknungsbehandlung während mindestens 6 bis 8 Wochen reifen müssen, um eine schnelle sekundäre Trocknung zu überleben. Dies wird später ausführlicher dargelegt.

Charakteristiken von auf einen niedrigen Feuchtigkeitsgehalt stark getrockneten somatischen Embryonen

Primär weisen stark getrocknete somatische Embryonen einen Feuchtigkeitsgehalt auf, der geringer ist als der Feuchtigkeitsgehalt von entsprechenden zygotischen Embryonen aus einer trockenen Saat. Somit liegt der Feuchtigkeitsgehalt von getrockneten somatischen Embryonen, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, für gewöhnlich im Bereich zwischen 10 und 36 Gew.-%. Der bedeutende Feuchtigkeitsgehalt, welcher das gesamte freie Wasser entfernt, ist in der Tat der, welcher ein Gefrieren ohne Beschädigung ermöglicht, d. h. vorzugsweise unterhalb ungefähr 36%. Das erreichte Trocknungsniveau ist abhängig von dem verwendeten Verfahren der sekundären Trocknung. Im Labor getrocknete Embryonen können eine weit geringere Feuchtigkeit besitzen, vorzugsweise zwischen 10 und 30 Gew.-%, in Abhängigkeit von der relativen Feuchtigkeit und Temperatur der Umgebung. Ferner ist das Trockengewicht von somatischen Koniferenembryonen in der Folge einer sekundären Trocknung für gewöhnlich 30 bis 600% höher als das Gewicht von entsprechenden zygotischen Embryonen. Auch ist die Menge an in stark getrockneten somatischen Embryonen gefundenen Speicherlipiden 50 bis 700% höher als die von entsprechenden zygotischen Embryonen, während Fettsäuren und Polypeptidspeicherreserven aufgezeigt wurden, die ähnlich sind zu denen von entsprechenden zygotischen Embryonen. Auch besitzen die sekundär getrockneten somatischen Embryonen große Proteinkörper ebenso wie ausgiebige Lipidkörper.

Gefrierresistenz von stark getrockneten Embryonen

Es existiert eine Analogie zwischen einer Resistenz gegenüber Trocknung und einer Resistenz gegenüber Gefrieren. Gewebe, welche in der Lage sind, ein Gefrieren in flüssigem Stickstoff zu überleben, werden als fähig erachtet, eine nachfolgende Lagerung über unbegrenzte Zeiträume zu überleben. Zum Beispiel wurden somatische Embryonen, die während 8 Wochen mit 7,5% an PEG und 16 uM an ABA reiften, in Umgebungen mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% oder 63% gegeben, um eine starke Trocknung zu erreichen. Somatische Embryonen aus der Umgebung mit 63% wurden zuerst 1 Woche bei 81% gehalten. Die Gesamtzeit der sekundären Trocknung betrug 2 bis 3 Wochen. In der Folge dieser Behandlungen wurden die somatischen Embryonen auf ihren Filterpapierträgern mit einem Kulturmedium der 1/2-Stärke imbibiert, über Nacht in einem Gefriergerät bei -20ºC gelagert oder in flüssigen Stickstoff eingetaucht, dann entfernt und sofort über Nacht in das Gefriergerät transferiert. Gefrorene Embryonen wurden am nächsten Tag imbibiert.
Es wurden Überlebenshäufigkeiten verwendet, um die Wirksamkeit von einigen der Behandlungen, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, zu bestimmen. Somit wird der Begriff "Überleben", wenn er hierin verwendet wird, definiert als: Embryonen, die innerhalb der ersten Woche der Kultivierung grün werden oder eine beginnende Verlängerung aufzeigen. Embryonen, die während 8 Wochen reiften, überlebten eine starke Trocknung in den Umgebungen mit 81% und 63% mit gleich hohen Häufigkeiten (z. B. 70-100%). Embryonen überlebten auch ein Gefrieren bei -20ºC, jedoch waren die Häufigkeiten für Embryonen, welche in der Umgebung mit einer relativen Feuchtigkeit von 63% getrocknet wurden, besser (96%) als vergleichsweise mit 44% für Embryonen, die lediglich in der Umgebung mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% getrocknet wurden. Embryonen, die in flüssigem Stickstoff gefroren wurden, überlebten mit leicht geringeren Häufigkeiten, da ungefähr 1-4% der Embryonen während des schnellen Gefrierprozesses aufspalteten oder zersprangen. Dieses Problem kann überwunden werden, indem die Embryonen nach einem anfänglichen Gefrieren auf -20ºC in flüssigen Stickstoff transferiert werden. In der Folge aller Gefriermethoden wurden normale Pflänzchen rückgewonnen.

Charakteristiken von imbibierten somatischen Embryonen

Imbibierte somatische Embryonen besitzen einen Feuchtigkeitsgehalt, der im allgemeinen im Bereich zwischen 59 und 65% liegt.

Einkapselung von getrockneten somatischen Embryonen in einem nichthydratisierten Polymer

Eines der neuen Elemente einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt in der Tatsache, dass PEG nicht als ein hydratisiertes Gel zum Einkapseln verwendet wird, sondern dass es geschmolzen wird und zum Einkapseln von getrockneten somatischen Embryonen verwendet wird, ohne eine Rehydratisierung zu bewirken. Getrocknete somatische Embryonen, vorzugsweise aus der Familie Pinaceae und am meisten bevorzugt aus der Gattung Picea, können unter Verwendung der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung eingekapselt werden. Es können andere Verbindungen verwendet werden, welche ähnliche Eigenschaften wie PEG besitzen. Es ist erforderlich, dass die zum Einkapseln verwendete Verbindung eine nichthydratisierte wasserlösliche Verbindung ist, welche einen Schmelzpunkt im Bereich zwischen 20 und 70ºC besitzt, obwohl Polymere wie PEG bevorzugt sind.
PEG ist ein wasserlösliches wachsartiges Polymer, welches nichttoxisch, schwer metabolisierbar und in hohem Maße resistent ist gegenüber Angriffen von Organismen (z. B. Pilze, Bakterien, tierische Schädlinge usw.). Es wird derzeit verwendet, um die Wachstumskraft von Sämlingen durch ein osmotisches Initialisieren der Samen zu fördern, so dass es für ein Einkapselungsmittel ideal sein sollte.
Vor einem Testen von PEG als ein geeignetes Mittel zum Einkapseln wurde zuerst der Effekt von hohen Konzentrationen an PEG auf eine Embryonenkeimung getestet. Dies wurde unter Verwendung der Technik der osmotischen Initialisierung (osmotic priming) durchgeführt. Die osmotische Initialisierung ist ein Verfahren zur kontrollierten Hydratisierung, in welcher der physiologische Prozess der Keimung initiiert wird, jedoch vor einem Auftauchen der Keimwurzel gestoppt wird. Natürliche Samen verlieren Wachstumskraft während einer Lagerung, und es kann ein Zelltod als ein Ergebnis einer schnellen Wasseraufnahme während der ersten Minuten der Imbibierung auftreten. PEG und andere Osmotika wurden verwendet, um den gesamten Samen osmotisch zu initialisieren, um eine Keimung zu synchronisieren und eine Wachstumskraft der Sämlinge zu verbessern. Das Verfahren beinhaltet ein Eintauchen der Samen in osmotische Lösungen von ausreichender osmotischer Stärke, um den Samen zu ermöglichen, Wasser aufzunehmen und einen Metabolismus wiederherzustellen, wobei jedoch eine Keimung verhindert wird. Es kann eine Beschädigung durch Imbibieren verringert oder verhindert und jegliche Zellschädigung repariert werden. Somit wird eine vollständige Wachstumskraft nach einem Entfernen des Osmotikums wiederhergestellt (Powell and Mathews, 1978; Bodsworth and Bewley, 1979; Woodstock and Tao, 1981).
Eine Untersuchung von aufgeschnittenen somatischen und zygotischen Weißfichtenembryonen unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops zeigte, dass getrocknete zygotische Embryonen mehrere Tage benötigen, um vollständig zu imbibieren, da sie eingeschlossen sind innerhalb von Samenumhüllungen und anderen Strukturen. Eine Imbibierung von somatischen Embryonen, welche zu niedrigen Feuchtigkeitsgehalten getrocknet sind, findet im Gegensatz dazu innerhalb von 1 bis 2 Stunden statt. Eine solche schnelle Imbibierung kann zu einer Beschädigung führen. Stark getrocknete somatische Embryonen wurden osmotisch initialisiert durch deren Imbibieren in einem flüssigen Medium, welches 30% PEG enthält, während 3 Tagen vor einem Transfer zu einem PEG-freien Medium. Die Überlebenshäufigkeiten waren ähnlich zu nichtinitialisierten Behandlungen, was die Abwesenheit einer Toxizität von hohen PEG-Niveaus auf eine Keimung aufzeigt; ferner erschien eine Wurzelverlängerung der mit PEG behandelten Embryonen verbessert.
PEG verschiedener molekularer Bereiche variiert hinsichtlich des Schmelzpunkts. Der höchste liegt bei lediglich ungefähr 66ºC. PEG wurde als geeignet für ein Einkapselungsmittel angesehen, da es geschmolzen und auf getrocknete Embryonen angewendet werden konnte, ohne eine Rehydratisierung der Embryonen zu bewirken. Es wurde PEG mit verschiedenen Molekulargewichten einzeln oder vermischt verwendet, um gewünschte Eigenschaften zu erreichen, oder es wurden verschiedene Arten in verschiedenen Schichten angewendet (z. B. ein Embryo, der mit einem weichen Wachs beschichtet ist, umgeben von einer harten Wachsschicht). Tabelle 2
Daher kann PEG mit Molekulargewichten von über 1000 und vorzugsweise zwischen 1000 und 3000 verwendet werden. Embryonen, die auf niedrige Feuchtigkeitsgehalte getrocknet sind, werden als resistent gegenüber extremen Temperaturen angesehen, so dass sie durch ein kurzes Einwirken von geschmolzenem PEG nicht geschädigt werden sollten; jedoch können PEG-Arten mit niedrigeren Schmelzpunkttemperaturen bevorzugt sein und sind weniger viskos, so dass sie die Embryonen einfacher umfließen und beschichten können. PEG 1000-4000 und deren. Mischungen sind ideal. PEG 1000 ist weich und geschmeidig. PEG 4000 ist härter und brüchiger. In PEG eingekapselte Embryonen sollten ähnlich wie beim osmotischen Initialisieren vor einer Beschädigung durch Imbibierung geschützt sein. Wenn somit die PEG-Kapsel sich um den Embryo in der Lösung auflöst, erzeugt sie einen osmotischen Druck. Dieser Druck würde sich Null annähern, wenn das PEG vollständig dispergiert wird, und würde den Effekt einer Verhinderung der schnelleren Imbibierung besitzen, welche ansonsten in Abwesenheit von einer PEG-Einkapselung auftreten würde. Die Kapseln benötigen bis zu 8 Stunden zum Auflösen, wenn sie auf einem Agargelmedium plaziert werden.
Es können zahlreiche Hilfsmittel dem PEG zugegeben werden, um das Etablieren des Sämlings zu unterstützen. Solche Hilfsmittel können folgende einschließen: eine Kohlenstoffquelle wie Sucrose oder Glucose usw. (myo-Inositol erwies sich als am wenigsten resistent gegenüber einem Karamelisieren während einem längeren Erwärmen mit PEG mit höherem Schmelzpunkt), Aktivkohle, Psiliumsaatpulver zum Binden von Wasser nach einer Rehydratisierung, Fungizide und Insektizide, welche in Pulverform zugegeben werden, Mikroorganismen, organische Energiereserven und Enzyme wie Stärke und α-Amylase (Kapseln können von anderen Polymeren umgeben sein, wie Gelatine, oder vermischt mit unlöslichen Wachsen, wobei beide davon wahrscheinlich eine zeitlich langsamere Freigabe von Embryonen aus den Kapseln ergeben würden), Aminosäuren (z. B. Glycin), Pflanzenwachstumsregulatoren. Ein Beispiel des Einkapselungsverfahrens der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend aufgezeigt.
Es wurden Formen hergestellt durch Bohren von flachen Vertiefungen in ein 4 mm dickes Blatt aus Silikongummi (es können andere Arten von Formen geeignet sein). Vor einer Verwendung zum Einkapseln wurden die Gummiformen mit Alkohol sterilisiert, der dann bis zur Trockne verdampft wurde.
Es wurden PEG 6000, 4000 und 1000 und eine gleiche Mischung aus 4000 : 1000 getestet, wobei PEG 1000 bevorzugt ist. Das PEG wurde bis oberhalb des Schmelzpunkts erwärmt. Das geschmolzene PEG wurde hitzesterilisiert, indem es während mindestens 1/2 Stunde auf seinem Siedepunkt oder etwas darunter gehalten wurde. Das PEG sollte vor einer Embryoeinkapselung auf gerade oberhalb seines Schmelzpunkts gekühlt werden. Eines der Schlüsselelemente des Einkapselungsverfahrens ist es, sicherzustellen, dass die Embryonen mit der nichthydratisierten wasserlöslichen Verbindung bei einer Temperatur geringfügig oberhalb des Schmelzpunkts der nichthydratisierten wasserlöslichen Verbindung eingekapselt werden, um so ein schnelles Verfestigen der Beschichtung zur Verfügung zu stellen, um ausgehärtete Kapseln zu ergeben, welche die Embryonen enthalten.
Als erstes wird ein kleiner Tropfen an PEG zu den Vertiefungen der Form gegeben. Somatische Embryonen, welche langsam auf einen niedrigen Feuchtigkeitsgehalt bei einer relativen Feuchtigkeit von 63% getrocknet wurden, wurden von den Filterpapierträgern entfernt und einzeln in die Vertiefungen gegeben, und es wurde ein Tropfen von geschmolzenem PEG zugegeben, um die Embryonen einzuschließen. Das Volumen der synthetischen Samen betrug ungefähr 30 ul. Nachdem sich das PEG verfestigt hatte, wurden die eingekapselten getrockneten Embryonen aus der Form entnommen und bei Raumtemperatur oder im Gefriergerät gelagert. Für eine Keimung wurden die synthetischen Samen auf Filterpapiere gegeben, welche auf verfestigtes Pflänzchenregenerationsmedium gegeben wurden. Das Überleben in der Folge einer Einkapselung betrug 93%. Nach einer Woche im Gefriergerät überlebte dieselbe Charge mit einer Häufigkeit von 83%. Es wurden normale Pflänzchen rückgewonnen. Eine Rückgewinnung von Pflänzchen nach einem direkten Einpflanzen der Kapseln in den Boden wurde bis jetzt nicht getestet.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Untersuchung der Wirkungen eines nichtplasmolysierenden induzierten Feuchtigkeitsentzugs auf die Reifung und das überleben der Trocknung von somatischen Weißlichtenembryonen und Bestimmung der Lipidzusammensetzung von reifen und getrockneten Embryonen

