CN109804926B - 一种翅果油树组织培养基及其制备方法 - Google Patents
一种翅果油树组织培养基及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种翅果油树组织培养基及其制备方法，包括初代培养基、芽诱导培养基和根诱导培养基。本发明通过优化培养基的各种组分，特别是调节培养基中植物调节剂及蔗糖浓度，使培养基更加有利于翅果油树组织的存活，发芽以及生根，生根苗生根率高、出根快，根系发达，小苗木质化好，移栽成活率高。本发明配方简单，使用方便，效果好。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养与林木植物快繁脱毒技术领域，具体涉及一种翅果油树组织培养基及其制备方法。
背景技术
植物试管苗技术即无菌组织培养技术，是在人为创造的无菌条件下将生活的离体器官（如根、茎、叶、茎段、原生质体）、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术。试管苗具有体积小，重量轻，生产不受季节限制，设备简单、成本低、便于工厂化生产和长途运输等优点。组织培养技术已经普遍应用于花卉、经济作物、林木的生产、保存、纯化、脱病毒、快速繁殖及新品种选育等过程。
翅果油树（拉丁学名：Elaeagnus mollis Diels.）是胡颓子科、胡颓子属落叶直立乔木或灌木。翅果油树于1899年在陕西省户县涝峪山首次发现。2018年被列为国家一类保护树种。
翅果油树有两种繁殖方式：其一为种子繁殖，但种子发芽率较低， 未经任何处理的种子，发芽率为5.93%，发芽后能正常发育成籽苗的仅为1.69%。经过沙积处理的种子的发芽率为45.76%，但发芽后能正常发育成苗的也仅为11.02%。另外，翅果油树种子的寿命也短，保存一年后其发芽率几乎为零(上官铁梁，张峰，我国特有珍稀植物翅果油树濒危原因分析[J].生态学报，21(3)： 502-505，2001)，且自然状态下的种子苗很少；其二是通过植株根蘖苗繁殖，但根蘖苗自生根能力差，繁殖系数低，而且通过这种营养繁殖方法长成的苗木病害严重。因此利用组织培养方法，尤其用种子苗为材料进行快速繁殖生产的翅果油树苗木具有无病毒、无菌，且繁殖系数高等优点。
但目前关于翅果油树组织培养的研究非常少，更没有形成产业规模，这与传统组织培养方法不适应与翅果油树有一定关系。
申请号为201610780875.7 的中国专利公开了一种翅果油树定芽增殖与植株再生方法，该方法根据翅果油树腋芽处易萌发新芽的特点，采用成熟翅果油树种子无菌萌发获得实生苗，剪取带有腋芽或顶芽的幼嫩茎段为外植体，通过组织培养的方法促进腋芽萌发、伸长，获得具有一定木质化程度的健壮新枝，从而实现增殖的目的，然后经生根培养实现植株再生。但这种方法有以下缺点：生根率偏低，最大生根率为36.7%。为此，我们提出一种成本低廉，简便快速的培养基以提高翅果油树的生根率和平均根数。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是根据翅果油树试管苗的建立过程和特点，提供一种成本低廉，简便快速的适用于翅果油树组织培养的培养基及其制备方法以提高翅果油树的芽存活率、试管苗不定芽增殖系数、愈伤组织、生根率和平均根数。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种翅果油树组织培养基，该培养基包括初代培养基、芽诱导培养基和根诱导培养基；
每升初代培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、玉米素0.1-1.0mg/L、α-萘乙酸0.005-0.02mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉2-10g/L、纯净水补足余量；
每升芽诱导培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、苄氨基嘌呤0.8-2.0mg/L、激动素0.2-1.0mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-50g/L、琼脂粉2-10g/L、香蕉汁50-150g/L、纯净水补足余量；
每升生根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、吲哚丁酸0.2-1.0mg/L、活性炭1-5g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉2-10g/L、香蕉汁50-150g/L、纯净水补足余量。
作为本发明再进一步的方案：每升初代培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、玉米素0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.005-0.01mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉4-6g/L、纯净水补足余量；
每升芽诱导培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、苄氨基嘌呤1.0-1.5mg/L、激动素0.4-0.6mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉4-6g/L、香蕉汁70-120g/L、纯净水补足余量；
每升生根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、吲哚丁酸0.4-0.6mg/L、活性炭1-3g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉4-6g/L、香蕉汁70-120g/L、纯净水补足余量。
作为本发明再进一步的方案：每升初代培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、玉米素0.5mg/L、α-萘乙酸0.01mg/L、活性炭1g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉5g/L、纯净水补足余量；
