CN103270947B

CN103270947B - 一种司牛角组织培养的方法

Info

Publication number: CN103270947B
Application number: CN201310074077.9A
Authority: CN
Inventors: 牟豪杰; 陈志�; 汪一婷; 吕永平; 周迪江; 陈剑平
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2013-03-08
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2033-03-08
Also published as: CN103270947A

Abstract

本发明涉及一种司牛角组织培养的方法，包括如下步骤：培养基的配制、外植体的选取与消毒、种子无菌萌发、不定芽诱导、不定芽增值、不定芽生根诱导、组培苗驯化及移栽。基本培养基选用MS培养基，蔗糖用量为20～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，培养基pH分装前调整为5.7～5.8；种子萌发培养基为MS或1/2MS培养基；不定芽诱导培养基为MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；不定芽增殖培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；生根培养基为MS+IBA0～1.0mg/L或1/2MS+IBA0～1.0mg/L。本发明的优点：建立的司牛角组培快繁技术体系增殖系数3～3.5，生根率95％以上，移栽成活率100％，组培苗健壮均匀，适合优良司牛角种苗规模化生产。

Description

一种司牛角组织培养的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术、植物茎尖培养技术，主要是一种司牛角组织培养的方法。背景技术

司牛角(Duvalia angustiloba)，为萝藦科(ASCLEPIADACEAE)玉牛角属(Duvalia)多肉植物，产于非洲南部，喜温暖干燥和阳光充足环境。不耐寒，怕高温，耐干旱但不耐湿，以肥沃、排水良好的沙壤土为好，冬季温度不低于5℃。司牛角植株小巧玲珑，茎肉质状短而粗，4～6棱，棱边有排列不规则的齿，花着生在新茎上，单生或集生于短花梗上，观赏价值较高，目前主要用于盆栽观赏，适合阳台、窗台和书桌点缀。

司牛角繁殖方式主要采用分株和扦插繁殖。分株一般在春季4～5月换盆时进行，将生长过密的植株扒开分栽，因根系少而浅，栽植后不宜多浇水，保持盆土稍湿润即可。扦插应选择充实、短而粗的茎杆作插穗，剪口不宜过大，稍干燥后再插入沙床。传统繁殖方式受季节、年限及栽培技术限制严重，每年繁殖数量有限，不利用司牛角的推广。

植物组织培养技术被认为是目前最高效的植物种苗快繁技术手段，目前，国内外尚未见到利用植物组培技术对司牛角进行快速繁殖的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种司牛角组织培养的方法，解决建立良好的司牛角组培再生体系，为司牛角种苗生产、新品种创制及品质遗传改良等做好技术支持。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种司牛角组织培养的方法，该方法包括以下几个步骤：

1)、外植体的选取及处理：选取司牛角种子作为起始材料，将收集到的司牛角种子经过浸种2h后，选择沉在容器底部的种子作为外植体，作为组培用外植体；

2）、种子萌发：在超净工作台上，将经过表面消毒的司牛角种子转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于种子萌发培养基MS或1/2MS培养基中进行种子萌发，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1；

3）不定芽诱导：种子萌发获得的干净、成活材料在无菌工作台上接种于不定芽诱导培养基MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L中，进行不定芽的诱导，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1；

4）不定芽增殖：在无菌工作台上，将不定芽诱导培养获得的1～2cm高的不定芽2～3个一丛，利用无菌的解剖刀将丛芽基部造成伤口，接种于不定芽增殖培养基中增殖，不定芽增殖培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1；

5）、不定芽生根诱导：将高生长到3～5cm的丛生不定芽3～5个一丛，接入生根培养基中进行不定根的诱导,生根培养基为MS+IBA0～1.0mg/L或1/2MS+IBA0～1.0mg/L或MS+NAA0～1.0mg/L或1/2MS+NAA0～1.0mg/，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1，生根率95％以上；

6）、组培苗驯化及移栽：丛生不定芽基部长出3～5条2～3cm的不定根后，将生根苗移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养1～2d，将司牛角生根植株整丛小心从培养瓶中取出，用自来水洗净组培苗基部的培养基,然后在通风阴凉处晾干至组培苗表面稍有皱缩,将司牛角组培苗，栽入基质中，保湿90％以上培养15d，然后在温室中正常培养。

种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，培养基pH分装前调整为5.7～5.8。

本发明有益的效果是：

1、通过组织培养技术进行司牛角种苗快繁，生产不受地区、季节、气候及母株生长年限的限制，便于工厂化育苗，可根据订单进行生产，生产时间及规模可控，为司牛角的推广应用提供充足的优质种苗保障。

