CN100346689C - 一种翅果油树试管苗的繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种翅果油树试管苗的繁殖方法。该方法包括以下步骤：1)以无菌种子苗的茎段、根段、子叶切段为外植体诱导愈伤组织；2)将愈伤组织置于预分化培养基上进行预分化；3)将步骤2)经预分化培养的愈伤组织置于分化培养基上进行不定芽的分化；4)将步骤3)长出不定芽原基的愈伤组织置于芽伸长培养基上促进芽的生长；5)对步骤4)获得的小苗用吲哚丁酸溶液浸泡法或微型扦插法进行生根培养。该方法简便快速、成本低廉，可在较短的时间内获得大量的翅果油树再生植株，具有商业生产的可行性。本发明为翅果油树的快速繁殖和该植物的保护性研究提供了理论和实践基础，也为进一步开展翅果油树的遗传转化、遗传改良和分子生物学研究奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种翅果油树试管苗的繁殖方法。
背景技术
翅果油树(Elaeagnus molis Diels)是胡颓子科、胡颓子属的一种多年生落叶灌木或乔木，也是一种新兴的油料和药用植物(中国树木志，1983)。目前，翅果油树已被列入国家重点保护野生植物名录(第一批)中，属国家二级保护植物，其分布范围狭窄，仅分布于山西吕梁山南段东侧的乡宁、河津、中条山南段西侧的翼城等县，此外，陕西渭河流域(户县涝峪沟)也有少量分布。经检测，该植物种仁的含油率高达51％，且油质好，可应用于食品、医药和工业领域，其中，亚油酸含量高达所含油脂总量的45％，维生素E的含量高达1558mg/100mg(冯宝英和杨坪荣，翅果油树种仁化学成分析研究[J].山西林业科技，4：6-9.1989)；经化学成分分析，其叶富含18种氨基酸，粗蛋白、粗脂肪，7种维生素，多种微量元素，3种黄酮类化合物，含量达58.5-58.8％的亚麻酸以及7.6-10.9％的亚油酸，因此可将其进一步开发为保健食品(王联结和白新生，翅果油树叶化学分析研究[A].见：王伏雄主编.北方植物学研究，(第一集)[C].南开大学出版社，141-146，1993)。此外，翅果油树开花早、花粉香，含蜜量大，是很好的早春蜜源植物，而且其根系发达，富含根瘤菌，能固氮，对贫瘠、干旱、寒冷、高温等逆境胁迫均具有较高的抗性(王毅岩，一种新的共生固氮植物—翅果油树[J].植物学报，(4)：359.1981；杨晓玲，郭金耀，张青娥，翅果油树生物学特性的研究[A].见：王伏雄主编.北方植物学研究(第一集)[C]，天津：南开大学出版社，215-218.1993)。目前，国家开发大西北，号召退耕还林，绿化荒山，翅果油树可作为优选树种进行推广。因此，综合开发利用翅果油树，具有较高的社会、环保和经济价值。然而，其开发利用也受到一些因素的限制，主要因素是繁殖率不高。
翅果油树有两种繁殖方式：其一为种子繁殖，但种子发芽率较低，已有研究表明，未经任何处理的种子，发芽率为5.93％，发芽后能正常发育成籽苗(Seedling)的仅为1.69％。经过沙积处理的种子的发芽率为45.76％，但发芽后能正常发育成苗的也仅为11.02％(山西省林科所造林组，翅果油树调查试验初报.山西林业科技，1：25-32，1974)。另外，翅果油树种子的寿命也短，保存一年后其发芽率几乎为零(上官铁梁，张峰，我国特有珍稀植物翅果油树濒危原因分析[J].生态学报，21(3)：502-505，2001)，且自然状态下的种子苗很少；其二是通过植株根蘖苗繁殖，但根蘖苗自生根能力差，繁殖系数低，而且，通过这种营养繁殖方法长成的苗木病害严重。因此利用组织培养方法，尤其用种子苗为材料进行快速繁殖生产的翅果油树苗木具有无病毒、无菌，且繁殖系数高等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种翅果油树试管苗的繁殖方法。
本发明所提供的翅果油树试管苗的繁殖方法，可包括以下步骤：
1)以无菌种子苗的茎段、根段或子叶切块为外植体诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，蔗糖和琼脂，pH值为5.0-6.5，优选为5.8；
2)将愈伤组织置于预分化培养基上进行预分化；所述预分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)，α-萘乙酸(NAA)，蔗糖和琼脂，pH值为5.0-6.5，优选为5.8；
3)将步骤2)经预分化培养的愈伤组织置于分化培养基上进行不定芽的分化；所述分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤，α-萘乙酸和琼脂，pH值为5.0-6.5，优选为5.8；