A. REIFUNG UND TRQCKNUNG

Herkunft der Materialien und Kulturmedien

Die flüssige Kultur von Weißlichte (Linie WS1) wurde initiiert und aufrechterhalten auf einem Grundmedium BM (basal medium)), wie zuvor berichtet (Attree, Dunstan and Fowke, 1989; Attree et al., 1990).
Das zur Aufrechterhaltung verwendete BM war das von Arnold und Eriksson (1981) und enthielt auch 1% an Sucrose, 9 uM an 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 4,5 uM an Benzyladenin (BA). Das Reifungsmedium bestand aus BM mit halber Stärke, welches 90 mM an Sucrose und 16 uM an (±) ABA (Sigma, Produktnummer A 2784) enthielt, verfestigt mit 0,8% Agar (Difco Bitek). Eine Stammlösung an ABA wurde filtersterilisiert und nach einem Behandeln im Autoklaven zu dem gekühlten Medium gegeben. Das Pflänzchenregenerationsmedium bestand aus BM mit halber Stärke mit 60 mM an Sucrose, 0,6% an Agar und besaß keine Pflanzenwachstumsregulatoren (PGRs). Alle obigen Medien wurden auf pH 5,7 eingestellt. Es wurden Kunststoffpetrischalen (10 cm) verwendet, welche 15-20 ml an Medium enthielten. Die Schalen wurden mit Parafilm (American Can Co.) versiegelt und die Kulturen wurden bei 25ºC inkubiert. Die osmotischen Potentiale der Medien wurden unter Verwendung eines Dampfdruckpsychrometers (Modell Nr. 5130, Wescor Inc., Logan, Utah) aufgrund seiner größeren Genauigkeit bei PEG-Lösungen bestimmt (Michel und Kaufmann, 1973).

Reifung somatischer Embryonen und sanfte Trocknung

Die Reifung von somatischen Embryonen wurde durchgeführt unter Verwendung der von Attree et al. (1990) modifizierten Verfahren. Suspensionskultivierte somatische Embryonen wurden gewaschen und resuspendiert (20% Gewicht/Volumen) in einem PGR-freiem BM von halber Stärke, welches 3% an Sucrose enthielt, um die vorherigen PGRs zu entfernen, dann wurden Aliquote von 0,75 ml auf Filterpapierträger (Whatman Nr. 2) auf der Oberfläche eines Reifungsmediums pipettiert. Die Träger erleichterten einen anschließenden Transfer auf frische Medien. Zur Bestimmung der mittleren Anzahl an plattierten somatischen Embryonen wurden 10 ul-Proben der 20%-Suspension mit Acetocarmin (B.D.H.) angefärbt und ausgezählt (15mal wiederholt). Die plattierten somatischen Embryonen wurden während 4 Wochen in Dunkelheit auf dem Reifungsmedium gehalten. Zum Test der Wirkung von erhöhtem Osmotikum wurden die folgenden Konzentrationen an PEG-4000 (Fluka AG) in das Reifungsmedium eingebracht; 0, 2,5, 5,0, 7,5 und 10% (Gewicht/Volumen) (25 Wiederholungen pro Behandlung). Reifungshäufigkeiten pro Behandlung wurden berechnet als die mittlere prozentuale Anzahl an somatischen Embryonen, welche zu normal aussehenden Kotyledonarembryonen reiften. Ergebnisse von Reifungshäufigkeiten sind in Fig. 1 aufgezeigt (± Vertrauensgrenzen, P = 0,05)
Die Anwendung von PEG-4000 in der Gegenwart von 16 uM an ABA während 28 Tagen förderte die Reifung von somatischen Weißlichtenembryonen (Fig. 1). Die mittlere Anzahl an unreifen somatischen Embryonen, die pro Wiederholungsversuch plattiert wurden, betrug 560, und die Reifungsergebnisse basieren auf einer Gesamtheit von 4087 wiedergewonnenen reifen Embryonen. Die optimale PEG-Konzentration lag innerhalb des Bereichs von 5,0-7,5%. PEG bei 7,5% führte zu einer dreifachen Erhöhung der Reifungshäufigkeit, im Vergleich mit der Kontrollprobe, und ergab eine mittlere Gesamtreifungshäufigkeit von 9%. Zusätzlich führte eine Reifung in Gegenwart von 5% PEG oder mehr zur Abwesenheit einer anhaltenden embryogenen Kallusproliferation, welche bei den Behandlungen mit 0 und 2,5% an PEG trotz der Gegenwart von ABA auftrat.
In vorläufigen Experimenten wurde Sucrose bei 6 und 9% getestet. Ein visueller Vergleich zeigte, dass 6% Sucrose geringere Reifungshäufigkeiten ergab als 3% Succrose allein, während 9% Sucrose zu keinem Wachstum führte; daher wurde eine erhöhte Sucrose nicht weiter getestet. Das osmotische Potential der PEG-Medien nahm nicht- linear ab, wobei es bei den getesteten höheren Konzentrationen weniger stark abfiel (Fig. 1). Das osmotische Potential des Reifungsmediums mit 7,5% PEG (welches ebenfalls Mediumsalze und 3% an Sucrose enthielt) betrug -0,7 MPa, was äquivalent war zu dem osmotischen Potential des Reifungsmediums, welches 9% an Sucrose enthielt. Das osmotische Potential von -0,61 MPa für ein Reifungsmedium, welches 5% an PEG enthielt, war ungefähr äquivalent zu dem, welches 7% an Sucrose enthielt.

Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts und Trockengewichts von sanft Qetrockneten reifen somatischen Embryonen

Somatische Embryonen aus verschiedenen PEG-Behandlungen wurden gewogen (hydratisiertes Gewicht), während 3-4 Tagen in einem Ofen bei 60ºC getrocknet und dann ihre Trockengewichte aufgezeichnet. Die Trockengewichte wurden verwendet zur Bestimmung der Feuchtigkeitsgehalte der sanft getrockneten somatischen Embryonen. Die Messungen wurden 6- bis 12mal wiederholt in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit der somatischen Embryonen, und es wurden 20 somatische Embryonen pro Wiederholungsversuch verwendet. Es wurden auch zygotische Embryonen aus nichtimbibiertem reifem Samen geschnitten, gewogen, in destilliertem Wasser imbibiert, dann erneut gewogen (dreimal wiederholt mit 40 Embryonen pro Wiederholungsversuch). Die hydratisierten (somatischen) nichtimbibierten (zygotischen) und Trockengewichte wurden verwendet, um die Feuchtigkeitsgehalte der zygotischen und somatischen Embryonen zu bestimmen.
Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, nahmen die Trockengewichte von reifen, sanft getrockneten somatischen Embryonen mit einer Erhöhung der PEG-Konzentration zu, während die Feuchtigkeitsgehalte abnahmen (± Vertrauensgrenzen, P = 0,05). Die Trockengewichte von mit PEG behandelten somatischen Embryonen nahmen von 0,17 auf 0,27 mg pro Embryo zu. Die zygotischen Embryonen besaßen Trockengewichte von 0,15 ± 0,01 mg pro Embryo. Die hydratisierten somatischen Embryonen, die mit PEG reiften, besaßen mittlere Feuchtigkeitsgehalte vor einer weiteren Trocknung von 41-45%. Die Kontrollversuche besaßen zum Vergleich mittlere Feuchtigkeitsgehalte von 57%.

Nachreifen, sekundäre Trocknung zu einem niedrigen Feuchtigkeitsgehalt und Pflänzchenregeneration

Zur Bestimmung der Wirkungen von PEG, ABA und einer sekundären Trocknung zu einem niedrigen Feuchtigkeitsgehalt auf ein Überleben von somatischen Embryonen und einer Pflänzchenregeneration, d. h. einer Trocknungsresistenz, wurden somatische Embryonen, welche mit oder ohne 7,5% an PEG reiften, wie folgt behandelt (fünfmal pro Behandlung wiederholt): direktes Keimen; Durchführen einer Nachreifungsbehandlung (kein ABA, siehe unten) und dann Keimen; Durchführen einer Nachreifungsbehandlung, sekundäre Trocknung bei einer relativen Feuchtigkeit von 81% (siehe unten), dann Keimen; oder direkte sekundäre Trocknung (d. h. kein Nachreifen), dann Keimen (siehe Tabelle 3).

Nachreifen

Ein Nachreifen wurde erreicht durch Transferieren der gesamten somatischen Embryokulturen mittels ihrer Filterpapierträger auf ein Pflänzchenregenerationsmedium (welches kein ABA enthält) während 14 Tagen in Dunkelheit, wie zuvor beschrieben (Attree et al., 1990). Ein Nachreifen der Kulturen, welche mit PEG reiften, wurde durchgeführt unter Verwendung eines Pflänzchenregenerationsmediums, welches dieselbe PEG-Konzentration wie die bei der Reifung enthielt.

Langsame sekundäre Trocknung

Der Effekt von PEG auf eine Trocknungsresistenz wurde getestet, indem vierwöchige reife somatische Embryonen von allen PEG-Konzentrationen den Umgebungen mit 81, 63 und 43% relativer Feuchtigkeit ausgesetzt wurden (pro Behandlung 7 bis 15mal wiederholt).
Eine sekundäre Trocknung auf verschiedene Grade an Feuchtigkeitsgehalt wurde erreicht, indem reife somatische Embryonen durch eine Reihe von Umgebungen mit zunehmend geringerer relativer Feuchtigkeit transferiert wurden, wie von Senaratna et al. (1989) beschrieben. Es wurden die folgenden in Exsikkatoren enthaltenen gesättigten Salzlösungen verwendet, um die entsprechenden relativen Feuchtigkeiten zu erzeugen (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, relative Feuchtigkeit 81%; NH&sub4;NO&sub3;, relative Feuchtigkeit 63%; K&sub2;CO&sub3;, relative Feuchtigkeit 43%. Reife sanft getrocknete somatische Embryonen wurden auf ihren Filterpapierträgern auf unverschlossene Petrischalen transferiert, welche dann in den Exsikkator mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% gegeben wurden. Für eine relative Feuchtigkeit von weniger als 81% wurden die Petrischalen, welche die Kulturen enthielten, sukzessive zu den Exsikkatoren mit der niedrigeren relativen Feuchtigkeit in Intervallen von 3-4 Tagen transferiert, um die Trocknungsrate zu reduzieren. Alle Kulturen wurden während eines Minimums von 7-10 Tagen bei der endgültigen erforderlichen relativen Feuchtigkeit gehalten. Die Gesamtzeiten der sekundären Trocknungsbehandlung betrugen 14 Tage.
In der Folge einer sekundären Trocknung besaßen nichtimbibierte und imbibierte somatische Embryonen Feuchtigkeitsgehalte im Bereich von 20-31% bzw. 56-65% (Tabelle 3). Mittlere Feuchtigkeitsgehalte in direkter Folge der Behandlung bei einer relativen Feuchtigkeit von 81% waren geringfügig höher als solche in der Folge der Behandlung bei einer relativen Feuchtigkeit von 43% und sehr nahe an solchen für nichtimbibierte zygotische Embryonen. Somatische Embryonen von den verschiedenen osmotischen Behandlungen besaßen ähnliche Feuchtigkeitsgehalte nach einer sekundären Trocknung. Die Kontrollen, welche ohne PEG reiften, unterlagen dem größten Feuchtigkeitsverlust während einer sekundären Trocknung. Imbibierte zygotische Embryonen besaßen Feuchtigkeitsgehalte von 62% und imbibierte somatische Embryonen besaßen Feuchtigkeitsgehalte von 56-65%. TABELLE 3 Feuchtigkeitsgehalt (% ± Vertrauensgrenzen, P = 0,05) von getrockneten nichtimbibierten und getrockneten imbibierten somatischeri und zygotischen Weißlichtenembryonen. Die somatischen Embryonen wurden in verschiedenen PEG- Konzentrationen (%) gereift, dann wurde eine Trocknungsbehandlung bei einer relativen Feuchtigkeit von 43 oder 81% angewendet.