每升芽诱导培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、苄氨基嘌呤1.2mg/L、激动素0.45mg/L、活性炭1g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉5g/L、香蕉汁100g/L、纯净水补足余量；
每升生根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、吲哚丁酸0.5mg/L、活性炭2g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉5g/L、香蕉汁100g/L、纯净水补足余量。
作为本发明再进一步的方案：一种翅果油树组织培养基的制备方法，包括如下步骤：
（1）初代培养基
称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与玉米素、α-萘乙酸、活性炭溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；调节pH至5.6-5.9；分装后，进行高温高压灭菌；冷却成固体；接外植体进行无菌培养。
（2）芽诱导培养基
称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与苄氨基嘌呤、激动素、活性炭、香蕉汁溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；调节pH至5.6-5.9；分装后，进行高温高压灭菌；冷却成固体；接无菌苗进行无菌培养。
（3）根诱导培养基
按原料配比称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与吲哚丁酸、香蕉汁、活性炭溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其融化；纯净水定容到1.0升；调节pH至5.6-5.9；分装后，进行高温高压灭菌；冷却成固体；接无菌苗进行无菌培养。
作为本发明再进一步的方案：步骤（1）-步骤（3）中所述煮沸琼脂粉的锅中有0.7-0.8升纯净水。
作为本发明再进一步的方案：步骤（1）-步骤（3）中所述pH使用盐酸和氢氧化钠调节。
作为本发明再进一步的方案：步骤（1）-步骤（3）中所述pH值均调整为5.7。
作为本发明再进一步的方案：步骤（1）中所述分装为分装成20瓶；所述高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.10 MPa -0.14MPa，灭菌20分钟。
作为本发明再进一步的方案：步骤（2）中所述分装为分装成20瓶；所述高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.1MPa，灭菌20分钟。
作为本发明再进一步的方案：步骤（3）中所述分装为分装成20瓶；所述高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.1MPa，灭菌20分钟。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
本发明翅果油树试管苗的建立过程：（1）取材；（2）消毒、接种及培养；（3）扩大繁殖；（4）根的诱导。
根据以上试管苗的建立过程，筛选适应于各个阶段的培养基。本发明其培养基配方由初代培养基、芽诱导培养基、根诱导培养基3种培养基分别配制、配套应用。
（1）初代培养基
翅果油树初代培养一般以春季萌发的新梢或由根部萌发的新枝条作为外植体来源，根据外植体在不同培养基的存活率、芽分化率等，筛选合适培养基。试验以MS、1/2MS、1/4MS、改良WPM、Read 5种培养基为基本培养基，以茎段为外植体进行预培养。每个处理接种20个材料，试验重复3次。每天观察、记录外植体生长情况，连续观察3个月。以1/2MS培养基为基本培养基，附加玉米素（ZT）、苄氨基嘌呤（6-BA）、异戊烯腺嘌呤（2-ip）三种细胞分裂素和α-萘乙酸（NAA）一种生长素，每个处理接种60个材料，试验重复3次。基本培养基以1/2MS为宜，适合初代培养基配方为1/2 MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L，芽存活率在40%以上。
（2）芽诱导培养基
苄氨基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、α-萘乙酸（NAA）浓度及蔗糖含量对翅果油树试管苗不定芽增殖系数的影响，增殖系数最高的是6-BA浓度1.2mg/L、KT浓度0.45mg/L、NAA浓度0 mg/L、蔗糖含量20g/L，增殖系数高达6.79；增殖系数最低的是6-BA浓度0.6mg/L、KT浓度0.45mg、NAA浓度0.2mg/L、蔗糖含量0mg/L，增殖系数为0.17；对增殖系数影响最大的是蔗糖含量，极差R值为3.38，然后依次是6-BA浓度、NAA浓度、KT浓度。方差分析结果表明，影响增殖系数的4个因素中6-BA浓度、NAA浓度、蔗糖含量的不同水平之间均差异极显著(JP<001)，而KT浓度的不同水平之间差异不显著。根据以上可得出结论，适用于翅果油树的芽诱导培养基组成为1/2 MS+6-BA 1.2mg/L+ KT 0.45mg/L+蔗糖 20mg/L。芽诱导率达到60%左右。
（3）根诱导培养基
添加生长素的生根率明显高于未添加生长素的。1/2 MS+吲哚乙酸（IAA）的生根生长效果较好，根较粗壮且基部无愈伤组织；1/2 MS+IAA 0.5 mg/L、1/2 MS+IAA 1.0 mg/L、1/2 MS+IAA2.0 mg/L的生根率差异显著，其中以1/2 MS+IAA 1.0 mg/L的生根率和平均根数最高，分别达到87.1%和3.46条；1/2 MS+（吲哚丁酸）IBA的基部形成较多的愈伤组织，以1/2MS+IBA 0.5mg/L效果最好，生根率和平均根条数分别达到90.1%和3.61条；随着1/2MS+IBA中IBA浓度的增加，生根率越来越低。1/2 MS+IBA 0.5mg/L+IAA 0.5mg/L、1/2 MS+IBA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L、1/2 MS+IBA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L生根率及平均根数明显低于1/2MS+IBA 0.5 mg/L、1/2MS+IBA 1.0mg/L，1/2 MS+IAA 1.0 mg/L、1/2 MS +IAA 2.0mg/L，且生根率差异达到显著水平。将试管内培养出的新梢，接种于l/2 MS+IBA 0.5mg/L培养基中10d后转入无生长调节剂的l/2MS培养基中光/暗(12h/12h)周期下生根效果较好，生根率达90%。