4)将步骤3)长出不定芽原基的愈伤组织置于芽伸长培养基上促进芽长成无根小苗；所述芽伸长培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤，α-萘乙酸，赤霉素(GA3)和琼脂，pH值为5.0-6.5，优选为5.8；
5)对步骤4)获得的小苗用吲哚丁酸(IBA)溶液浸泡法或微型扦插法进行生根培养，得到翅果油树试管苗；所述吲哚丁酸溶液浸泡法为将小苗的基部置于100-300mg/L吲哚丁酸溶液中浸泡0.5-2小时后，将基部插入1/2MS基本培养基中进行培养；微型扦插法为将小苗置于生根培养基上诱导生根，所述生根培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了α-萘乙酸，水解乳蛋白(LH)，吲哚丁酸，蔗糖和琼脂，pH值为5.0-6.5，优选为5.8。
在上述繁殖方法中，翅果油树无菌种子苗的获得方法可为：将种仁经消毒后置于添加有琼脂的1/2MS基本培养基，在(25±2)℃、光照时间10-12小时/天、光照强度1000-1500Lx的条件下进行培养，培养7天后移到7％琼脂培养基上继续培养；所述培养基中琼脂的含量为0.5-0.8％，优选为0.68或0.7％，pH值为5.0-6.5，优选为5.8。
愈伤组织的培养条件可为：在(25±2)℃下暗培养，暗培养时间为21-30天，优选的暗培养时间为28天。
为获得大量的愈伤组织，可将经诱导获得的愈伤组织再移至新的愈伤组织诱导培养基上，并在相同的愈伤组织培养条件下进行继代培养，每隔21-30天继代培养一次。
预分化的条件可为：在(25±2)℃下暗培养，暗培养时间为21-30天，优选的暗培养时间为28天。
不定芽的分化培养条件可为：在(25±2)℃、光照时间10-12小时/天、光照强度1000-1500Lx的条件下进行培养，培养时间为30-50天，优选的培养时间为40天。
促进芽伸长的培养条件可为：在(25±2)℃、光照时间10-12小时/天、光照强度1000-1500Lx的条件下进行培养，培养时间为20-28天，优选的培养时间为20天。
步骤5)生根培养方法中吲哚丁酸溶液的浓度优选为200mg/L，基部浸泡时间优选为2小时；生根培养条件为：在(25±2)℃、光照时间10-12小时/天、光照强度1000-1500Lx下进行培养。
在上述步骤中所用到的培养基添加剂或添加物的浓度(或含量)为：所述愈伤组织诱导培养基中2，4-二氯苯氧乙酸浓度为0.5-1.2mg/L，优选为1.0mg/L，蔗糖含量为2.5-3.5％，优选为3.0％，琼脂的含量为0.5-0.8％，优选为0.68％；所述预分化培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.5-1.2mg/L，优选为1.0mg/L，α-萘乙酸的浓度为0.1-1.0mg/L，优选为0.1mg/L，蔗糖含量为2.5-3.5％，优选为3.0％，琼脂的含量为0.5-1.0％，优选为0.7％；所述分化培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.5-1.2mg/L，优选为0.5或1.0mg/L，α-萘乙酸浓度为0.25-1.0mg/L，优选为0.25或0.5mg/L，琼脂的含量为0.5-1.0％，优选为0.7％；所述芽伸长培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.5-1.2mg/L，优选为0.5或1.0mg/L，α-萘乙酸的浓度为0.25-1.0mg/L，优选为0.25或0.5mg/L，赤霉素的浓度为0.1-1.0mg/L，优选为0.2或0.5mg/L，琼脂的含量为0.5-1.2％，优选为0.8％；所述生根培养基中α-萘乙酸的浓度为0.01-0.03mg/L，优选为0.02mg/L，水解乳蛋白的浓度为200-400mg/L，优选为300mg/L，吲哚丁酸的浓度为0.5-2.0mg/L，优选为1.0mg/L，蔗糖含量为2.0-3.0％，优选为2.5％，琼脂的含量为0.5-1.0％，优选为0.7％。
上述百分含量均为质量百分含量。
本发明提供了一种翅果油树试管苗的繁殖方法，该方法简便快速、成本低廉，可在较短的时间内(160-180天)获得大量的翅果油树再生植株，具有商业生产的可行性。本发明为翅果油树的快速繁殖和该植物的保护性研究提供了理论和实践基础，也为进一步开展翅果油树的遗传转化、遗传改良和分子生物学研究奠定了坚实的基础。
附图说明
图1为处于结果期的翅果油树
图2为翅果油树萌发30天的无菌种子苗
图3A为愈伤组织在第二次分化培养基上培养30天后分化出的不定芽和伸长的小苗
图3B为愈伤组织在第二次分化培养基上培养60天后由分化出的不定芽长成的小苗