Pflänzchenrecreneration infolge einer langsamen sekundären Trocknung

Eine Pflänzchenerzeugung wurde untersucht an somatischen Weißlichtenembryonen, welche während 28 Tagen mit 16 uM und 5,0% an PEG reiften. Somatische Embryonen, welche auf niedrige Feuchtigkeitsgehalte getrocknet waren, wurden in Petrischalen imbibiert, indem die Filterpapierträger mit einem flüssigen Pflänzchenregenerationsmedium geflutet wurden. Die Schalen wurden dann mit Parafilm versiegelt und unter wenig Licht [2 Wm&supmin;², Photoperiode von 12 Stunden, kaltweiße Leuchtstofflampen mit 20 W (Westinghouse)] gestellt. Diejenigen, welche überlebten und eine Entwicklung zu Pflänzchen begannen, wurden gewertet und wurden 7-14 Tage nach einer Rehydratisierung auf frisches verfestigtes Pflänzchenregenerationsmedium transferiert.
Somatische Embryonen, auf welche keine sekundäre Trocknungsbehandlung angewendet wurde, wurden in der Folge der Reifungs-/Nachreifungsbehandlungen einzeln von den Kulturen separiert. Sie wurden horizontal auf frisches Pflänzchenregenerationsmedium gegeben und bei einer geringen Lichtintensität (wie oben) gehalten.
Mit 0, 5,0 und 7,5% an PEG gereifte somatische Embryonen aus den Behandlungen bei einer relativen Feuchtigkeit von 81 und 43% wurden gewogen (nichtimbibiertes Gewicht), während 5 Stunden mit einem Keimungsmedium imbibiert, dann sanft getrocknet und erneut gewogen (imbibiertes Gewicht), vor einer Bestimmung der Trockengewichte. Diese Messungen wurden drei- bis sechsmal pro Behandlung mit 20 somatischen Embryonen pro Wiederholungsversuch wiederholt.

Nachreifen und langsame sekundäre Trocknung

Die Erscheinung von reifen somatischen Embryonen und regenerierten Pflänzchen ist in Fig. 3 aufgezeigt. Alle sekundären Trocknungsbehandlungen führten zu somatischen Embryonen mit einer trockenen und geschrumpften Erscheinung, wie in Fig. 3A aufgezeigt (Balken: 2 mm). Nach der Anwendung eines flüssigen Mediums imbibierten somatische Embryonen Wasser und erreichten innerhalb von 2 Stunden wieder eine gequollene Erscheinung (Fig. 3B). Überlebende, welche unter wenig Licht gehalten wurden, entwickelten sich innerhalb von 7 Tagen zu Pflänzchen, wie in Fig. 3C ersichtlich (Balken: 5 mm). Das Timing der langsamen sekundären Trocknungsbehandlung war kritisch (Tabelle 4). TABELLE 4 Gesamteffekte einer Reifungsbehandlung, (16 uM an ABA ± 7,5% an PEG während 28 Tagen), einer ABA-freien Nachreifung (14 Tage) und einer sekundären Trocknungsbehandlung (14 Tage) bei einer relativen Feuchtigkeit von 81% auf das Überleben und die Pflänzchenregeneration von somatischen Weißlichtenembryonen.
(+) regenerierte Pflänzchen;
(-) kein Überleben des Embryos.
Somatische Embryonen überlebten anfänglich die Behandlung bei einer relativen Feuchtigkeit von 81% nur, wenn die Behandlung direkt angewendet wurde in der Folge eines Transfers der somatischen Embryonen von dem ABA- Reifungsmedium (mit oder ohne PEG). Wenn somit somatische Embryonen, welche mit 7,5% an PEG reiften, direkt weiter getrocknet wurden, entwickelten sich die somatischen Embryonen zu Pflänzchen. PEG gereifte somatische Embryonen entwickelten sich nicht weiter in der Abwesenheit einer sekundären Trocknungsbehandlung, sondern quollen an und verglasten. Wie in Fig. 3D ersichtlich ist, haben sich die Achsen der somatischen Embryonen nicht normal verlängert, das Pflänzchen ist verglast und die Wurzel ist nekrotisch (Balken: 3 mm). Diejenigen PEG gereiften Embryonen, welche einer Nachreifung anstatt einer sekundären Trocknung unterzogen wurden, entwickelten sich zu Pflänzchen mit gequollener Basis und keinen Wurzeln. Somit fand eine normale Regeneration von PEG gereiften Embryonen nur statt, wenn die Embryonen anschließend auf niedrige Feuchtigkeitsgehalte getrocknet wurden. Ferner war eine sekundäre Trocknung in der Folge einer Nachreifung in Abwesenheit von ABA (mit oder ohne PEG) für alle Embryonen letal.

Effekt einer langsamen sekundären Trocknung auf Filterpaperträger

Somatische Embryonen überlebten eine sekundäre Trocknung mit hoher Häufigkeit, wenn die Embryonen getrocknet wurden, während sie als gesamter Kallus auf den Filterpapierträgern gehalten wurden und in eine unverschlossene Petrischale in einer Umgebung mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% gegeben wurden. Es wurde auch festgestellt, dass somatische Embryonen eine sekundäre Trocknung in einer nichtverschlossenen Petrischale, welche in eine Umgebung mit relativer Feuchtigkeit von 81% gegeben wurde, nicht überlebten, wenn sie von dem Hauptkallus und den Filterpapierträgern entfernt wurden. Da in dem ersteren eine langsamere Trocknung stattfand, ließen diese Experimente somit vermuten, dass somatische Embryonen nicht resistent sind gegenüber einer schnellen Trocknung zu niedrigen Feuchtigkeitsgehalten. Es wurde jedoch anschließend herausgefunden, dass somatische Embryonen eine schnelle sekundäre Trocknung zu niedrigen Feuchtigkeitsgehalten überleben können; wenn ferner somatische Embryonen, welche während 8 Wochen mit 16 uM an ABA und 7,5% an PEG reiften, von dem Hauptkallus getrennt wurden, aber auf demselben Filterpapier neben dem gesamten Kallus plaziert wurden, überlebten somatische Embryonen eine langsame sekundäre Trocknung (relative Feuchtigkeit von 81%) mit hoher Häufigkeit, wobei jedoch die wiedergewonnene Pflänzchen abnormal waren - die Embryonen verlängerten sich nicht normal, sondern blieben verkümmert. Dies wurde überwunden, wenn die reifen somatischen Embryonen vor einer weiteren Trocknung von dem Kallus entfernt und in einem Kulturmedium, welches ABA und PEG enthielt, gewaschen wurden, dann auf ein mit demselben Medium befeuchtetes Filterpapier gegeben wurden.

Überleben und Pflänzchenregeneration in der Folge einer sekundären langsamen Trocknung zu niedrigen Feuchtigkeitsgehalten

Tabelle 5 zeigt, dass ein überleben und eine Pflänzchenregeneration von somatischen Embryonen im allgemeinen mit zunehmender Stärke der sekundären Trocknungsbehandlung verringert sind für somatische Embryonen, welche während lediglich 4 Wochen reiften. TABELLE 5 Regneration (% ± Standardfehler) von Pflänzchen von somatischen Weißlichtenembryonen, welche in Gegenwart von verschiedenen prozentualen Konzentrationen an PEG (alle mit 16 uM an ABA) reiften, dann weitergetrocknet wurden bei Klimabedingungen mit verschiedenen prozentualen relativen Feuchtigkeiten (r. h.)
Kontrollen (keine PEG-Behandlung oder sekundäre Trocknung) entwickelten Pflänzchen mit einer Häufigkeit von 43% (Standardfehler ± 12%). Die Einbeziehung von PEG während der Reifungsphase beeinflusste das Überleben der Trocknung der somatischen Embryonen nicht in großem Maße; jedoch waren die Ergebnisse innerhalb der Behandlungen sehr variabel. Das höchste Mittel beim Überleben und bei der Pflänzchenregeneration bei einer relativen Feuchtigkeit von 81% trat auf bei den mit 2,5% an PEG gereiften somatischen Embryonen (62%). Das Überleben der anderen osmotischen Behandlungen lag innerhalb des Bereichs von 34-44%. In der Folge der Behandlung bei einer relativen Feuchtigkeit von 43% war ein Überleben geringer als 10% für alle osmotischen Behandlungen und weniger als 1% für die bei 10% PEG gereiften Embryonen. Obwohl somatische Embryonen, welche ohne PEG reiften, zu Pflänzchen regenerierten, waren diese oft aberrant, insbesondere in der Folge der stärkeren sekundären Trocknungsbehandlungen bei niedriger relativer Feuchtigkeit. Zum Beispiel war eine Wurzelbildung verzögert, nicht alle Kotyledone verlängert und die Hypokotyle waren oft infolge einer Verlängerung geringelt. Es wurde auch beobachtet, dass die somatischen Embryonen, welche ohne PEG reiften, nach einem Transfer von dem ABA-Medium nicht ruhend blieben, sondern während der ersten wenigen Tage der sekundären Trocknungsbehandlung grün wurden und einer frühreifen Keimung unterlagen. Somatische Embryonen von den anderen osmotischen Behandlungen blieben während der sekundären Trocknung ruhend.

Effekt der Kulturzeit auf eine Resistenz gegenüber einer langsamen und schnellen sekundären Trocknung

Es war interessant zu beobachten, ob diese somatischen Embryonen resistent gegenüber einer schnellen sekundären Trocknung wie einem Trocknen auf der Laborbank bei umgebender relativer Feuchtigkeit waren. Ein Trocknen im Labor ist einfacher durchzuführen als ein Trocknen in kontrollierten Umgebungen. Es war auch interessant zu bestimmen, ob es eine spezielle Reifungsperiode gab, welche für ein überleben optimal war. Daher wurden somatische Embryonen, welche während 4, 5, 6, 7 und 8 Wochen auf einem Medium, das 16 uM an ABA und 7,5% an PEG enthielt, reiften, jeweils auf ihren Filterpapierträgern entweder transferiert auf sterile Petrischalen, welche während 3 Tagen unverschlossen auf der Laborbank gehalten wurden, oder in einen Exsikkator mit einer relativen Feuchtigkeit von 50-81% für ein langsames Trocknen während 2 Wochen. Die relative Feuchtigkeit der Umgebung betrug ungefähr 35% während der Zeit der Lufttrocknungsexperimente und die Labortemperatur betrug betrug 20-25ºC. Pro Behandlung wurden 10-17 Wiederholungsversuche hergestellt. Nach einer sekundären Trocknung waren die somatischen Embryonen hart und trocken. Die somatischen Embryonen wurden dann wie zuvor mit einem PGR-freien Medium mit halber Stärke imbibiert und nach 2-3 Wochen für eine Pflänzchenregeneration gewertet. Die Ergebnisse (± Standardfehler) sind in Fig. 15 aufgezeigt.
Aus Fig. 15 ist ersichtlich, dass somatische Embryonen mit einer Häufigkeit von ungefähr 60% langsame sekundäre Trocknungsbehandlungen nach einer Reifung von 4 Wochen überlebten und zu Pflänzchen regenerierten. Diese Häufigkeit verbesserte sich geringfügig weiter in der Folge einer sechs-, dann achtwöchigen Reifung, wobei eine Pflänzchenregeneration im Bereich von 80% erreicht wurde. Somatische Embryonen, welche während lediglich 4 Wochen reiften, dann bei einer relativen Feuchtigkeit der Umgebung schneller weitergetrocknet wurden, regenerierten sich nicht zu Pflänzchen. Bei diesen Embryonen überlebte oft der Wurzelmeristem und entwickelte eine Wurzel, jedoch der Sprossscheitel war abgestorben, verblieb deshalb weiß und verlängerte sich nicht. An der Luft schnell getrocknete somatische Embryonen waren in der Lage, sich nach einer Reifung von 5 und 6 Wochen zu Pflänzchen zu regenerieren, jedoch mit geringer Häufigkeit (weniger als 10 bzw. 25%). Durch die 7. Woche der Reifung überlebten diese somatischen Embryonen und regenerierten sich zu Pflänzchen mit einer Häufigkeit von knapp über 60%. Somit wird aus diesem Diagramm deutlich, dass eine optimale Trocknungsresistenz für ein Trocknen zu geringen Feuchtigkeitsniveaus nach einem Minimum von 7 Wochen der Reifung in der Gegenwart von ABA und keinem eindringendem Osmotikum erreicht wird. Die Qualität der regenerierten Pflänzchen in der Folge der schnellen sekundären Trocknungsbehandlung war gut, und es erschien so, dass eine Wurzelverlängerung oft früher auftrat und kräftiger war in der Folge einer schnellen Trocknung.