2、繁殖系数达到3～3.5，生根率95％以上，移栽成活率100％，达到种苗工厂化育苗生产的要求，目前尚未见关于司牛角组织培养的文献报道。

3、司牛角不定芽诱导采用直接器官发生，无愈组织伤诱导及愈伤分化诱导环节，减少植物组培过程中后代变异的发生，后代种苗遗传背景一致，最大限度保持母本的优良性状。

4、有利于本属其他植物品种组培快繁体系建立借鉴、推广。

5、建立良好的组培快繁体系，为今后利用植物生物技术对司牛角进行新品种培育、遗传改良等研究工作奠定基础。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。

本发明所述的司牛角组织培养的方法，该方法包括以下几个步骤：

1、培养基及培养条件：种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，培养基pH分装前调整为5.7～5.8；种子萌发培养基为MS或1/2MS培养基；不定芽诱导培养基为MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；不定芽增殖培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；生根培养基为MS+IBA0～1.0mg/L或1/2MS+IBA0～1.0mg/L；初代培养、不定芽诱导及增殖、不定芽生根培养条件为，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1。

2、外植体的处理与消毒：选取司牛角种子作为起始材料，将收集到的司牛角种子经过浸种2h后，选择沉在容器底部的种子作为外植体，挑选好的外植体用洗洁精溶液清洗30min，期间不断轻轻搅拌，然后流水冲洗经洗洁精清洗的外植体材料30～50min，在已经过消毒的超净工作台上将经流水清洗过的司牛角种子转移至无菌锥形瓶中，用75%酒精浸泡60s，期间不断轻轻晃动锥形瓶，去除附在司牛角种子表面气泡，倒出75%酒精，再用0.1%HgCl₂溶液浸泡材料10～15min，或用有效氯浓度为1%NaClO溶液浸泡材料20～30min，浸泡期间不断轻轻晃动锥形瓶，去除附在司牛角种子表面气泡，倒出0.1%HgCl₂溶液或1%NaClO溶液，用无菌水清洗经过消毒处理的种子4～5次，处理后的种子用无菌水浸泡、备用。

3、种子萌发：在超净工作台上，将经过表面消毒的司牛角种子转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于种子萌发培养基MS或1/2MS培养基中进行种子萌发，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1。

4、不定芽诱导：种子萌发获得的干净、成活材料在无菌工作台上接种于不定芽诱导培养基MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L中，进行不定芽的诱导，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1。

5、不定芽增殖：在无菌工作台上，将不定芽诱导培养获得的1～2cm高的不定芽2～3个一丛，利用无菌的解剖刀将丛芽基部轻轻造成一些伤口，接种于不定芽增殖培养基中增殖，不定芽增殖培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1。

6、不定芽生根诱导：将高生长到3～5cm的丛生不定芽3～5个一丛，接入生根培养基中进行不定根的诱导,生根培养基为MS+IBA0～1.0mg/L或1/2MS+IBA0～1.0mg/L或MS+NAA0～1.0mg/L或1/2MS+NAA0～1.0mg/，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1，生根率95％以上。

7、组培苗驯化及移栽：丛生不定芽基部长出3～5条2～3cm的不定根后，将生根苗移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养1～2d，将司牛角生根植株整丛小心从培养瓶中取出，用自来水洗净组培苗基部的培养基,然后在通风阴凉处放置2～3天，晾干至组培苗表面稍有皱缩,将司牛角组培苗，栽入基质中，保湿90％以上培养15d，然后在温室中正常培养，移栽成活率100%。

最后，应当指出，以上实例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种司牛角组织培养的方法，其特征在于：该方法包括以下几个步骤：

2)、种子萌发：在超净工作台上，将经过表面消毒的司牛角种子转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于种子萌发培养基MS或1/2MS培养基中进行种子萌发，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1；

3)不定芽诱导：种子萌发获得的干净、成活材料在无菌工作台上接种于不定芽诱导培养基MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L中，进行不定芽的诱导，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1；

4)不定芽增殖：在无菌工作台上，将不定芽诱导培养获得的1～2cm高的不定芽2～3个一丛，利用无菌的解剖刀将丛芽基部造成伤口，接种于不定芽增殖培养基中增殖，不定芽增殖培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1；

5)、不定芽生根诱导：将高生长到3～5cm的丛生不定芽3～5个一丛，接入生根培养基中进行不定根的诱导,生根培养基为MS+IBA1.0mg/L或1/2MS+IBA1.0mg/L或MS+NAA1.0mg/L或1/2MS+NAA1.0mg/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m^-2·s^-1，生根率95％以上；

6)、组培苗驯化及移栽：丛生不定芽基部长出3～5条2～3cm的不定根后，将生根苗移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养1～2d，将司牛角生根植株整丛小心从培养瓶中取出，用自来水洗净组培苗基部的培养基,然后在通风阴凉处晾干至组培苗表面稍有皱缩,将司牛角组培苗，栽入基质中，保湿90％以上培养15d，然后在温室中正常培养。

2.根据权利要求1所述的司牛角组织培养的方法，其特征在于：种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，培养基pH分装前调整为5.7～5.8。