本发明提供的1/2MS配方为：大量元素：硝酸铵 NH4NO3 825 mg/L、硝酸钾 KNO3950mg/L、二水氯化钙 CaCl2·2H2O 220 mg/L、七水硫酸镁MgSO4·7H2O 185mg/L、磷酸二氢钾 KH2PO4 85 mg/L；微量元素：碘化钾 KI 0.415mg/L、硼酸 H3BO3 3.1 mg/L、四水硫酸锰MnSO4·4H2O 11.15 mg/L、七水硫酸锌 ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、二水钼酸钠 Na2MoO4·2H2O0.125 mg/L、五水硫酸铜 CuSO4·5H2O 0.0125 mg/L、六水氯化钴 CoCl2·6H2O 0.0125mg/L；铁盐：七水硫酸亚铁 FeSO4·7H2O 27.8 mg/L、二水乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA·2H2O37.3 mg/L；有机物质：肌醇 100 mg/L、烟酸 VB5或VPP 0.5 mg/L、盐酸吡哆醇 VB6 0.5mg/L、盐酸硫胺素 VB1 0.1 mg/L、甘氨酸 2.0 mg/L；蔗糖 30g/L；琼脂 7 g/L。
香蕉汁的制备方法：将一定重量的香蕉切成片，加少量水煮沸，将香蕉煮烂，将固体物质过滤掉所得的汁。
翅果油树组织培养基的制备方法，包括如下步骤：
（1）初代培养基
称量琼脂粉加入装有0.7-0.8升纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与玉米素、α-萘乙酸、活性炭溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；使用盐酸和氢氧化钠调整pH值为5.6-5.9，优选5.7；分装为20瓶后，进行高温120℃，高压0.1MPa-0.14MPa灭菌20分钟；冷却成固体；接外植体进行无菌培养。
（2）芽诱导培养基
称量琼脂粉加入装有0.7-0.8升纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与苄氨基嘌呤、激动素、活性炭、香蕉汁溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；调整pH值为5.7；分装为20瓶后，进行高温120℃，高压0.1MPa灭菌20分钟；冷却成固体；接无菌苗进行无菌培养。
（3）根诱导培养基
按原料配比称量琼脂粉加入装有0.7-0.8升纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与吲哚丁酸、香蕉汁、活性炭溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其融化；纯净水定容到1.0升；调整pH值为5.7；分装为20瓶后，进行高温120℃，高压0.1MPa灭菌20分钟；冷却成固体；接无菌苗进行无菌培养。
实施例2：
初代培养基培养翅果油树外植体组织，其中，每升（L）初代培养基的组分及各组分的含量以及存活率如下表所示：
表1初代培养基培养翅果油树外植体组织的设计方案及存活率
实施例3：
芽诱导培养基培养翅果油树无菌苗组织，其中，每升（L）芽诱导培养基的组分及各组分的含量以及芽诱导率如下表所示：
表2 芽诱导培养基培养翅果油树无菌苗组织的设计方案及芽诱导率
实施例4：
根诱导培养基培养翅果油树无菌苗组织，其中，每升（L）根诱导培养基的组分及各组分的含量以及生根率和平均根数如下表所示：
表3 根诱导培养基培养翅果油树无菌苗组织的设计方案及生根率和平均根数
对比例：
初代培养基：现有技术采用MS+苄氨基嘌呤0.5mg/L + α-萘乙酸0.03mg/L；
芽诱导培养基：现有技术采用MS+α-萘乙酸0.02mg/L +苄氨基嘌呤0.7mg/L；
根诱导培养基：现有技术采用1/2MS+促黄体生成素350 IU/L+吲哚丁酸3.0mg/L。
利用上述实施例2-4和对比例制成的培养基，对翅果油树进行组织培养，从下表的结果可以看出，实施例的技术指标远超过对比例。
表4 实施例设计方案与对比例效果的比较
| 培养基 | 对比例 | 实施例 |
| 初代培养基 | 存活率达到20.4% | 方案7：存活率达到43.5% |
| 芽诱导培养基 | 芽诱导率达到39.8% | 方案14：芽诱导率61.2% |
| 根诱导培养基 | 生根率20.6%，生根率较低，且生长缓慢。 | 方案20：生根率达到90.1%，生根率高，且生长较为迅速，根系发达。 |
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种翅果油树组织培养基，其特征在于：该培养基包括初代培养基、芽诱导培养基和生根培养基；
每升初代培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、玉米素0.1-1.0mg/L、α-萘乙酸0.005-0.02mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉2-10g/L、纯净水补足余量；
每升芽诱导培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、苄氨基嘌呤0.8-2.0mg/L、激动素0.2-1.0mg/L、活性炭0.5-2g/L、蔗糖10-50g/L、琼脂粉2-10g/L、香蕉汁50-150g/L、纯净水补足余量；