Bestimmung der Molekülgrößengrenze für gelöste Stoffe für eine Förderung der Reifung von somatischen Weißlichtenembryonen während einer primären Behandlung einer sanften Trocknung und Reifung

Zur Bestimmung des wirksamen Molekulargewichts und Größenbereichs von gelösten Stoffen, welche die Reifung von unreifen somatischen Weißlichtenembryonen fördern, wurden sie in einem LP-Reifungsmedium mit halber Stärke, welches einen Bereich von verschiedenen gelösten Stoffen von verschiedenem Molekulargewicht enthält, gereift. Es wurden fünf Wiederholungsversuche pro Behandlung hergestellt und die Behandlungen wurden zweimal wiederholt. Alle Medien enthielten 20 uM an ABA und ein Basisniveau von 3% an Sucrose. Die zugegebenen gelösten Stoffe waren enthalten mit 7,5% (Gewicht/Volumen), was daher zusätzlich zu dem Basisniveau von 3% an Sucrose war. Die Behandlungszeit betrug 9 Wochen. Die Behandlungen mit Sucrose, Mannitol und PEGs 200 und 400 wurden auch bei 2,5 und 5% (Gewicht/Volumen) getestet, da jedoch diese Konzentrationen nicht zu einer Rückgewinnung von irgendeinem reifen Embryo führten, wurden die Ergebnisse für diese Konzentrationen nicht präsentiert. Gleichermaßen führte PEG 8000 zu einer schwachen Reifung, da dieser gelöste Stoff ein wirksames Gelieren des Mediums verhinderte. Die somatischen Embryonen verblieben während der Reifungsbehandlung naß, was zu schlecht ausgebildeten Embryonen bei geringer Häufigkeit führte. Daher wurden die Ergebnisse für PEG 8000 hier ausgeschlossen; jedoch wurde PEG 8000 in einem Flüssigkeitsstrombioreaktor getestet, wo es wirksam eine Reifung förderte (siehe später). Für alle Behandlungen wurden nur normal aussehende opakweiße Embryonen im Kotyledonarstadium gewertet und für Lipidanalysen verwendet. Die Niveaus von Lipidtriacylglycerolen (TAGs) wurden wie später beschrieben analysiert und die bereitgestellten Ergebnisse sind Mittel aus zwei Wiederholungsversuchen.
Es wurde eine niedrige Rückgewinnung von reifen somatischen Embryonen der Kontrolle (kein PEG) aufgezeichnet. Es wurden viel mehr reife Embryonen in dieser Behandlung initiiert, jedoch unterlag der Großteil einer frühreifen Keimung während späterer Phasen der Behandlung, so dass sie nicht gewertet oder für Lipidbestimmungen verwendet wurden. Aus Tabelle 6 ist ersichtlich, dass das Molekulargewicht der PEGs, welche zur Förderung der Reifung in der Lage sind, im Molekulargewichtsbereich von 600-1000 angesiedelt ist. PEGs von 200 und 400 waren toxisch und es wurde während der Reifungsbehandlungen kein Kalluswachstum beobachtet, gleichermaßen wie bei den Mannitol- und Sucrosebehandlungen. PEG 600 war etwas toxisch; die mittlere Anzahl an rückgewonnenen reifen Embryonen war ähnlich zu der Kontrolle in der Abwesenheit von jeglicher frühreifer Keimung und die Lipidniveaus waren geringer als die Kontrollniveaus. PEGs von mehr als 1000 waren beim Fördern einer Reifung effektiver. PEG 1000 führte zu einer Rückgewinnung einer großen Anzahl an reifen somatischen Embryonen. Ein visueller Vergleich zeigte, dass diese Embryonen kleiner waren als andere wirksame Behandlungen, was ein hohes prozentuales Trockengewicht an TAG, jedoch einen geringeren Gesamtlipidgehalt ergab. Visuelle Vergleiche ihrer Resistenzen gegenüber einer weiteren Trocknung zu niedrigeren Feuchtigkeitsniveaus (bei einer relativen Feuchtigkeit von 81%) und einer Entwicklung zu Pflänzchen zeigten eine variable Antwort unter den Wiederholungsversuchen; ferner war die Qualität an regenerierten Pflänzchen variabler als bei den Osmotika mit höherem Molekulargewicht. Es ist somit wahrscheinlich, dass PEG 600 und in geringerem Ausmaß PEG 1000 langsam in die Zellwände der somatischen Embryonen eindringen. Es scheint daher so zu sein, dass die Grenzmolekulargröße von Osmotika, welche effektiv eine Reifung fördern, im Bereich von 30-35 Å liegt, und es wird angenommen, dass dies erreicht wird aufgrund deren Ausschluß von einem Eintreten in die Zelle durch Poren in den Zellwänden, so dass ein nichttoxischer Feuchtigkeitsentzug ausgeübt wird. TABELLE 6 Vergleich des Effekts der Molekulargewichte und Molekulargrößen von gelösten Stoffen bei einer Konzentration von 7,5% mit 20 uM an ABA auf eine Reifungsantwort (reife Embryonen pro Wiederholungsversuch ± Standardfehler, und Lipidgehalte) von somatischen Weißlichtenembryonen
a Von Carpita et al. 1979.

Reifung von vorkultivierten somatischen Weißlichtenembryonen

Eine 1 Woche alte Weißlichtensuspensionskultur, welche zuvor in einem flüssigen Medium, welches 10 uM an 2,4-D und 5 uM an BA enthielt, wuchs, wurde durch Filtration gesammelt. Die somatischen Embryonen wurden in einem Wachstumsregulator-freien flüssigen Medium gespült, 3-6 g an somatischen Embryonen wurden transferiert zu einem frischen 250 ml-Kolben, welcher 50 ml an flüssigem Medium (1% Sucrose) mit halber Stärke enthielt, welches 5 uM an BA mit oder ohne um 1/10 reduziertem Auxin enthielt. Die somatischen Embryonen wurden dann während 1 Woche kultiviert. Nach dieser Zeit wurden sie erneut durch Filtration gesammelt, und es wurde eine 20%-Suspension (Gewicht/Volumen) von somatischen Embryonen in frischem BA-haltigem Medium hergestellt. Diese wurde auf Filterpapierträger, welche auf einem Reifungsmedium auflagen, inokuliert (0,75 ml Aliquote). Die Embryonen wurden dann kultiviert, wobei der obigen Beschreibung gefolgt wurde. Beide Behandlungen verstärkten eine Reifung wesentlich, und es kann angegeben werden, dass sie hinsichtlich Reifungshäufigkeiten einen synergistischen Effekt mit PEG/ABA-Behandlungen besitzen. Die Miteinbeziehung von wenig Auxin war günstig.

Reifung von somatischen Weißlichtenembryonen unter Verwendung eines Festträgerbioreaktors mit kontinuierlichem Fluß

Es wurde ein Bioreaktor hergestellt aus einem hochdichten Kunststoffbehälter mit 15 · 21 · 6 cm mit einem luftdichten Deckel. An den gegenüberliegenden Ecken der Behälterbasis waren ein Eingangs- und ein Ausgangsanschluß angeordnet. Die Basisinnenseite des Behälters war mit einer Baumwollmatte belegt, auf welche ein Filterpapierträger (Whatman Nr. 1; auf 15 · 21 cm geschnitten) gelegt wurde. Von einem 8 l-Behälter, welcher 4 l an Kulturmedium enthielt, wurde flüssiges Reifungsmedium (LP- Medium von halber Stärke mit 7,5% an PEG 8000, 3% an Sucrose und 20 uM an ABA) zugeführt. Die gesamte Apparatur wurde autoklaviert. Der Bioreaktor hielt ungefähr 450 ml an flüssigem Medium innerhalb der Baumwollmatte zurück. Durch die Bioreaktorkammer wurde das Kulturmedium mit einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde während 3 Stunden pro Tag gepumpt. Dies stellte das Äquivalent von ungefähr einem vollständigen Mediumaustausch pro Woche zur Verfügung. Suspensionskultivierte unreife somatische Embryonen wurden auf den Filterpapierträger als eine 20%- Suspension (Gewicht/Volumen) in einem Wachstumsregulatorfreien Medium inokuliert. Es wurden ungefähr 10-15 ml der Suspension über die Filterträgeroberfläche verteilt. Man ließ das System während 7 Wochen laufen. Das Filterpapier, welches die reifen sanft getrockneten somatischen Embryonen trägt, wurde dann entfernt und zur einfacheren Handhabung in kleinere Teile geschnitten. Die reifen Embryonen wurden dann auf niedrige Feuchtigkeitsgehalte weiter getrocknet, entweder auf den Trägern in einer Umgebung mit einer relativen Feuchtigkeit von 63% während 2 Wochen, dann in einem hormonfreien Medium mit halber Stärke imbibiert oder luftgetrocknet und auf Speicherlipide (TAG) analysiert. Die Lipidanalysen wurden wie in Abschnitt B der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben durchgeführt, wobei zwei Wiederholungsversuche mit jeweils 100 Embryonen verwendet wurden.
Somatische Embryonen, welche einer Reifung innerhalb der Bioreaktorkammer unterlagen, ergaben qualitativ hochwertige reife Embryonen. Die Embryonen hatten gut ausgebildete Kotyledone. Der Bioreaktor lieferte ungefähr 500 reife Embryonen dieser Qualität. Es wird angenommen, dass diese Anzahl verbessert werden kann mit einer Optimierung der Bedingungen innerhalb des Bioreaktors, und die Größe des Bioreaktors selbst kann, falls gewünscht, erhöht werden. Die Lipidniveaus sind in Tabelle 7 aufgezeigt, und diese Niveaus brauchen den Vergleich mit den Niveaus nicht zu scheuen, die bei sechs- bis achtwöchigen somatischen Embryonen beobachtet werden, die auf Agarmedium reiften. Die somatischen Embryonen überlebten eine weitere Trocknung mit hoher Häufigkeit und keimten kräftig zu normal aussehenden Pflänzchen. Somit wurden unter Verwendung dieses Verfahrens große Zahlen an Embryonen von ausgezeichneter Qualität hergestellt bei minimalen Kosten und minimaler Bedienung. Unter Verwendung dieses Verfahrens ist es möglich, über die ersten Tage einer Reifung ABA und/oder osmotische Konzentrationen langsam zu erhöhen und gleichermaßen deren Konzentrationen vor dem Abschluß des Produktionsdurchlaufs zu modifizieren. Es ist jedoch beabsichtigt, dass die Niveaus von ABA über den Hauptteil der Reifungsperiode im wesentlichen konstant gehalten werden. Da das Medium regelmäßig zugeführt wird, während verbrauchtes Medium entfernt wird, kann es auch möglich sein, ein modifiziertes Kulturmedium mit geeigneteren Niveaus an Nährstoffen, wie es derzeit durch Agarkulturen zur Verfügung gestellt wird, zur Verfügung zu stellen. Es mag zusätzlich notwendig sein, osmotische und ABA-Konzentrationen zu reoptimieren. Es sei angemerkt, dass andere Kombinationen von Durchlaufverhältnis und Durchlaufzeiten des Mediums wirksamer verwendet werden können. TABELLE 7 Charakteristiken von somatischen Weißlichtenembryonen, welche während 7 Wochen in einem Festträgerbioreaktor mit kontinuierlichem Fluß reiften

Trocknung von somatischen Schwarzlichtenembryonen und Embryonen von Norwegischer Fichte

Unter Verwendung dieser Verfahren wurden somatische Embryonen von Weißlichte, Norwegischer Fichte und Schwarzlichte gereift und zu niedrigen Feuchtigkeitsgehalten getrocknet und zu Pflänzchen regeneriert. Die Konditionen, welche sich für Weißlichte als geeignet erwiesen, wurden bei Norwegischer und Schwarzlichte getestet. Somit wurden suspensionskultivierte somatische Embryonen von Schwarzlichte und Norwegischer Fichte in einem Wachstumsregulator-freien Medium gewaschen, und es wurde eine 20%-Suspension (Gewicht/Volumen) in einem frischen Wachstumsregulator-freien Medium hergestellt. Aliquote (0,75 ml) wurden auf ein Kulturmedium von halber Stärke pipettiert, welches 7,5% an PEG 4000 und 16 uM an (±) ABA enthielt. Die somatischen Embryonen wurden während 4 Wochen gereift, dann auf ihren Filterpapierträgern in einer Umgebung mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% während 2 Wochen weitergetrocknet. Die somatischen Embryonen von Norwegischer Fichte und Schwarzlichte überlebten und regenerierten zu Pflänzchen mit Häufigkeiten von ungefähr 35 bzw. 65%. Es ist wahrscheinlich, dass diese Werte in der Folge einer Optimierung der ABA- und osmotischen Konzentrationen und einer Erhöhung der Länge der Reifungsperiode auf mindestens 7 Wochen verbessert werden könnten. Somatische Embryonen von Norwegischer Fichte überlebten mit geringerer Häufigkeit, jedoch war die Kultur in der Suspensionskultur, welche lediglich 3 Wochen alt war, nicht gut etabliert, so dass eine Gesamtreifung gering war. Suspensionskulturen benötigen eine Etablierung von bis zu 3 Monaten, bevor Embryonen einer effektiven Reifung unterliegen.

