CN108668898A - 一种猴樟的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猴樟的组织培养方法，主要包括以下步骤：（1）诱导培养；（2）生根培养；（3）炼苗与移栽。本发明选择具有优良性状、生长正常的猴樟树作为母树，以茎段诱导培养出的嫩芽作为外植体，有效的保持了优良母本的稳定性状，与常规的扦插繁殖相比，组织培养能够用较少的优良母本繁殖出大批量的种苗，适用于规模化生产。本发明的取材方便，材料来源、数量充足，容易获得无菌材料；筛选获得植株再生的猴樟无性系，可大大提高农杆菌介导遗传转化的转基因获得率，不受季节限制，有效缩短猴樟的遗传转化周期，是一种高效的猴樟再生体系。
Description
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种猴樟的组织培养方法。
技术背景
猴樟(Cinnamomun bodinieri Levl.)为樟科、樟属常绿乔木，是我国亚热带常绿阔叶林中的伴生树种之一，具有生长迅速、材质优良、树形美观、抗病虫害、抗污染、适应性强等优点，是目前重要的造林绿化树种和经济树种。猴樟作为园林树种应用研究尚处于起步阶段，国外也未见相关报道，贵州农业大学韦小丽课题组于2016年提出猴樟作为园林绿化树种的可能性，猴樟开始在南方各省区园林绿化中应用。江西邓志平园林绿化有限公司于2012年首次在江西地区开展了播种苗培育技术和越冬防寒技术研究，2016年与江西农业大学联合探索猴樟容器播种育苗技术，而播种繁殖存在季节性强、萌芽率低、变异大、优良性状难以保存的问题；2013年刘细清提出猴樟扦插繁殖技术，而扦插繁殖存在繁殖系数低、受环境影响大、季节性强的缺点；组织培养技术具有繁殖系数大、受环境影响小、繁殖速度快、后代培养性状稳定、适合批量生产的特点，能够符合猴樟大量生产繁殖的市场需求，然而关于猴樟组织培养繁殖技术至今仍是空白。
发明内容
本发明针对背景技术中的问题，研究了一种猴樟的组织培养方法，组织培养具有技术繁殖系数大、受环境影响小、繁殖速度快、后代培养性状稳定，适合批量生产的特点。
为实现上述目的，本发明技术解决方案如下：
一种猴樟的组织培养方法，主要包括以下步骤：
（1）诱导培养
以表型优良、生长正常、无病虫害的成年猴樟优良表型为母株，剪取猴樟母株一年生的枝条，切成含1个侧芽的茎段作外植体，将切下的外植体用漂白粉上清液浸泡4-5分钟后，用流水冲洗20分钟，用吸水纸去取多余水分；在超净工作台上将外植体置于灭过菌的大烧杯中，用75％的酒精溶液消毒15秒，然后用2％的次氯酸钠溶液消毒25-30分钟，用无菌水冲洗3遍；将制备好的无菌材料切成长1.5-2cm的小茎段，每个茎段含1个侧芽，接种在诱导培养基上进行培养，茎段单芽发育成长2-3cm的不定芽，转入生根培养基进行生根培养；
（2）生根培养
将2-3cm的不定芽从基部剪切，在超净工作台上接种到生根培养基上进行生根培养，培养35-40d后，长成2-4条黄白色根；
（3）炼苗与移栽
将生根培养后的组织培养苗进行炼苗处理，之后进行移栽；移栽时，将猴樟组培苗放入清水盆中，洗去根部琼脂，用0.1%的高锰酸钾处理后移栽至盆栽基质中，搭建小拱棚并盖塑料薄膜，外加70%透光率的遮阳网，待有新叶长出后，揭去遮阳网和塑料薄膜，按常规苗圃育苗措施管理。
优选地，所述步骤（1）诱导培养基为MS+BA 4mg/L+2，4-D 0.24mg/L+NAA 0.54mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3.5g/L， pH值为5.8。
优选地，所述步骤（1）诱导培养基培养条件为温度25±2℃，湿度65-80％，光照强度2200lux，光照时间为12h/d，黑暗时间为12h/d，培养30d。
优选地，所述步骤（2）生根培养基为MS+IBA 0.5-1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂粉3.5g/L。
优选地，所述步骤（2）生根培养基培养条件为温度25±2℃，湿度65-80％，光照强度2100lux，光照时间为10h/d，黑暗时间为14h/d，培养35-40d。
优选地，所述步骤（3）炼苗条件为光照时间13h/d，黑暗时间11h/d，光照强度为2000lux，温度22±2℃，相对湿度为65-80%，时间为6d。
优选地，所诉步骤（3）中盆栽基质配方为泥炭土：蛭石：珍珠岩=3：1：1。
本发明有益效果：
1、本发明选择具有优良性状、生长正常的猴樟树作为母树，以茎段诱导培养出的嫩芽作为外植体，有效的保持了优良母本的稳定性状，与常规的扦插繁殖相比，组织培养能够用较少的优良母本繁殖出大批量的种苗，适用于规模化生产。
2、本发明的取材方便，材料来源、数量充足，容易获得无菌材料；筛选获得植株再生的猴樟无性系，可大大提高农杆菌介导遗传转化的转基因获得率，不受季节限制，有效缩短猴樟的遗传转化周期，是一种高效的猴樟再生体系。
具体实施方式
下面结合实施例来具体阐述本发明。
实施例：一种猴樟的组织培养方法，具体包括以下步骤：
1.诱导培养
(1)外植体的预处理：以表现优良、生长正常、无病虫害的成年猴樟优良表型为母树，剪取猴樟母树当年生的枝条，去除叶片和叶柄，切成含1个侧芽的茎段作为外植体，外植体长3-5cm，茎粗0.3-0.4cm，茎表皮无伤口，切口为横切面以减小伤口面积。将切下的外植体用漂白粉上清液浸泡4-5分钟后，再用流水冲洗20分钟，备用。
(2)外植体的灭菌处理：将经过流水冲洗后的外植体沥干水分，用吸水纸吸取多余水分。在超净工作台上用75％的酒精溶液消毒15秒，然后用2％的次氯酸钠溶液消毒25-30分钟，用无菌水冲洗3遍，待接种。
