JPH0231624A

JPH0231624A - 人工種子の製造方法

Info

Publication number: JPH0231624A
Application number: JP63180355A
Authority: JP
Inventors: Noboru Kaimori; 貝守　昇; Shigeto Takahashi; 成人高橋; Mamoru Ouchi; 大内　衛
Original assignee: Tohoku Electric Power Co Inc
Current assignee: Tohoku Electric Power Co Inc
Priority date: 1988-07-21
Filing date: 1988-07-21
Publication date: 1990-02-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）この発明は、植物不定胚を用いて製造される人工種子に
係り、特にその長期貯蔵を可能とする製造方法に関する
。

（従来の技術）近年、植物組織培養を利用した植物の大量増殖法として
、人工種子が注目されている。この人工種子とは、カル
スより分化した不定胚あるいは胚様体をカプセルに包埋
し、栄養物等を含有させてこれに繁殖体としての種子と
同じ様な役割を人工的に与えたものである。そして、こ
の人工種子が自然界の種子に比べて持つ利点は、胚様体
を含むゲル中に弱毒ウィルスや農薬あるいは除草剤等を
封入することにより、自然の種子にはない機能をも備え
ることができることである。

（発明が解決しようとする課題）しかしながら、この人工種子に用いる不定胚は、受精に
より発生する種子の胚（受精胚）と形態や発育は同じで
あるが、種皮がないこと、初期生育のための貯蔵養分が
少ないこと、成長力に差異があること、貯蔵性がよいこ
と等の点で異なっている。このため、人工種子を実用化
するためには、（１）遺伝的変異が少なく成長力の高い
、質・量ともに優れた不定胚を得ること、（２）　　自然の種子と同様に取り扱うことのできる包
埋材料及び包埋方法を確立すること、（３）人工種子を
長期間貯蔵する方法を確立すること、のような大きな問題点を解決しなければならない。

従来技術では、得られた不定胚に栄養成分など水分の多
い状態でカプセル化されていたのは、不定胚の植物体再
生に必須と考えられていたためであり、長期間保存に耐
えることができなかった。

この発明は、不定胚より植物体再生には障害となると考
えられていた水分減少下すなわち乾燥状態に不定胚をお
いて、その乾燥不定胚より乾燥前と同様に植物体を再生
することによって長期間貯蔵可能な人工種子の製造方法
を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段・作用）受精胚は、ある発育段階に達すると乾燥に耐え得ること
が可能となり、さらに成熟した種子の胚は低温乾燥下で
長期間貯蔵することが知られている。また、受精胚では
水分含量が低下する前にａｂｓｃｊｓｌｃ　　ａｃｉｄ
　（Ａ　Ｂ　Ａ　）含量が増大するという知見もある。

カルスから分化した不定胚は、受精胚とその由来は異な
るし、また植物におけるような種子形成能をもたない。

しかし、不定胚にも乾燥に耐えるような機能を持ち得れ
ば長期間貯蔵に極めて好都合である。そこで、カルスよ
り不定胚を形成させたあと、ＡＢＡの存在、不存在下乾
燥し、長期間貯蔵後の植物体再生を鋭意検討の結果、不
定胚を乾燥しても十分長期間の貯蔵後植物体を再生でき
ることを見出だし、この発明に達した。

（実施例）以下、この発明の実験例を述べる。なお、この実験で使
用される材料としては、市販されている人参（品種名　
スーパー大型五寸人参、渡辺種苗株式会社）を用いてい
る。なお、人参の不定胚は、受精胚と同様に球状胚、ハ
ート型胚及び魚雷型胚を経て形成される。

実　　験　　Ｉ不定胚形成カルスの乾燥後の植物体再生（１）実験方法まず、１９８６年７月３１日に、上記実験材料の種子を
、７０％エチルアルコールに１分間、２％次亜塩素酸ナ
トリウムに２０分間浸漬して殺菌し１．無菌水で６回洗
浄して１８　Ｘ　１３０　ｍｒｔｔの試験管内の寒天培
地（１０ｒ！Ｌり上に播種する。その後、上記種子を実
験室内の直射日光の当たらない明所で育成させる。この
寒天培地は、グリシン２００ｊ２９．／）、ニコチン酸
５０ｎ／ノ、塩酸ピリドキシン５０１９／１！、　　ミ
オイノシトール１０１Ｓ／ｌ及び塩酸チアミン１０１１
！；Ｉ／ノを加えたＭＳ培地に、３０９／Ｉ！の蔗糖及
び９’；ｉ／ｌ！の寒天を加えたもの（以下ＭＳ基本培
地という）である。