B. BESTIMMUNG VON LIPIDZUSAMMENSETZUNGEN VON REIFEN UND GETROCKNETEN SOMATISCHEN WElS SFICHTENEMBRYONEN

Reifung somatischer Embryonen

Es wurde eine Reifung der unreifen suspensionskultivierten somatischen Weißlichtenembryonen (Linie WS1) unter Verwendung der zuvor in A. beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Experimente wurden durchgeführt, um die Effekte verschiedener Kulturbedingungen auf die Lipidbiosynthesen von somatischen Embryonen zu beobachten. Kontrollen von somatischen Embryonen wurden während 4 Wochen auf einem Reifungsmedium gereift, welches 16 uM an ABA (± razemisch, Produktnummer A 2784; Sigma, St Louis, USA) enthielt. Zur Beobachtung der Effekte eines Osmotikums wurde PEG-4000 (Fluka AG) mit Konzentrationen von 2,5, 5,0, 7,5 und 10% (Gewicht/Volumen) in das Reifungsmedium eingebracht, jeweils mit 16 uM an ABA. Somatische Embryonen wurden auf diesen Medien während 4 Wochen in Dunkelheit gehalten, bevor eine Lipidanalyse durchgeführt wurde.
Zum Test der Wirkung der Kulturzeit auf die Lipidbiosynthese wurden somatische Embryonen während 2, 4, 6 oder 8 Wochen vor einer Lipidanalyse auf einem Reifungsmedium gehalten, welches 16 uM an ABA und 7,5% an PEG enthielt. Die Kulturen, welche länger als 4 Wochen reiften, wurden nach dieser Zeit auf ein frisches Medium transferiert. Die Lipidgehalte von unreifen somatischen Embryonen aus einer Suspensionskultur wurden ebenfalls bestimmt.
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Wirkungen verschiedener ABA-Konzentrationen in der Gegenwart von PEG auf eine Lipidbiosynthese zu beobachten. Es wurden daher somatische Embryonen während 8 Wochen auf einem Reifungsmedium gehalten, welches 7,5% an PEG und 12, 16, 24 oder 32 uM an ABA enthielt. Zur Beobachtung der Effekte einer langsamen sekundären Trocknung auf eine Lipidbiosynthese wurden somatische Embryonen, welche in diesen Behandlungen reiften, ebenfalls in eine Umgebung mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% transferiert, wie zuvor beschrieben, um eine weitere Trocknung auf niedrige Feuchtigkeitsniveaus zu erreichen. Reife somatische Embryonen wurden auf ihren Filterpapierträgern auf unverschlossene Petrischalen transferiert, welche dann in einen Exsikkator mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% gegeben wurden. Die Gesamtbehandlungszeit der sekundären Trocknung betrug 2 Wochen. Die somatischen Embryonen wurden auf Lipid analysiert nach einem Imbibieren in einem flüssigen Medium während 1-2 Stunden, um sie von den Filterpapierträgern zu befreien. Die Ergebnisse wurden mit denen von somatischen Embryonen verglichen, welche unter denselben Bedingungen reiften, jedoch nicht weiter getrocknet wurden.
Für Vergleiche mit somatischen Embryonen wurden zygotische Embryonen aus den Megagametophyten von reifen Samen geschnitten, nachdem diese während 16 Stunden in destilliertem Wasser imbibiert wurden. Zusätzlich wurde der gesamte Samen auf Lipid analysiert.

Pflänzchenregeneration

In der Folge einer Reifung und einer weiteren Trocknung wurden somatische Weißlichtenembryonen, welche für eine weitere Kultur beabsichtigt waren, in einem flüssigen Pflänzchenregenerationsmedium imbibiert, wobei ein Verfahren verwendet wurde, welches geringfügig gegenüber dem zuvor in A. beschriebenen Verfahren modifiziert wurde, um die Rate der Wasseraufnahme zu verringern. Somit wurde statt einem direkten Fließenlassen des flüssigen Mediums auf die somatischen Embryonen 1-2 ml zu den Petrischalen gegeben, welche dann auf einer Schräge gehalten wurden, wobei die Filterpapierträger in die Flüssigkeit eintauchten. Das Medium wurde zuerst von dem Filterpapier absorbiert und zu den somatischen Embryonen gefördert. Nach einer Imbibierung wurden die somatischen Embryonen wie zuvor beschrieben unter einem Licht mit geringer Intensität gehalten. Eine Woche später wurden regenerierte Pflänzchen separiert und einzeln kultiviert. Sie wurden horizontal auf ein frisches Pflänzchenregenerationsmedium gegeben und bei demselben Licht mit niedriger Intensität gehalten. Vier Wochen nach einer Imbibierung wurden sie auf Speicherlipide analysiert, und die Ergebnisse waren vergleichbar mit denen von vollständig expandierten zygotischen Sämlingen, welche sich aus Embryonen entwickelten, die aus den Megagametophyten von reifen Samen geschnitten wurden und in vitro während 4 Wochen wuchsen.

Lipidanalyse

Die gesamten Weißfichtensamen, isolierten zygotischen Embryonen, somatischen Embryonen aus den verschiedenen Behandlungen und regenerierten Pflänzchen und zygotischen Sämlinge wurden gezählt, getrocknet und die Frischgewichte bestimmt. Die Proben wurden dann während 24 Stunden in einen Ofen bei 80ºC gegeben und die Trockengewichte aufgezeichnet. Die Lipide wurden aus frischen Geweben mittels des Hexan/Isopropan-Verfahrens von Hara und Radin (1978) extrahiert, nachdem die Proben zuerst während 10 Minuten in siedendes Isopropan gegeben wurden. Die TAGs wurden von den Gesamtlipidextrakten mittels Dünnschichtchromatographie getrennt, wobei HPTLC-Fertigplatten Kieselgel 60 Platten verwendet wurden (Mandel Scientific Co., Toronto, Kanada). Die Platten wurden in einem Lösungsmittelsystem entwickelt, welches Petrolether:Diethylether:Essigsäure (82 : 18 : 1) enthielt. Die TAGs wurden identifiziert unter Verwendung von authentischen Standards und unter Verwendung einer Rasierklinge von den Platten gekratzt. Aus den TAGs wurden Fettsäuremethylester (fames) und Gesamtlipidextrakte wie zuvor beschrieben (Pomeroy et al., 1991) hergestellt. Die Probengrößen bestanden aus 50-180 somatischen oder zygotischen Embryonen, 25 vollständigen Samen und 5 zygotischen Sämlingen oder regenerierten somatischen Pflänzchen. Jede Lipidextraktprobe wurde zur Analyse in 2-3 Wiederholungsproben unterteilt und die Experimente wurden dreimal wiederholt. Die aufgezeigten Ergebnisse sind Mittel aus einem Experiment.

Mikroskopie

Gemäß den zuvor veröffentlichten Verfahren (Fowke, 1984) wurden somatische und zygotische Embryonen von Weißlichte für eine Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) präpariert. Reife trockene Samen wurden in Leitungswasser während 16 oder 65 Stunden vor einer Entfernung und Fixierung von zygotischen Embryonen imbibiert. Somatische Embryonen, welche zu niedrigen Feuchtigkeitsgehalten getrocknet waren, wurden durch vollständiges Eintauchen in ein flüssiges Pflänzchenregenerationsmedium während 2 Stunden vor einer Fixierung schnell imbibiert. Die somatischen Embryonen wurden zuerst längs geschnitten, um ein nachfolgendes Eindringen von Fixierungsmitteln und Harz sicherzustellen. Es wurden Dickschnitte (d. h. 1 zm) aus demselben kunststoffeingebetteten Material geschnitten und mit Toluidinblau (1% Gewicht/Volumen in 1% Boraxlösung) für Beobachtungen mittels eines Lichtmikroskops angefärbt.

ERGEBNISSE

A. Lipidzusammensetzung

Die Fettsäurezusammensetzungen wurden bestimmt für sowohl TL als auch TAG, da jedoch die Werte durchgehend ähnlich waren, werden lediglich die TAG-Fettsäurezusammensetzungen zur Verfügung gestellt, mit Ausnahme der Daten für zygotische Embryonen und Samen (Tabelle 8). TABELLE 8 A: TL (Fettsäuremethylester (fames)) und TAG (fames)- Gehalte, und B: Fettsäurezusaxnxnensetzungen von reifen Weißlichtengesamtsamen und isolierten zygotischen Embryonen.
a Doppelbindung an der Position C-7 anstatt an C-9.
b Doppelbindung an den Positionen C-5 und C-9 anstatt an den Positionen C-9 und C-12.
c Stellt die Summe aller identifizierten C-20 und C-22 Fettsäuren dar.

Zygotische Embryonen und Samen

Ein großer Anteil des Trockengewichts von zygotischen Embryonen rührte von Lipiden her (Tabelle 8A). Sie bestanden aus 51% an TL des Trockengewichts, wobei 36% des Trockengewichts (16% imbibiertes Frischgewicht; nicht aufgezeigt) TAG zuzuschreiben war; daher betrug das Verhältnis von TAG zu TL 71%. Isolierte zygotische Embryonen enthielten lediglich ungefähr 12% des im Gesamtsamen vorhandenen TAG. Somit war TAG zwischen dem Megagametophyten und dem zygotischen Embryo mit einem Verhältnis von 7,5 : 1 verteilt. Der niedrige prozentuale Trockengewichtswert von Lipid aus dem Gesamtsamen rührte im Vergleich zu isolierten zygotischen Embryonen teilweise von dem Einschluß der Samenumhüllungen während der Analyse her. Die Fettsäureanalysen von TL und TAG für isolierte zygotische Embryonen und Gesamtsamen zeigten, dass die Zusammensetzungen ähnlich waren (Tabelle 8B). Die vorherrschenden Fettsäuren in sowohl zygotischen Embryonen als auch Gesamtsamen von Weißlichte waren zwei getrennte molekulare Spezies von 18 : 2, welche ungefähr 70% der Gesamtfettsäuren umfassten. Die häufigste Spezies von 18 : 2 in sowohl Embryonen als auch Samen besaß Doppelbindungen an den üblichen Positionen C-9 und C-12 (Δ9, 12). Jedoch umfasste eine unübliche 18 : 2-Fettsäure mit Doppelbindungen an den Positionen C-5 und C-9 (Δ5, 9) 20-30% der Gesamtfettsäuren. Der Gesamtgehalt von 18 : 1 betrug ungefähr 20% der Gesamtfettsäuren, wobei ungefähr 80% des 18 : 1 die Doppelbindungen an der Position C-9 besaß. Die 16 : 2, 18 : 0, 18 : 3 und längerkettigen Fettsäuren waren jeweils mit mindestens 2% vorhanden.