图4为不定芽在含0.68％琼脂的分化培养基上发育成的玻璃化不健壮的小苗
图5为不定芽在含0.68％琼脂的芽伸长培养基上发育成的玻璃化不健壮的小苗(右)和在含0.8％琼脂的芽伸长培养基上发育成的健康植株的比对
图6为用吲哚丁酸溶液浸泡法进行生根培养获得的翅果油树试管苗完整植株
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所述百分比浓度均为质量百分比浓度。
实施例1、翅果油树试管苗的繁殖
培养基：
愈伤组织诱导培养基：添加1.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，3.0％蔗糖和0.68％琼脂的MS基本培养基，pH值为5.8。
预分化培养基：添加1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1mg/Lα-萘乙酸，3.0％蔗糖和0.7％琼脂的MS基本培养基，pH值为5.8。
分化培养基是：添加0.5或1.0mg/L6-苄基腺嘌呤，0.25或0.5mg/L α-萘乙酸和0.7％琼脂的MS基本培养基，pH值为5.8。
芽伸长培养基：添加0.5或1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.25或0.5mg/L α-萘乙酸，0.20或0.5mg/L赤霉素和0.8％琼脂的MS基本培养基，pH值为5.8。
生根培养基：添加0.02mg/Lα-萘乙酸，300mg/L水解乳蛋白，1.0mg/L吲哚丁酸，2.5％蔗糖和0.7％琼脂的1/2MS基本培养基，pH值为5.8。
一、翅果油树无菌种子苗的获得
取当年9月份成熟的翅果油树果实(处于结果期的翅果油树见图1)，剥去最外面的绵质外果皮后，用0.5％高猛酸钾或浓硫酸浸泡坚果6-12小时，然后用钳子小心去掉坚硬的中果皮(注意不要伤及胚，胚受损的弃之)，最后用镊子去掉内部的革质种皮，得到裸露的种仁。将种仁用常规的消毒方法(70％乙醇浸泡5-8min，再用0.1％HgCl2浸泡8-10min，最后用无菌水冲洗3-5遍)进行灭菌后，将其接种于1/2MS固体培养基(大量元素添加量为MS基本培养基的一半，微量元素和附加物不变，琼脂0.68％，pH值5.8)上，30℃暗培养7天后，转移到含7％琼脂培养基上光照培养。在光照时间10-12小时/天，光照强度为1000-1500Lx的条件下培养，得到翅果油树无菌种子苗(见图2)。
二、愈伤组织的诱导及继代培养
当步骤一的无菌种子苗长至7cm左右时(约需20-40天)，将茎段和根段切割为0.4-0.5cm长的小段，子叶切成0.5×0.5cm2小块作为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，在(25±2)℃下暗培养，约30天后，将外植体切口处长出的白色愈伤组织切成0.4×0.4cm2小块，移至新的愈伤组织诱导培养基上，在上述相同条件下进行继代培养，每隔21-30天继代培养一次，共继代2次，得到大量愈伤组织。
三、愈伤组织的预分化
将步骤二获得的愈伤组织分割成0.4×0.4cm2的小块，转接到预分化培养基上，在(25±2)℃下暗培养约28天后，除有少量不定芽分化外，大多数愈伤组织只是增殖生长。
四、愈伤组织的分化及不同浓度6-BA和NAA对愈伤组织分化不定芽的影响
将步骤三经预分化的愈伤组织再分割成0.4×0.4cm2的小块，转接到分别添加不同浓度(0、0.25、0.5、1.0mg/L)6-苄基腺嘌呤，不同浓度(0、0.25、0.5、1.0mg/L)α-萘乙酸和0.7％琼脂的MS基本培养基上，pH值为5.8，在(25±2)℃，光照时间10-12小时/天，光照强度为1000-1500Lx的条件下培养，同时观察并记录不定芽的分化情况。培养30天后的观察结果如表1所示，培养30-50天后，在其中五种培养基上，愈伤组织表面逐渐分化出许多球形、绿色的不定芽原基，再将含不定芽原基的愈伤组织转移到各自相同的新鲜培养基上，在相同条件下培养约20-30天，结果在大部分培养基中，有不定芽的分化(图3A)。已有的不定芽原基，继续发育为不定芽，并进一步长成小苗(图3B)。其中在添加有0.5或1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.25或0.5mg/Lα-萘乙酸的培养基中，不定芽的分化率较高，最高分化率达75％(18/24)，因此将添加0.5或1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.25或0.5mg/Lα-萘乙酸和0.7％琼脂的MS基本培养基定为优选的分化培养基。