上記播種後、３３３日目４〜５１ｎＭに切断した胚軸を
、５Ｘ１０−’Ｍの２．４−Ｄを含むＭＳ基本培地上に
置床し、２７℃の暗所で培養してカルスを誘導する。そ
して、３９日後に、２．４−Ｄを含まないＭＳ基本培地
にカルスを移植し、２７℃。

約１０００ルツクスの下で不定胚を誘導する。この実験
による培養は、全て上記の温度及び光条件下で行なって
おり、その結果、１４〜１８日後に不定胚分化を確認す
ることができた。なお、不定胚の確認は４０倍の実体顕
微鏡を用い、幼苗の確認は肉眼で行なっている。

ＡＢＡ処理は、不定胚分化を確認後２週間目から３日間
行なっている。ＡＢＡ処理には、魚雷型不定胚１０〜１
５個体、幼苗２〜３個体が確認されたカルス（約１０１
Ｇ）を用いている。そして、小シャーレ（２０Ｘ１０Ｍ
）に１０Ｘ２０市の濾紙（東洋濾紙２）を６枚重ね置き
、１０−６１０′５及び１０−４　ＭのＡ　Ｂ　Ａ、を
含むＭＳ液体培地と、ＡＢＡを含まないＭＳ液体培地と
をＩＣＣづつ加え、その上にカルスを置床し処理してい
る。

乾燥処理は、３０９の乾燥したシリカゲルを入れた腰高
シャーレ（６Ｘ４．５ｆｆ）を用いて行なっている。す
なわち、このシャーレ内に、０．５紅のＭＳ液体培地を
含む濾紙（１０Ｘ１５＋＋＋ｍ）４枚を重ね置いた小シ
ャーレ（２”ＯｘｌＯｍｚ）を入れ、この濾紙上にカル
スを置床し腰高シャーレをパラフィルムでシールして乾
燥させる。処理開始１２〜１６時間後にカルスの水分含
量は、約４％の乾燥状態となった。乾燥後のシリカゲル
の青色は、乾燥前とほとんど同じであった。そして、乾
燥開始後２日目に、カルスを直接ＭＳ基本培地上に移し
生存を観察する。

なお、上記実験は全て無菌条件下で行なっている。すな
わち、液体培地あるいは寒天培地は、１２１℃で１５分
間オートクレーブで減菌し、シリカゲルと腰高シャーレ
は、１６０℃で１時間乾熱減菌を行なっている。

（２）実験結果乾燥カルスをＭＳ基本培地上で培養してから３５日間の
結果を表１に示している。

表　　１表１から明らかなように、ＡＢＡ１０″５Ｍ区で３個の
全てのカルスに、１０−４Ｍ区で３個のカルス中１個か
ら多数の植物体の再生が確認されている。第１図に示す
写真は、ＡＢＡ１０′５Ｍで３日間培養後乾燥したカル
スより再生している人参幼植物の、ＭＳ基本培地に置床
後１８日間の生育状況を示している。

なお、ＡＢＡＩＯづＭ及び１０−４Ｍの両区で、乾燥前
に肉眼で確認できるまでに生育していた幼苗は、乾燥に
より全て褐変し枯死した。また、ＡＢＡＩＯ”Ｍ処理区
のカルスをＭＳ培地に置床後、１９日ロー再生個体を他
の試験管に移植し、その後その一部を１４日ロー他の試
験管に移す操作を２回繰り返した結果、極めて多数（約
８０００個体）の再生個体が得られた。

実　　験　　■ 不定胚形成カルスの乾燥貯蔵と植物体再生（１）実験方
法２．４−Ｄを５Ｘ１ｆｌ’Ｍ含むＭＳ基本培地で継代培
養してきたカルスをＭＳ基本培地で一週間培養し、つい
でＡＢＡ処理を１０日間行なった。

この処理は、小シャーレ（２０Ｘ１０ｚｚ）に１０１０
Ｘ１５の濾紙６枚を重ね置き、これにＡＢＡＩＯ”、１
０−５及び１０−４Ｍを含むＭＳ液体培地と、その対照
としてＡＢＡを含まない培地とをそれぞれＩｃｅづつ加
え、この濾紙上にカルスを置床して行なった。また、上
記と同様の濃度のＡＢＡを含む寒天培地（寒天５ｇ／）
のＭＳ培地）上でも、同じ実験を行なった。

乾燥は、蓋をしたままの小シャーレを、３０ｇのシリカ
ゲルを入れた乾燥用の腰高シャーレに入れて行なってい
る。この場合、乾燥状態（水分含量的４％）に達するま
でに５〜６日を要した。そして、この乾燥状態で６日間
及び１４日間保存した後、カルスを直接ＭＳ基本培地上
に置床し生存を観察する。