Somatische Embryonen

Der Effekt der PEG-Konzentration auf die Lipidbiosynthese und Fettsäurezusammensetzung nach einer vierwöchigen Kultur mit 16 um an ABA ist in Tabelle 9 aufgezeigt. TABELLE 9 Einfluss der PEG-Konzentration auf A: Ansammlung von TL (fames) und TAG (fames) und B: Fettsäurezusammensetzung von somatischen Weißlichtenembryonen. Diese wurden während 4 Wochen mit 16 uM an ABA gereift.
a Doppelbindung an der Position C-7 anstatt an C-9.
b Doppelbindung an den Positionen C-5 und C-9 anstatt an den Positionen C-9 und C-12.
c Stellt die Summe aller identifizierten C-20 und C-22 Fettsäuren dar.
PEG erhöhte die Menge an TAG in somatischen Embryonen (Tabelle 9A), jedoch erreichten sie nicht Niveaus in der Höhe von solchen, wie sie für zygotische Embryonen aufgezeichnet wurden (vgl. Tabelle 8A), entweder bezogen auf einen Embryo oder auf prozentueller Basis des Trockengewichts. In Abwesenheit von PEG enthielten somatische Embryonen ungefähr 50% der Menge an TL und TAG, die in zygotischen Embryonen vorhanden ist. TL und TAG pro somatischem Embryo erhöhten sich bei 5,0 und 7,5% an PEG im Vergleich zu der Kontrolle und erreichten nahezu 70% der Menge an TAG, die in zygotischen Embryonen beobachtet wurde. Das prozentuale Trockengewicht von TAG erhöhte sich um 40% bei 5 und 7,5% an PEG, wodurch 58% des Trockengewichtswerts, der in zygotischen Embryonen beobachtet wurde, erreicht wurde. Die TAG-Fettsäurezusammensetzung wurde in keinerlei größerem Ausmaß durch verschiedene Konzentrationen des Osmotikums nach einer vierwöchigen Kultur beeinflusst (Tabelle 9B). Ferner enthielten bei allen PEG-Konzentrationen die somatischen Embryonen dieselben vorherrschenden Fettsäuren wie die zygotischen Embryonen (Tabelle 8B), obwohl in den somatischen Embryonen der Anteil an 18 : 1 höher war und der von 18 : 2 ( Δ5, 9) niedriger war.
Der Effekt der Kulturzeit und 7,5% an PEG auf die Lipidbiosynthese und Fettsäurezusammensetzung wird in Tabelle 10 aufgezeigt. TABELLE 10 Einfluss der Kulturzeit auf A: Ansammlung von TL (fames) und TAG (fames) und B: Fettsäurezusammensetzung von somatischen Weißlichtenembryonen. Diese wurden gereift mit 16 uM an ABA und 0% oder 7,5% an PEG.
ND: Nicht bestimmt
a Doppelbindung an der Position C-7 anstatt an C-9.
b Doppelbindung an den Positionen C-5 und C-9 anstatt an den Positionen C-9 und C-12.
c Stellt die Summe aller identifizierten C-20 und C-22 Fettsäuren dar.
Die somatischen Embryonen fuhren fort, während der achtwöchigen Kulturperiode TL und TAGs anzusammeln (Tabelle 10A). Während zum Beispiel 4-6 wochen mit PEG nahm das Gewicht von TL und TAG pro Embryo auf Niveaus zu, die größer sind als solche, wie sie für zygotische Embryonen aufgezeichnet wurden, und bei 8 Wochen besaßen die somatischen Embryonen viermal mehr an TAG als vergleichsweise zygotische Embryonen. Die Zunahme war mäßiger bei einer Angabe als prozentuales Trockengewicht, wobei 72% des Niveaus erreicht wurden, welches für zygotische Embryonen aufgezeichnet wurde; ebenso enthielten somatische Embryonen 45% mehr TAG bei 8 Wochen als im Vergleich mit solchen bei 4 Wochen. Die TAG-Komponente der somatischen Embryonen betrug 26% Trockengewicht (11% Frischgewicht; nicht aufgezeigt) durch die achtwöchige Kultur. Der Effekt von PEG auf eine TAG-Ansammlung war nach einer achtwöchigen Kultur klar ersichtlich. Zu dieser Zeit hatten somatische Embryonen, welche mit 7,5% an PEG reiften, 50% mehr TAG pro Embryo als vergleichsweise nicht mit PEG behandelte somatische Embryonen und enthielten nahezu zweimal soviel TAG in prozentualem Bezug zum Trockengewicht. Der Prozentsatz an TAG zu TL nahm während einem Reifen mit PEG zu und führte zu einem höheren Verhältnis von TAG zu TL als vergleichsweise bei somatischen Embryonen, welche ohne PEG reiften. Die TAG- Fettsäurezusammensetzung von somatischen Embryonen änderte sich mit der Kulturzeit (Tabelle 9B) und hatte bei 8 Wochen Verhältnisse erreicht, welche nahe an denen von zygotischen Niveaus lagen (vgl. Tabelle 8B). Die in unreifen suspensionskultivierten somatischen Embryonen vorhandenen häufigsten Fettsäuren waren 18 : 1 (Δ9) und 18 : 2 ( Δ9, 12). Die mit 7,5% und 0% an PEG behandelten somatischen Embryonen besaßen ähnliche Fettsäurezusammensetzungswerte, was wiederum aufzeigte, dass das PEG-Osmotikum einen geringen Einfluss auf die Fettsäurezusammensetzung auch nach einer achtwöchigen Kultur besaß. Während des achtwöchigen Untersuchungszeitraums war der Trend eine Erhöhung für die 18 : 2 (Δ9, 12 und Δ5, 9)-Fettsäuren, während die anderen Fettsäuren proportional abnahmen, was zu Fettsäurezusammensetzungen führte, die ähnlich zu reifen zygotischen Embryonen waren (Tabelle 7B).
Die Wirkungen der ABA-Konzentration und sekundären Trocknungsbehandlungen auf die Lipidbiosynthese und Fettsäurezusammensetzung nach 8 Wochen bei 7,5% an PEG werden in Tabelle 11 aufgezeigt. TABELLE 11 Einfluss der ABA-Konzentration und langsamen sekundären Trocknung (relative Feuchtigkeit 81%) auf A: Ansammlung von TL (fames) und TAG (fames) und B: Fettsäurezusammensetzung von Weißfichtenembryonen. Diese wurden während 8 Wochen mit 7,5% an PEG gereift, dann entweder auf Lipid untersucht im sanft getrockneten hydratisierten Zustand (H) direkt nach einer Reifung oder anschließend weiter getrocknet (D) während 2 Wochen bei einer ralativen Feuchtigkeit von 81%. TABELLE 11 (Fortsetzung)
a Doppelbildung an der Position C-7 anstatt an C-9
b Doppelbildung an den Positionen C-5 und C-9 anstatt an den Positionen C-9 und C-12
c Stellt die Summe aller identifizierten C-20 und C-22 Fettsäuren dar. In somatischen Embryonen, welche nicht einer sekundären Trocknung unterzogen wurden, nahm TL mit zunehmender ABA-Konzentration zu (Tabelle 11A). ABA bei 16 uM ergab jedoch die größte Ansammlung an TAG pro Embryo (143 ug), jedoch prozentual auf Basis des Trockengewichts war 24 uM an ABA höher (20%). Infolge einer sekundären Trocknung zeigten somatische Embryonen bei allen ABA-Konzentrationen höhere TL und TAG - diejenigen von den Behandlungen bei 16 und 24 uM an ABA enthielten über 30% mehr - was aufzeigt, dass die Lipidansammlung während der sekundären Trocknungsbehandlung weiter andauerte. Auf einer Basis pro Embryo ergab 16 uM an ABA am meisten TAG pro Embryo (214 ug). Dies ist fünfmal der zygotische Wert (Tabelle 7A) und ungefähr eine neunfache Zunahme gegenüber den ursprünglichen Kontrollen (Tabelle 9A). Prozentuell auf Basis des Trockengewichts waren 24 uM an ABA optimal, wobei somatische Embryonen erzeugt wurden, welche 30% an TAG enthielten. Dies ist 83% des zygotischen Werts und zweimal der Wert der anfänglichen somatischen Kontrollembryonen. Prozentuell auf Basis des Frischgewichts führten alle ABA-Behandlungen zu somatischen Embryonen, welche ungefähr 11% an TAG enthielten (nicht aufgezeigt), was ungefähr 70% des zygotischen Niveaus ist. Die TAG-Fettsäurezusammensetzung wurde durch ABA bei den getesteten Konzentrationen nicht spürbar modifiziert (Tabelle 4B), jedoch infolge einer Trocknung nahm der Anteil von 18 : 1 (Δ 9) langsam beständig ab, während der Anteil von 18 : 2 (Δ 9, 12) einer leichten Zunahme unterlag, was zu Werten führte, die sich weiter an die zygotischen Werte annäherten als vergleichsweise somatische Embryonen, welche nicht auf niedrige Feuchtigkeitsgehalte getrocknet wurden.

Somatische Pflänzchen und zyqotische Sämlincre

Die TL- und TAG-Gehalte für regenerierte somatische Pflänzchen, welche während 6 Wochen mit 16 uM an ABA, 7,5% an PEG reiften, dann weiter getrocknet wurden, und für expandierte zygotische Sämlinge, welche aus isolierten zygotischen Embryonen wuchsen, werden in Tabelle 12 verglichen. TABELLE 12 A: TL-(fames)- und TAG-(fames)-Gehalte und B: Fettsäurezusammensetzungen von expandierten Weißlichtensämlingen und somatischen Pflänzchen infolge einer Reifung während 6 Wochen auf einem Medium, welches 16 uM an ABA und 7,5% an PEG enthielt, und dann weiter getrocknet wurden. Die somatischen Pflänzchen und zygotischen Sämlinge waren jeweils 4 Wochen alt.
ND: Nicht bestimmt
a Doppelbindung an der Position C-7 anstatt an C-9.
b Doppelbindung an den Positionen C-5 und C-9 anstatt an den Positionen C-9 und C-12.
c Stellt die Summe aller identifizierten C-20 und C-22 Fettsäuren dar.
Nach einem vierwöchigen Wachstum waren die TL- und TAG-Gehalte ähnlich (Tabelle 12A). Es waren niedrige Niveaus an Lipid in beiden Pflanzenarten vorhanden, was die Speicherfunktion der TAGs und deren Verwendung für ein Wachstum nach dem Keimen bestätigte. Die Daten für die TAG-Fettsäurezusammensetzungen zeigten ähnliche Trends (Tabelle 12B). Somit nahm bei beiden Pflanzenarten die 18 : 2 (Δ9, 12 und Δ5, 9) ab, während die Anteile der anderen Fettsäuren zunahmen, im Vergleich mit reifen zygotischen Embryonenniveaus (vgl. Tabelle 8B). Die somatischen Pflänzchen, welche mit 16 mm an ABA reiften, erreichten nicht den Grad der Änderung, welcher bei den zygotischen Sämlingen beobachtet wurde. Jedoch waren diese Ergebnisse inkonsistent und ferner variierte das Niveau, zu welchem diese Veränderungen für zygotische Sämlinge stattfanden, stark bei den Experimenten. Es scheint somit, dass die Synthese von 16 : 0, 18 : 0 und längerkettigen Fettsäuren in den Sämlingen und Pflänzchen auf Kosten von 18 : 2 (Δ9, 12 und Δ5, 9) stattfindet, was die Umkehr der Ereignisse darstellt, welche während der Reifung beobachtet werden (vgl. Tabelle 10B).

B. Pflänzchenumwandlung

Während der Kultur während 4-8 Wochen mit 7,5% an PEG und 12-32 uM an ABA reiften somatische Weißlichtenembryonen ohne einer frühreifen Keimung. Somatische Embryonen, welche zu niedrigen Feuchtigkeitsgehalten getrocknet sind, waren trocken und geschrumpft und besaßen eine durchscheinende Erscheinung. Während einer sekundären Trocknung unterlagen jedoch viele somatische Embryonen, welche während 8 Wochen mit 12 uM an ABA reiften, vor einem Trocknen einem leichten Grünwerden. Eine frühreife Keimung während der sekundären Trocknungsbehandlung war ausgeprägter bei somatischen Embryonen, welche während 8 Wochen mit 0 und 2,5% an PEG reiften, wobei insbesondere die ersteren sich deutlich grün färbten und eine Hypokotylverlängerung 100% erreichte und ein Überleben nicht stattfand. Infolge einer verlängerten Reifungsbehandlung verhinderten die höheren ABA- und PEG-Konzentrationen das Auftreten einer frühreifen Keimung, welche ansonsten auftrat, sobald ABA für eine sekundäre Trocknung entfernt wurde. Wie in Fig. 4 aufgezeigt, erhielten vollständig imbibierte normale somatische Embryonen ihre gequollene opakweiße Erscheinung vor der Trocknung zurück und wandelten sich mit hoher Häufigkeit zu Pflänzchen um. Embryonen bei diesem Zustand sind hellgrün und haben eine beginnende Verlängerung (X 3,0 Balken: 0,5 cm). Zum Beispiel reifte pro Behandlung nach einer vier-, sechs- oder achtwöchigen Behandlung mit 16 uM an ABA eine Gesamtheit von 700-800 somatischen Kotyledonarembryonen mit normalem Aussehen. Wie in Fig. 5 zu sehen ist, unterlagen somatische Pflänzchen, welche aus den Behandlungen mit 16-24 uM an ABA regeneriert wurden, einer Wurzel- und Hypokotylverlängerung (X 2,7, Balken: 0,5 cm). Die Verlängerung ist im Ausmaß vergleichbar mit zygotischen Sämlingen, welche in vitro aus isolierten Embryonen wuchsen (siehe Fig. 6). Die in Fig. 6 aufgezeigten zygotischen Sämlinge wurden erhalten aus reifen Embryonen, welche von dem Megagametophyten eines reifen Samens getrennt wurden und in vitro während 3 Wochen unter denselben Bedingungen wie die somatischen Embryonen aus Fig. 5 wuchsen (X 2,7, Balken: 0,5 cm).