表1 6-BA和NAA对愈伤组织分化不定芽的影响(激素浓度单位mgL-1)
| 0.250.51 | 愈伤组织不生长(0/21)褐色愈伤组织不生长(0/20)愈伤组织略生长(0/20) | 褐色愈，有少量绿色愈(0/24)绿色愈伤组织(0/20)褐色愈伤组织(0/20) | 黄绿色愈和不定芽原基(15/24)绿色愈伤组织(0/24)褐色愈伤组织(0/20) | 绿色愈伤和不定芽原基(18/24)淡黄绿色愈伤、芽原基(16/24)绿色愈伤组织(2/24) |
五、不定芽的伸长
在分化培养基上分化伸长的小苗数目少，且易玻璃化(见图4)。故将步骤四长出不定芽原基的愈伤组织小块置于芽伸长培养基上，在(25±2)℃，光照时间10-12小时/天，光照强度为1000-1500Lx的条件下培养促进芽的伸长，20-25天后，不定芽伸长成3-4cm的小苗。不定芽在含0.68％琼脂的芽伸长培养基上发育成的玻璃化不健壮的小苗和在含0.8％琼脂的芽伸长培养基上发育成的健康植株的比对如图5所示(图中右为玻璃苗)，在芽伸长培养基(琼脂浓度上升到0.8％玻璃苗减少，正常苗多)上长成的小苗数目多且正常。
六、无根苗的生根培养
可用吲哚丁酸(IBA)溶液浸泡法或微型扦插法对步骤五获得的无根苗进行生根培养，具体方法如下：
1、用吲哚丁酸溶液浸泡法进行生根培养及不同浓度吲哚丁酸、不同浸根时间对根生成的影响
截取从根段和子叶愈伤组织表面分化发育而成的长约3-4cm的小苗，分别浸泡在浓度为100ppm(mg/L)、200ppm的IBA溶液中0.5h、1h、2h，然后垂直插入1/2MS基本培养基中，在(25±2)℃，光照时间10-12小时/天，光照强度为1000-1500Lx的条件下培养，40天左右，在苗的基部有白色的根长出，得到翅果油树的试管苗(见图6)。其中以200ppm浓度的IBA溶液处理2h的生根效果较好，生根率为50％-60％。在1/2MS培养基中培养期间更换一次新鲜培养基培养。
2、用微型扦插法进行生根培养及不同浓度吲哚丁酸(IBA)对根生成的影响
截取从根段和子叶愈伤组织表面分化并伸长为3-4cm的小苗，将小苗基部垂直扦插到生根培养基中，生根基本培养基为添加0.02mg/Lα-萘乙酸，300mg/L水解乳蛋白，不同浓度(0.5、1.0、2.0mg/L)吲哚丁酸，2.5％蔗糖和0.7％琼脂的1/2MS基本培养基，pH值为5.8，在(25±2)℃，光照时间10-12小时/天，光照强度为1000-1500Lx的条件下培养，同时观察并统计生根率。培养45天后的生根率统计结果如表2所示，统计结果表明翅果油树试管苗的生根，培养基中IBA浓度为1.0mgL-1较适宜，可使无根小苗的生根率高达60％，故将添加0.02mg/Lα-萘乙酸，300mg/L水解乳蛋白，1.0mg/L吲哚丁酸，2.5％蔗糖和0.7％琼脂的1/2MS基本培养基定为优选的生根培养基。
表2 IBA水平对翅果油树试管苗生根的影响
| 培养基编号 | 培养基中IBA水平(mgL-1) | 接种苗数 | 小苗生根率(％) |
| 123 | 0.51.02.0 | 151616 | 16037.5 |
Claims (8)
1、一种翅果油树试管苗的繁殖方法，包括以下步骤：
1)以无菌种子苗的茎段、根段或子叶切块为外植体诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.5-1.2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸，2.5-3.5％的蔗糖和0.5-0.8％的琼脂，pH值为5.0-6.5；
2)将愈伤组织置于预分化培养基上进行预分化；所述预分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.5-1.2mg/L的6-苄基腺嘌呤，浓度为0.1mg/L的α-萘乙酸，2.5-3.5％的蔗糖和0.5-1.0％的琼脂，pH值为5.0-6.5；
3)将步骤2)经预分化培养的愈伤组织置于分化培养基上进行不定芽的分化；所述分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.5-1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤，浓度为0.25-1.0mg/L的α-萘乙酸和0.5-1.0％的琼脂，pH值为5.0-6.5；
4)将步骤3)长出不定芽原基的愈伤组织置于芽伸长培养基上促进芽长成无根小苗；所述芽伸长培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.5-1.2mg/L的6-苄基腺嘌呤，浓度为0.25-1.0mg/L的α-萘乙酸，浓度为0.1-1.0mg/L的赤霉素和0.8-1.2％的琼脂，pH值为5.0-6.5；