（２）実験結果まず、不定胚形成カルスに、濾紙上でＡＢＡ処理及び乾
燥処理を行ない、６日間及び１４日間乾燥貯蔵した後、
ＭＳ基本培地に置床してから３０日口の生存カルス数を
、表２及び表３にそれぞれ示している。

表　　２表２及び表３から明らかなように、貯蔵期間が６日間及
び１４日間の両区において、ＡＢＡ濃度１０−６Ｍ区で
供試カルス数の５０％から植物体の再生が認められた。

ＡＢＡＩＯ−５，１０−４Ｍ及びその対照区でも、生存
を示す白色のカルス組織が認められたが、これらの区か
らは再生誘導を開始して２ケ月後でもカルスの増殖や植
物体の再生は認められなかった。

第２図に示す写真は、濾紙上でＡＢＡ処理し６日間乾燥
貯蔵した後、ＭＳ、２！本培地に置床後２５日間の生育
状況を示している。なお、第２図において、図中左から
、ＡＢＡＩＯ−’　　１０″５１０″６及び０Ｍ処理の
カルスから植物体が生育している状況を示している。ま
た、第３図に示す写真は、濾紙上でＡＢＡ処理し１４日
間乾燥貯蔵した後、ＭＳ基本培地に置床後２２日目の生
育状況を示している。なお、第３図において、図中左か
ら、ＡＢＡｌｏ−’、１０う、１０″′６及び０Ｍ処理
のカルスから植物体が生育している状況を示しており、
試験管上部に見える白い部分はカルスの乾燥に用いた濾
紙である。

次に、寒天上でＡＢＡ処理及び乾燥処理を行ない６日間
及び１４日間乾燥貯蔵した後、ＭＳ基本培地に置床して
から２０日目の生存カルス数を、表４及び表５にそれぞ
れ示している。

表　　４表４及び表５から明らかなように、ＡＢＡ無処理区の１
４日間乾燥貯蔵した区で、１つのカルスのみが生存して
いた。第４図に示す写真は、寒天上でＡＢＡ処理し１４
日間乾燥貯蔵した後、ＭＳ基本培地に置床後２５日目の
生育状況を示している。なお、第４図において、図中左
から、ＡＢＡｏ、１０（′、１０′５及び１０−４Ｍ処
理のカルスから植物体が生育している状況を示している
。

このように、濾紙上で乾燥した場合には、寒天上で乾燥
した場合よりも多くのカルスが生存している。前者では
ＡＢＡＩＯ”Ｍ処理区で１０個の生存カルスが見られた
が、後者ではＡＢＡ無処理区で１個の生存カルスが存在
しただけである。なお、濾紙及び寒天上のカルスは、両
区とも５〜６日で乾燥し、画処理区間ではほとんど差異
が認められなかった。

実　　験　　■ 乾燥不定胚の植物体再生（１）実験方法カルスをＭＳ基本培地に移植して２〜３週間後に実体顕
微鏡（４０倍）を用いて、０．５〜ｌｌ１１ｍ未満と１
〜２堕未満の魚雷型不定胚及び５〜８１ｎ１１の幼苗を
分離し、実験Ｉと同様の方法で乾燥させる。ただし、こ
の実験では、直径３５ｍｍの濾紙１枚を用いている。こ
の場合、不定胚及び幼苗は、いずれも乾燥開始後約１２
時間で乾燥状態に達し、その１．５日後に２０ＭのＭＳ
基本培地を含むシャーレ（６０Ｘ１５Ｂ）に直接濾紙と
ともに置床している。なお、この実験では、乾燥前にＡ
ＢＡ処理は行なっていない。

（２）実験結果魚雷型不定胚及び幼苗を乾燥した後の、ＭＳ基本培地に
置床後２週間口の植物体再生数を表６に示している。

表　　６ただし、（）内は２週間後も白い状態で生育が認められ
ない不定胚数を示し、［］内は子葉部分や根の先端が白
色で生存しているが、他の部分が褐変している個体数を
示している。

表６から明らかなように、０．５〜ＩＭ未満の不定胚で
は、ＭＳ基本培地に置床後生存していたものは、４０個
体中２６個体（６５％）あり、その中の１４個体（供試
個体の３５％）が幼植物となった。すなわち、ＡＢＡ処
理を行なわず不定胚を単独で乾燥させても、不定胚は生
存していることが確認される。第５図に示す写真は、０
．５酎未満の魚雷型不定胚を乾燥し、ＭＳ基本培地に置
床後２週間口の結果を示すもので、黒い部分が生育して
いる個体であることを示している。なお、残りの１２個
体は、５週間後でも白い状態であり生育は認められなか
った。