C. Mikroskopie

Die reifen zygotischen Weißlichtenembryonen besaßen ausgeprägte Kotyledon- und Apikalmeristemregionen, und das Prokambium war gut zu sehen, wie in Fig. 7A aufgezeigt (X 76, Balken: 0,2 mm). Lipidkörper (L) waren reichlich vorhanden innerhalb der Zellen der Wurzel, des Hypokotyls und Gebieten, welche zu dem Sprossapikalmeristem benachbart sind, wobei einige offensichtlich miteinander verschmelzen (Pfeil), wie in Fig. 7B zu sehen. Zygotische Embryonen, welche aus reifen trockenen Samen geschnitten wurden, die während 16 Stunden imbibiert wurden, besaßen ebenfalls zahlreiche reife Proteinkörper (Fig. 7B (X 6500, Balken: 3 um)). Die Proteinkörper innerhalb der Zellen der zygotischen Embryonen, welche aus Samen geschnitten wurden, die während 65 Stunden imbibiert worden waren, hatten sich jedoch vergrößert, und die Proteinablagerungen waren verteilt, wie in Fig. 8 zu sehen. Die in Fig. 8 aufgezeigten Zellen enthalten auch zahlreiche dicht gepackte Lipidkörper (L), wobei einige offensichtlich miteinander verschmelzen (Pfeil) (N: Kern, · 6500, Balken: 3 um).
Somatische Embryonen, welche während 8 Wochen mit 16 mm an ABA und 7,5% an PEG reiften, enthielten, wie in Fig. 9 aufgezeigt, große Mengen an Lipid (L) und kompakte Proteinkörper (P), ähnlich zu zygotischen Embryonen aus einem 16 Stunden imbibierten Samen (X 6000, Balken: 3 um). Nach einer sekundären Trocknung und einem schnellen Imbibieren während 2 Stunden enthielten die in Fig. 9 aufgezeigten somatischen Embryonen reichlich Lipidkörper, die hinsichtlich der Verteilung und Häufigkeit vergleichbar sind mit den reifen zygotischen Embryonen aus einem 65 Stunden imbibierten Samen, wie in Fig. 10A aufgezeigt. Die Zellen sind dicht zytoplasmisch und Speicherreserven sind offensichtlich vorhanden (kleine Pfeile). Es wird auf den ziemlich flachen Meristem (großer Pfeil) und die Prokambialzellen (weißer Pfeil) hingewiesen (X 80, Balken: 2 mm). Fig. 10B zeigt auf, dass die Zellen mit Lipidkörpern (L) gepackt sind. Auch wiesen die stark getrockneten und imbibierten somatischen Embryonen nach einem Imbibieren von gerade 2 Stunden vergrößerte Proteinkörper (P) auf, welche dispergierte Proteinablagerungen enthalten, ähnlich zu den zygotischen Embryonen aus einem 65 Stunden imbibierten Samen (N: Kern, · 6000, Balken: 3 um). Somatische Embryonen besaßen einen ausgeprägten Apikalmeristem, Prokambium und gut entwickelte Kotyledone und waren im allgemeinen größer als zygotische Embryonen.
Im Gegensatz dazu enthielten somatische Embryonen, welche während lediglich 4 Wochen ohne PEG reiften (Fig. 11) oder mit 7,5% an PEG reiften (Fig. 12), beträchtlich weniger Lipidkörper als in den 8 Wochen gereiften somatischen Embryonen beobachtet (Fig. 9). Das Niveau der Lipidansammlung war auch ausgeprägt niedriger als in zygotischen Embryonen (vgl. Fig. 7b). Zellen von somatischen Embryonen, welche während 4 Wochen mit PEG reiften, waren dichter zytoplasmisch im Vergleich mit somatischen Embryonen, welche ohne PEG reiften (für welche die meisten Zellen des Hypokotyls und Kotyledons vakuolisiert und deshalb nicht sanft getrocknet sind), welche in Fig. 11A aufgezeigt werden (X 135, Balken: 0,1 mm).
Wie in Fig. 11B aufgezeigt (N: Kern, · 7500, Balken: 3 um), enthielt das Zytoplasma von Zellen aus somatischen Embryonen, welche während 4 Wochen mit 16 uM, jedoch ohne PEG reiften, weniger und kleinere Lipidkörper (L) als in Zellen von somatischen Embryonen, welche während 8 Wochen mit sowohl ABA als auch PEG reiften (vgl. Fig. 10B). Die in Fig. 12A aufgezeigten Zellen (X 130, Balken: 0,1 mm) sind nicht vakuolisiert, aber dichter zytoplasmisch und enthalten mehr Speicherreserven (Pfeile) als Zellen in Embryonen, welche während derselben Zeit in Abwesenheit von PEG reiften (vgl. Fig. 11A). Das Miteinbeziehen von PEG während der Reifung hat die Größe und Anzahl der Lipidkörper (L), Stärkeablagerungen (S) und reifen Proteinkörper (P) erhöht, wie in Fig. 12B aufgezeigt (X 6500, Balken: 3 um). Jedoch sind die Lipide nicht so reichlich wie in somatischen, welche während 8 Wochen mit ABA und PEG reiften, wie in Fig. 9 zu sehen.
Infolge einer Keimung und einem vierwöchigen Wachstum der zygotischen Sämlinge verlängerten sich die meisten Zellen und unterlagen einer Vakuolisierung. Wie in Fig. 13A zu sehen ist, waren Gefäßspuren (großer Pfeil), Apikalmeristem (kleiner Pfeil) und Vakuolatzellen gut ausgebildet (X 72, Balken: 0,2 mm). Die in Fig. 13B aufgezeigte elektronenmikroskopische Aufnahme veranschaulicht, dass Lipidkörper durch den Sämling hindurch spärlich vorhanden waren und nahezu leer erschienen (Pfeile) aufgrund der Verwendung des Inhalts. Proteinkörper waren abwesend (N: Kern, · 6000, Balken: 3 um). Dieses Entwicklungsmuster fand auch in vergleichbar alten somatischen Pflänzchen statt, welche aus somatischen Embryonen regeneriert wurden, die während 8 Wochen mit 75% an PEG reiften und dann weiter getrocknet wurden. In einigen Fällen unterlagen jedoch Pflänzchen, welche aus der letzteren Behandlung regeneriert wurden, einer Epikotylverlängerung (E) und einer Nadelentwicklung um den Apikalmeristem innerhalb von 4 Wochen, wie in Fig. 14A aufgezeigt (X 54, Balken: 0,2 mm). Der schmale Pfeil bezeichnet den ursprünglichen Kotyledon. Dieser Entwicklungsgrad wurde in zygotischen Sämlingen von entsprechendem Alter nicht beobachtet. In Fig. 14B wurden die Lipidkörper und Proteinkörper nicht beobachtet. Die Zellen sind charakterisiert durch viele kleine Vakuolen und differenzierte Chloroplasten (Pfeile) (N: Kern, V = Vakuole, · 6000, Balken: 3 um).

Diskussion

Durch Manipulation der Kulturbedingungen für somatische Weißlichtenembryonen war es möglich, Speicherlipidniveaus und Fettsäurezusammensetzungen zu erreichen, die höher sind als die in zygotischen Embryonen beobachteten. Solche Manipulationen erzeugten somatische Embryonen, welche eine Trocknung zu niedrigen Feuchtigkeitsgehalten, dann eine Regeneration zu Pflänzchen mit hoher Häufigkeit überlebten. Die Reifungsbedingungen, welche zu somatischen Embryonen führten mit einer Fettsäurezusammensetzung, die am stärksten angenähert ist an die reifen zygotischen Embryonen, waren 6-8 Wochen mit 16-24 uM an ABA und 7,5% an PEG, gefolgt von einer weiteren Trocknung. Diese Konzentrationen führten auch zu optimalen Speicherproteinablagerungen in somatischen Weißlichtenembryonen. Die letztgenannte Untersuchung zeigte auch auf, dass 5,0-7,5% an PEG einen Schutz für Speicherproteine gewährte, welche ansonsten während einer weiteren Trocknung abgebaut wurden. Zusätzlich stimulierte diese PEG-Konzentration eine Verdoppelung der Lipidniveaus und eine dreifache Zunahme der Reifungshäufigkeit von somatischen Weißlichtenembryonen, und die somatischen Embryonen besaßen auch niedrigere Feuchtigkeitsniveaus als zygotische Embryonen aus reifen trockenen Samen.
Eine synchrone Reifung der unreifen somatischen Weißlichtenembryonen fand in der Folge ihres Transfers von einem Proliferationsmedium, welches 2,4-D-Säure und BA enthielt, zu dem feuchtigkeitsentziehenden Medium, welches PEG und ABA enthielt, statt. Es fand keine Reifung in Abwesenheit von PEG und ABA statt. Die Konzentration an ABA und PEG und die Reifungsperiode besaßen einen Effekt auf eine TAG-Ansammlung, während die Fettsäurezusammensetzung am meisten durch letztgenannte modifiziert wurde. Weit geringere Modifikationen der Fettsäurezusammensetzung fanden in der Folge einer weiteren Trocknung statt. Die TAG-Niveaus - als Prozent des Trockengewichts - erhöhten sich von 42% der zygotischen Niveaus in den ursprünglichen Kontrollen (4 Wochen mit 0% an PEG) auf 83% nach 8 Wochen Reifung mit 7,5% an PEG und 16-24 uM an ABA, gefolgt von einer weiteren Trocknung, während die TAG-Niveaus pro somatischem Embryo von der Hälfte der in zygotischen Embryonen beobachteten zu nahezu fünfmal den zygotischen Niveaus erhöht wurden. Dies führte zu somatischen Embryonen mit ungefähr neunmal dem Niveau an TAG, das in den Kontrollen beobachtet wurde, und sechsmal den Frischgewichtniveaus, die von Feirer et al. (1989) für somatische Embryonen von Norwegischer Fichte aufgezeichnet wurden. Eine kräftige Wurzel- und Sprossverlängerung war bei den regenerierten somatischen Pflänzchen augenscheinlich. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass, obwohl die Gesamtmenge an TAG für somatische Embryonen größer als für zygotische Embryonen war, eine geringere Lipiddichte aus der größeren Größe der somatischen Embryonen resultierte. Die Zunahme im Trockengewicht und Abnahme im Feuchtigkeitsgehalt in Gegenwart von PEG, wie in A beobachtet, war daher ein Anzeichen für gestiegene Speicherreserven.
Die Ergebnisse der Lipidansammlung, Fettsäurezusammensetzung und der TEM- und Regenerationsstudien zeigen zusammen an, dass eine vierwöchige Behandlung mit ABA - wie sie oft zur Reifung von somatischen Koniferenembryonen verwendet wird - keine ausreichende Zeit gewährte für eine optimale Ansammlung von TAG durch somatische Weißlichtenembryonen, was zu somatischen Embryonen führte, welche nicht von vergleichbarer Reife waren wie zygotische Embryonen. Eine große Menge an TAG wurde während der 4.-8. Woche der Kultur synthetisiert. Die TEM-Studie lieferte ferner den Beweis für eine stimulierte Lipidbiosynthese mit 7,5% an PEG und einer verlängerten Reifungszeit, dargestellt durch die gut entwickelte Struktur der somatischen Embryonen. Es wurde zuvor aufgezeigt, dass Speicherreserven sich anfänglich in den Wurzelbereichen von somatischen Weißlichtenembryonen ansammeln und dann anschließend in den sich später entwickelnden Sprossmeristem- und Kotyledonbereichen. Die Kotyledonar- und Sprossmeristembereiche der somatischen Embryonen erschienen nach der dritten Woche der Kultur, so dass eine zusätzliche Entwicklung dieser Bereiche notwendig sein würde, bevor Lipid abgelagert werden könnte.
Um eine langsame sekundäre Trocknung auf niedrige Feuchtigkeitsgehalte zu erreichen, wurden somatische Embryonen in Exsikkatoren mit einer relativen Feuchtigkeit von 81% transferiert. Die Filterpapierträger, auf welchen sie transferiert wurden, waren mit Kulturmedium gesättigt, so dass daher die feuchtigkeitsentziehende Umgebung und die anfängliche Verfügbarkeit von Nährstoffen scheinbar eine weitere Lipidansammlung ermöglicht hat vor dem Zuführen von Nährstoffen, einem Trocknen und einem Geringerwerden der Feuchtigkeitsgehalte der somatischen Embryonen zur Unterstützung des Metabolismus.
Ein nichtplasmolysierender Feuchtigkeitsentzug war einflussreich bei der Verhinderung einer frühreifen Keimung von somatischen Weißlichtenembryonen während verlängerter Reifungs- und Trocknungsbehandlungen, wodurch ein Überleben in der Folge einer weiteren Trocknung gefördert wurde. TAG sammelte sich optimal unter Verwendung von 7,5% an PEG und 16-24 uM an ABA an. Reifende Embryonen unterlagen einer erhöhten Neigung für eine frühreife Keimung mit einer erhöhten Reifungszeit, was zu geringerem Überleben in der Folge einer weiteren Trocknung zu einem niedrigen Feuchtigkeitsgehalt führte. Die gestiegene Neigung für eine frühreife Keimung läßt eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber ABA bei gestiegener Reifungszeit vermuten. Die frühreife Keimung wurde durch PEG- Behandlungen verhindert. In der Abwesenheit von in hohem Maße feuchtigkeitsentziehenden Behandlungen wurden Konzentrationen von bis zu 60 uM, die während der Reifungsperiode angewendet wurden, dazu verwendet, eine frühreife Keimung während einer Reifung von somatischen Koniferenembryonen zu unterbinden. Solche Konzentrationen erhöhten jedoch das Auftreten von abnormalen somatischen Embryonen.
Die Pflänzchenumwandlungshäufigkeiten von 72-81%, die hier für somatische Embryonen, welche während 6-8 Wochen reiften, berichtet wurden, können davon herrühren, dass sie in eine trocknungsresistentere Phase eingetreten sind. Die Trocknungsresistenz scheint nahe verwandt zu sein mit den Niveaus an Speicherreserven. Behandlungen, welche eine Ansammlung von Speicherreserven förderten, wie PEG, ABA und eine erhöhte Reifungszeit, förderten somit auch eine Trocknungsresistenz. Dies ist dadurch bedingt, dass Vakuolatzellen, welche wenig Reservematerial enthalten, einem mechanischen Aufplatzen und Reißen von Membranen während einem starken Wasserverlust unterliegen können, während die Gegenwart von ausreichenden Reserven solche Veränderungen einschränkt.
Stark getrocknete somatische Embryonen scheinen einer sehr schnellen Imbibierung zu unterliegen und unterstützen somit eine Beschädigung, im Gegensatz zu zygotischen Embryonen, welche in den Samen geschützt sind. Proteinkörper innerhalb der Zellen von trockenen Samen quellen und nehmen während einer Imbibierung Wasser auf; somit war, wie durch eine Proteinkörperultrastruktur belegt, ein schnelles Imbibieren von somatischen Embryonen durch deren Eintauchen in flüssiges Medium während gerade 2 Stunden vergleichbar mit einer Samenimbibierung von 65 Stunden. Daher reduzierten die verwendeten alternativen langsameren Imbibierungsverfahren wahrscheinlich eine Verletzung und förderten so eine Pflänzchenumwandlung.
Ein hohes Osmotikum stimuliert eine TAG-Biosynthese und beeinflusst die Menge und/oder Zusammensetzung der Fettsäuren; wobei Sucrose das gebräuchlichste ausgewählte Osmotikum darstellt (z. B. Pence et al., 1981; Janick et al., 1982; Avjioglu und Knox, 1989; Dutta und Appelqvist, 1989). Fettsäuren werden durch Umwandlung von Sucrose zu Acetyl-Coenzym A gebildet, aus welchen Palmitin-(16 : 0)- und Olein-(18 : 0)-Säuren gebildet werden und verwendet werden bei der Synthese von ungesättigten und längerkettigen Fettsäuren (Stymne und Stobart, 1987). Es wurde vorgeschlagen, dass Sucrose eine Lipidbiosynthese stimuliert durch entweder ein Beeinflussen der chemischen Zwischenprodukte des Tricarbonsäurezyklus oder durch Auslösen von osmotischen Veränderungen in der Zelle in Antwort auf das niedrige Wasserpotential des Kulturmediums (Pence et al., 1981). Die Stimulierung einer Lipidbiosynthese in somatischen Weißlichtenembryonen unter Verwendung von PEG zeigt, dass der Effekt von dem induzierten Feuchtigkeitsentzug herrührt und nicht von einem hinsichtlich Sucrose limitierenden Substrat. Folglich war für eine Reifung von somatischen Weißlichtenembryonen die optimale Osmotikumkonzentration höher für PEG als für Sucrose. Für eine Reifung von somatischen Weißlichtenembryonen war das optimale osmotische Potential für das Kulturmedium, welches 7,5% an PEG und 3% an Sucrose enthielt, -0,7 MPa.
Die Ölreserven von Samen werden in der Folge einer Keimung schnell zu Sucrose rückmobilisiert, um Energie und Kohlenstoffskelette für das Embryowachstum nach der Keimung zur Verfügung zu stellen. Lipidreserven werden während eines Wachstums der somatischen Weißlichtenembryonen zu Pflänzchen auf eine ähnliche Weise erschöpft wie bei in vitro kultivierten zygotischen Sämlingen.