5)对步骤4)获得的小苗用吲哚丁酸溶液浸泡法或微型扦插法进行生根培养，得到翅果油树试管苗；所述吲哚丁酸溶液浸泡法为将小苗的基部置于100-300mg/L吲哚丁酸溶液中浸泡0.5-2小时后，将基部插入1/2MS基本培养基中进行培养；微型扦插法为将小苗置于生根培养基上诱导生根，所述生根培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.01-0.03mg/L的α-萘乙酸，浓度为200-400mg/L的水解乳蛋白，浓度为0.5-2.0mg/L的吲哚丁酸，2.0-3.0％的蔗糖和0.5-1.0％的琼脂，pH值为5.0-6.5。
2、根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于：所述步骤1)中无菌种子苗的获得方法为：将种仁经消毒后置于添加有琼脂的1/2MS基本培养基上，该培养基中琼脂的含量为0.5-0.8％，pH值为5.0-6.5；培养7天后移到7％琼脂培养基上继续培养，继续培养的条件为：(25±2)℃、光照时间10-12小时/天、光照强度1000-1500Lx。
3、根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于：所述步骤1)中愈伤组织的培养条件为：在(25±2)℃下暗培养。
4、根据权利要求3所述的繁殖方法，其特征在于：所述暗培养时间为21-30天。
5、根据权利要求3所述的繁殖方法，其特征在于：所述繁殖方法中还包括将经步骤1)诱导获得的愈伤组织再移至新的愈伤组织诱导培养基上，并在相同的愈伤组织培养条件下进行继代培养，每隔21-30天继代培养一次。
6、根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于：所述步骤2)中预分化的条件为：在(25±2)℃下暗培养，暗培养时间为21-30天；步骤3)中不定芽的分化培养条件为：在(25±2)℃、光照时间10-12小时/天、光照强度1000-1500Lx的条件下进行培养，培养时间为30-50天；步骤4)中促进芽伸长的培养条件为：在(25±2)℃、光照时间10-12小时/天、光照强度1000-1500Lx的条件下进行培养，培养时间为20-28天。
7、根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于：所述步骤5)中吲哚丁酸溶液浸泡法中吲哚丁酸溶液的浓度为200mg/L，基部浸泡时间为2小时，培养条件为：在(25±2)℃、光照时间10-12小时/天、光照强度1000-1500Lx下进行培养。
8、根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基中2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为1.0mg/L，蔗糖含量为3.0％，琼脂的含量为0.68％；所述预分化培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为1.0mg/L，蔗糖含量为3.0％，琼脂的含量为0.7％；所述分化培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.5mg/L或1.0mg/L，α-萘乙酸的浓度为0.25mg/L或0.5mg/L，琼脂的含量为0.7％；所述芽伸长培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.5mg/L或1.0mg/L，α-萘乙酸的浓度为0.25mg/L或0.5mg/L，赤霉素的浓度为0.2mg/L或0.5mg/L，琼脂的含量为0.8％；所述生根培养基中α-萘乙酸的浓度为0.02mg/L，水解乳蛋白的浓度为300mg/L，吲哚丁酸的浓度为1.0mg/L，蔗糖含量为2.5％，琼脂的含量为0.7％。
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| 不同因子对翅果油树愈伤组织诱导及分化的影响 张红梅，张会龋，张会荣，吴国良，刘群粒，刘群龙，山西农业大学学报(自然科学版)，第25卷第1期 2005 * |
| 翅果油树愈伤组织的继代培养 卢英梅，程小丽，侯娟娟，宋安平，张育盛，山西师范大学学报(自然科学版)，第16卷第4期 2002 * |
| 翅果油树脱毒试管苗的组织培养技术研究 闫桂琴，张伟，张艳芳，等.西北植物学报，第23卷第7期 2003 * |
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