(3)接种培养：外植体经灭菌处理后置于超净工作台上（灭菌的托盘内），用手术刀切除外植体两侧旧伤口部位，切成长1.5-2cm的小茎段，每个茎段含1个侧芽，接种在诱导培养基上进行培养。诱导培养基为MS+BA 4mg/L+2，4-D 0.24mg/L+NAA 0.54mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3.5 g/L（MS培养基配方见表1），用pH 计检测pH 值，并用0.1mol·L-1的NaOH或HCl调节pH 值为5.8，将配好的培养基分装于50ml三角瓶中，分装时注意不要把培养基倒在瓶口上，以防引起污染，然后用封口膜封口，装入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。封口膜为防菌透气膜，孔隙为0.2-0.3μm，开孔率80-90﹪。接种后，培养条件为温度25±2℃，湿度为65-80％，光照2200lux，光照时间为12h/d，黑暗时间为12h/d，培养30d，茎段单芽发育成2-3cm不定芽，诱导率90%，转入生根培养基进行生根培养。
2.生根培养：
将2-3cm的不定芽从基部剪切，在超净工作台上接种到生根培养基上，生根培养基为MS+IBA 0.5-1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂粉3.5 g/L。接种后，培养条件为温度25±2℃，湿度为65-80％，光照2100lux，光照时间为10h/d，黑暗时间为14h/d，培养15-20d，不定芽基部形成2-4个白色可见根原基，培养35-40d后，长成2-4条黄白色根；此时苗高3-4cm，4-5片叶，根长2.5-3.5cm，根系直径1-1.5mm，生根率为72%。
3.炼苗与移栽
将生根培养后的组织培养苗进行炼苗处理，炼苗条件为光照时间13h/d，黑暗时间11h/d，光照强度为2000lux，温度为22±2℃，相对湿度为65-80%，时间为6d，瓶口半开，使其逐步适应外部生长环境。
经炼苗得到的猴樟苗取出，放入清水盆中，洗去根部琼脂，然后捞出，用0.1%高锰酸钾处理后移栽至盆栽基质（泥炭土：蛭石：珍珠岩=3：1：1），盆高24cm，上口直径20cm。猴樟小苗移栽后，当天喷施稀释20倍的MS营养液，搭建小型塑料薄膜拱棚并盖实，覆盖70%透光率的遮阳网，维持小温棚内湿度为90%以上，7d后打开部分薄膜通风，15d后新叶明显长出时揭去塑料薄膜和遮阳网，进行正常水肥管理，移栽成活率达到93％。
表1 MS培养基配方
pH值用0.1mol/L的HCL或0.1mol/L NaOH调节。
Claims (7)
1.一种猴樟的组织培养方法，其特征在于：主要包括以下步骤：
（1）诱导培养
以表型优良、生长正常、无病虫害的成年猴樟优良表型为母株，剪取猴樟母株一年生的枝条，切成含1个侧芽的茎段作外植体，将切下的外植体用漂白粉上清液浸泡4-5分钟后，用流水冲洗20分钟，用吸水纸去取多余水分；在超净工作台上将外植体置于灭过菌的大烧杯中，用75％的酒精溶液消毒15秒，然后用2％的次氯酸钠溶液消毒25-30分钟，用无菌水冲洗3遍；将制备好的无菌材料切成长1.5-2cm的小茎段，每个茎段含1个侧芽，接种在诱导培养基上进行培养，茎段单芽发育成长2-3cm的不定芽，转入生根培养基进行生根培养；
（2）生根培养
将2-3cm的不定芽从基部剪切，在超净工作台上接种到生根培养基上进行生根培养，培养35-40d后，长成2-4条黄白色根；
（3）炼苗与移栽
将生根培养后的组织培养苗进行炼苗处理，之后进行移栽；移栽时，将猴樟组培苗放入清水盆中，洗去根部琼脂，用0.1%的高锰酸钾处理后移栽至盆栽基质中，搭建小拱棚并盖塑料薄膜，外加70%透光率的遮阳网，待有新叶长出后，揭去遮阳网和塑料薄膜，按常规苗圃育苗措施管理。
2.如权利要求1所述的一种猴樟的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（1）诱导培养基为MS+BA 4mg/L+2，4-D 0.24mg/L+NAA 0.54mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉3.5g/L， pH值为5.8。
3.如权利要求2所述的一种猴樟的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（1）诱导培养基培养条件为温度25±2℃，湿度65-80％，光照强度2200lux，光照时间为12h/d，黑暗时间为12h/d，培养30d。
4.如权利要求1所述的一种猴樟的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（2）生根培养基为MS+IBA 0.5-1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂粉3.5g/L。
5.如权利要求4所述的一种猴樟的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（2）生根培养基培养条件为温度25±2℃，湿度65-80％，光照强度2100lux，光照时间为10h/d，黑暗时间为14h/d，培养35-40d。
6.如权利要求1所述的一种猴樟的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（3）炼苗条件为光照时间13h/d，黑暗时间11h/d，光照强度为2000lux，温度22±2℃，相对湿度为65-80%，时间为6d。
7.如权利要求6所述的一种猴樟的组织培养方法，其特征在于：所诉步骤（3）中盆栽基质配方为泥炭土：蛭石：珍珠岩=3：1：1。
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