Quellenangaben

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Alle oben aufgeführten Referenzen werden durch Verweis hierin mitaufgenommen.

Claims

1. Ein lebensfähiger trocknungsresistenter reifer somatischer Gymnospermenembryo mit einem Feuchtigkeitsgehalt von unter 55%.

2. Somatischer Embryo nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Feuchtigkeitsgehalt aufweist, der zwischen 10 und 55% liegt.

3. Somatischer Embryo nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Feuchtigkeitsgehalt von unter ca. 45% aufweist.

4. Somatischer Embryo nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Feuchtigkeitsgehalt von unter etwa 36% aufweist.

5. Der somatische Embryo nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Feuchtigkeitsgehalt aufweist, der niedriger ist, als der Feuchtigkeitsgehalt seines entsprechenden zygotischen Embryos.

6. Der somatische Embryo nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Trockengewicht und einen Lipidgehalt pro Embryo aufweist, welche etwa gleich oder größer sind als das Trockengewicht und der Lipidgehalt pro Embryo seines entsprechenden zygotischen Gymnospermenembryos.

7. Der somatische Embryo nach Anspruch 6, wobei das Pro- Embryo-Trockengewicht zwischen 30 und 600% höher liegt als das mittlere Trockengewicht des zygotischen Embryos aus reifen Samen derselben Spezies und/oder der Lipidgehalt zwischen 50 und 700% höher liegt als der mittlere Lipidgehalt von zygotischen Embryonen aus reifen Samen derselben Spezies.

8. Der somatische Embryo nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Gymnosperm eine Konifere ist.

9. Der somatische Embryo nach Anspruch 8, wobei der Embryo aus der Familie Pinaceae stammt.

10. Der somatische Embryo nach Anspruch 9, wobei der Embryo aus dem Genus Picea stammt.

11. Der somatische Embryo nach Anspruch 10, wobei der Embryo ausgewählt wird aus Weißlichte, Schwarzlichte und norwegischer Fichte.

12. Der somatische Embryo nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Embryo eingekapselt ist.

13. Der somatische Embryo nach Anspruch 12, wobei der Embryo eingekapselt ist in ein nichthydratisiertes Polymer mit einem Schmelzpunkt, welcher im Bereich von etwa 20 und 70ºC liegt.

14. Ein Verfahren zum Entwickeln von somatischen Gymnospermenembryonen, welches das Kultivieren ausgewählter unreifer somatischer Gymnospermenembryonen in einem Medium einschließt, welches eine matabolisierbare Kohlenstoffquelle, ein nicht eindringendes wasserentziehendes Mittel (water stressing agent) und einen Wachstumsregulator mit einem Einfluß auf die Embryoentwicklung enthält, wobei den Embryonen für eine Zeitdauer Wasser entzogen wird, die ausreicht, um den Feuchtigkeitsgehalt des Embryos auf unterhalb von etwa 55% zu senken, um so die Embryonen resistent gegen weitere Trockung zu machen, wodurch lebensfähige reife trocknungsresistente somatische Gymnospermenembryonen hergestellt werden.

15. Das Verfahren nach Anspruch 14, welches das Wasserentziehen für eine Zeitdauer umfaßt, welche ausreicht, um einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 45% zu erreichen.

16. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 oder 15, wobei das zusätzliche Trocknen der trocknungsresistenten somatischen Embryonen umfaßt wird, um einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 36% zu erreichen.

17. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei die zusätzliche Trocknung umfaßt, daß den Embryonen wenigstens teilweise weiteres Wasser entzogen wird.

18. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei die zusätzliche Trocknung wenigstens das teilweise Trocknen der Embryonen in wenigstens einer Umgebung mit einer geringen relativen Feuchtigkeit umfaßt.

19. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 17, wobei das wasserentziehende Mittel, die metabolisierbare Kohlenstoffquelle und der Wachstumsregulator gleichzeitig vorliegen.

20. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 19, wobei das Medium ferner eine Konzentration der metabolisierbaren Kohlenstoffquelle im Überschuß zu der für die Ernährung des Embryos erforderlichen Menge umfaßt.

21. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 17, 19 und 20, wobei das wasserentziehende Mittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykolen, Dextranen, Zellulosen, Pektinen, Galaktanen, Fikollen, Polypropylenglykolen, Agars, Gummis, Oligosacchariden, Proteinen, Aminosäuren, Lipoproteinen, Nucleotiden, Oligonucleotiden und Lipopolysacchariden.

22. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14, 15 oder 16, wobei das wasserentziehende Mittel im wesentlichen nicht eindringend ist.

23. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14, 15 oder 16, wobei das wasserentziehende Mittel ausreicht, um ein osmotisches Potential aufrechtzuerhalten, welches im Bereich von -0,3 und -2,0 MPa liegt.

24. Das Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Mittel Polyethylenglykol ist.

25. Das Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Polyethylenglykol ein Molekulargewicht aufweist, welches im Bereich von etwa 1.000 und 35.000 liegt.

26. Das Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Polyethylenglykol in einer Konzentration im Bereich zwischen 1 und 30 Gew.-% vorliegt.

27. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18, wobei das wasserentziehende Mittel Dextran ist, welches bei einer Konzentration im Bereich zwischen 1 bis 30 Gew.-% liegt.

28. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18, wobei der Wachstumsregulator ein Streßhormon ist.

29. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18, wobei der Wachstumsregulator ausgewählt wird aus Abscisinsäure und/oder analogen Verbindungen, Vorläufern oder Derivaten davon.

30. Das Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Analoga, Vorläufer oder Derivate der Abscisinsäure ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Abscisylalkohol, Acetylenaldehyd, Dihydroacetylenalkohol, Phaseinsäure (PA), Dihydrophaseinsäure (DPA), 6'-Hydroxymethylabscisinsäure (HM-ABA), beta-Hydroxyabscisinsäure, beta-Methylglutarylabscisinsäure, beta-Hydroxy-betamethylglutarylhydroxyabscisinsäure, 4'-Desoxyabscisinsäure, Abscisinsäure-beta-D-Glukoseester, 2-2(2-p- Chlorphenyl-trans-ethyl)cyclopropancarboxylsäure und Jasmonsäure und funktionelle Derivate davon.

31. Das Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Abscisinsäure und/oder Analoga, Vorläufer oder Derivate davon am Ende der Entwicklung der somatischen Embryonen in einer Endkonzentration von wenigstens 0,1 uM vorliegen.

32. Das Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Abscisinsäure und/oder Analoga, Vorläufer oder Derivate davon anfänglich in einer Konzentration vorliegen, die ausreicht, um am Ende der Entwicklung der somatischen Embryonen eine Endkonzentration von Abscisinsäure und/oder Analoga, Vorläufern oder Derivaten davon von wenigstens 0,1 uM zu erzielen.

33. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die Konzentration des Wachstumsregulators während der Herstellung geändert wird.

34. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18, wobei eine im wesentlichen konstante Konzentration des Wachstumsregulators während der meisten Zeit der Entwicklung der unreifen Embryonen zugegeben wird.

35. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die unreifen Embryonen für eine Zeitdauer entwickelt werden, die im Bereich von 1 bis 15 Wochen liegt.

36. Das Verfahren nach jedem der Ansprüche 14 und 15, wobei der Wasserentzug zusätzlich durch eine Mehrzahl von Umgebungen mit abnehmenden relativen Feuchtigkeiten bewirkt wird.

37. Das Verfahren nach jedem der Ansprüche 18 oder 36, wobei die Trockung eine Schnelltrockung ist.

38. Das Verfahren nach jedem der Ansprüche 18 oder 36, wobei die Trocknung eine langsame Trocknung ist.

39. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die Embryonen Koniferenembryonen sind.

40. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Embryonen zur Familie der Pinaceae gehören.

41. Das Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Embryonen zum Genus Picea gehören.

42. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18, ferner einen vorläufigen Schritt umfassend, welcher das Vorkulitivieren der unreifen Embryonen in Gegenwart eines Mediums mit reduziertem Auxin/Cytokinin oder einem reduzierten Auxinmedium umfaßt, um die Reifung der Embryonen in die Wege zu leiten.

43. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die unreifen Embryonen in einem Bioreaktorgefäß entwickelt werden.

44. Das Verfahren nach Anspruch 43, wobei das Gefäß ein im kontinuierlichen Fluß betriebenes Feststoffträgerbioreaktorgefäß ist.

45. Das Verfahren nach Anspruch 43 oder Anspruch 44, wobei das Gefäß eine Kulturkammer umfaßt, welche Mediumeinlaß- und -auslaßmittel für kontinuierliche Zuführung von frischem Medium in die Kammer und Trägermittel zum Halten der unreifen Embryonen oberhalb der Oberfläche des Mediums aufweist.

46. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 43, 44 und 45, wobei das Gefäß zusätzlich Mittel zum Verfügung stellen und regeln eines Luftflusses in der Kammer umfaßt.

47. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 16, 17 oder 18, wobei die somatischen Embryonen nach der Trocknung gefroren werden.

48. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 16, 17 oder 18, wobei die somatischen Embryonen nachfolgend rehydratisiert und/oder in Gegenwart eines Osmotikums gekeimt werden.

49. Das Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Konzentration das Osmotikums nicht über ungefähr 30% liegt.

50. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 16, 17 oder 18, wobei die Embryonen nach Trocknung eingekapselt werden.