一方、生育を始めた１４個体は、さらに生育を続け、Ｍ
Ｓ培地に置床後５週間（第５図の状態から３週間後）で
、第６図に示す写真のような幼植物となった。また、１
〜２Ｍ未満の不定胚は、２０個体のうち１２個体が白い
状態であり、５週間後でも生育は認められなかった。さ
らに、幼苗は、子葉部分や根の先端が白色の状態であっ
たが生育は認められなかった。

実　　験　　■ （１）実験方法黄白色の柔らかいカルスを、ＡＢＡｏ、１０−６１０−
５．１０−’Ｍ含むＭＳ基本培地で３０日間培養し、シ
リカゲルを入れた腰高シャーレ内で乾燥させた（水分含
量４％）。この場合、８〜１０時間で急速乾燥させたカ
ルスと、３０〜３６時間かけてゆっくりと乾燥させたカ
ルスとを用意する。

そして、乾燥時間の異なるカルスを、１，４．８週間乾
燥貯蔵後、４つづつ直接ＭＳ寒天培地に置床し、生存を
観察する。

（２）実験結果１．４．８週間乾燥貯蔵した後の植物体再生率を、表７
．８．９にそれぞれ示している。

表　　７表　　８表　　９ただし、＋＋＋は多くの苗木が再生されたことを示し、
＋＋は数個の苗木が再生されたことを示し、＋は２〜３
の苗木が再生されたことを示し、±は白いままで苗木が
再生されなかったことを示している。また、表７．８は
それぞれ乾燥カルスをＭＳ寒天培地に置床後２７℃の状
態で３週間後にふ化した生存数を示し、表９は乾燥カル
スをＭＳ寒天培地に置床後２７°Ｃの状態で２週間後に
ふ化した生存数を示している。

表７．８．９から明らかなように、３０〜３６時間かけ
てゆっくり乾燥させたカルスからは、ＡＢＡ処理にあま
り関係なく多数の植物体の再生が確認され、人参の不定
胚が長期間の乾燥貯蔵に耐え得ることがわかる。

実　　験　　Ｖ（１）実験方法黄白色の柔らかいカルスをＡＢＡｏ、１０″６１０−５
．１０−４Ｍ含むＭＳ寒天培地で２週間培養し、実験■
と同様にシリカゲルを入れた腰高シャーレ内で１２時間
乾燥させた。そして、１週間及び１０か月間乾燥貯蔵後
、ＭＳ寒天培地に置床し、生存を観察する。

（２）実験結果１週間及び１０か月間乾燥貯蔵した後の植物体生存数を
、表１０．１１にそれぞれ示している。

表１０表１１表１０は１週間乾燥貯蔵後のカルスをＭＳ寒天培地に置
床後２７℃の状態で２週間後にふ化した生存カルス数を
示し、表１１は１０か月間乾燥貯蔵後のカルスをＭＳ寒
天培地に置床後２７℃の状態で１．２，３．４週間後に
ふ化した生存カルス数をそれぞれ示している。乾燥貯蔵
期間が長いほど、ＡＢＡ処理の効果があることが認めら
れる。

以上の実験１−Ｖかられかるように、カルス中に存在す
る不定胚は十分乾燥に耐え得ることが示され、ＡＢＡ処
理を施すことにより少なくとも１０か月は乾燥貯蔵でき
ることが認められる。そして、この乾燥貯蔵は現在も継
続中であり、乾燥カルス中の不定胚はかなり長期の乾燥
貯蔵にも耐えられると考えられる。なお、不定胚をカル
スから分離して乾燥した場合にも、胚の発達が０，５〜
１　ｍｍ未満の魚雷型胚は、供試不定胚の３５％が植物
体を形成したことが確認されている。

（発°明の効果）したがって、以上詳述したようにこの発明によれば、不
定胚を乾燥させることにより、従来できなかった人工種
子の長期間の貯蔵を可能とし得る極めて良好な人工種子
の製造方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡＢＡ１０″５Ｍで３日間培養後乾燥させたカ
ルスより再生している生物の形態を示す写真、第２図及
び第３図はそれぞれ濾紙上でＡＢＡ処理し６日間及び１
４日間乾燥貯蔵したカルスより再生している生物の形態
を示す写真、第４図は寒天上でＡＢＡ処理し１４日間乾
燥貯蔵したカルスより再生している生物の形態を示す写
真、第５図及び第６図はそれぞれ魚雷型不定胚を乾燥さ
せＭＳ基本培地に置床後２週間目及び５週間目の生物の
形態を示す写真である。第１図出願人代理人　弁理士　鈴江武彦第２図第図第５図

Claims

【特許請求の範囲】

植物不定胚を用いて製造される人工種子において、前記
不定胚を乾燥させて貯蔵することを特徴とする人工種子
の製造方法。