每升生根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、吲哚丁酸0.2-1.0mg/L、活性炭1-5g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉2-10g/L、香蕉汁50-150g/L、纯净水补足余量；
其中，1/2 MS配方为：大量元素：硝酸铵 NH4NO3 825 mg/L、硝酸钾 KNO3 950mg/L、二水氯化钙 CaCl2·2H2O 220 mg/L、七水硫酸镁MgSO4·7H2O 185mg/L、磷酸二氢钾 KH2PO4 85mg/L；微量元素：碘化钾 KI 0.415mg/L、硼酸 H3BO3 3.1 mg/L、四水硫酸锰 MnSO4·4H2O11.15 mg/L、七水硫酸锌 ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、二水钼酸钠 Na2MoO4·2H2O 0.125 mg/L、五水硫酸铜 CuSO4·5H2O 0.0125 mg/L、六水氯化钴 CoCl2·6H2O 0.0125mg/L；铁盐：七水硫酸亚铁 FeSO4·7H2O 27.8 mg/L、二水乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg/L；有机物质：肌醇 100 mg/L、烟酸 VB5或VPP 0.5 mg/L、盐酸吡哆醇 VB6 0.5 mg/L、盐酸硫胺素 VB1 0.1 mg/L、甘氨酸 2.0 mg/L。
2.根据权利要求1所述的翅果油树组织培养基，其特征在于：每升初代培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、玉米素0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.005-0.01mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉4-6g/L、纯净水补足余量；
每升芽诱导培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、苄氨基嘌呤1.0-1.5mg/L、激动素0.4-0.6mg/L、活性炭0.5-1g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉4-6g/L、香蕉汁70-120g/L、纯净水补足余量；
每升生根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、吲哚丁酸0.4-0.6mg/L、活性炭1-3g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉4-6g/L、香蕉汁70-120g/L、纯净水补足余量。
3.根据权利要求2所述的翅果油树组织培养基，其特征在于：每升初代培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、玉米素0.5mg/L、α-萘乙酸0.01mg/L、活性炭1g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉5g/L、纯净水补足余量；
每升芽诱导培养基的组分及各组分的含量如下：1/2 MS、苄氨基嘌呤1.2mg/L、激动素0.45mg/L、活性炭1g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉5g/L、香蕉汁100g/L、纯净水补足余量；
每升生根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、吲哚丁酸0.5mg/L、活性炭2g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉5g/L、香蕉汁100g/L、纯净水补足余量。
4.根据权利要求1-3任意一种翅果油树组织培养基的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）初代培养基
称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与玉米素、α-萘乙酸、活性炭溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；调节pH至5.6-5.9；分装后，进行高温高压灭菌；冷却成固体；接外植体进行无菌培养；
（2）芽诱导培养基
称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与苄氨基嘌呤、激动素、活性炭、香蕉汁溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；调节pH至5.6-5.9；分装后，进行高温高压灭菌；冷却成固体；接无菌苗进行无菌培养；
（3）生根培养基
按原料配比称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与吲哚丁酸、香蕉汁、活性炭溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其融化；纯净水定容到1.0升；调节pH至5.6-5.9；分装后，进行高温高压灭菌；冷却成固体；接无菌苗进行无菌培养。
5.根据权利要求4所述的翅果油树组织培养基的制备方法，其特征在于：步骤（1）-步骤（3）中煮沸的琼脂粉的锅中有0.7-0.8升纯净水。
6.根据权利要求4所述的翅果油树组织培养基的制备方法，其特征在于：步骤（1）-步骤（3）中所述pH使用盐酸和氢氧化钠调节。
7.根据权利要求4所述的翅果油树组织培养基的制备方法，其特征在于：步骤（1）-步骤（3）中所述pH值均调整为5.7。
8.根据权利要求4所述的翅果油树组织培养基的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述分装为分装成20瓶；所述高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.10 MPa -0.14MPa，灭菌20分钟。
9.根据权利要求4所述的翅果油树组织培养基的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述分装为分装成20瓶；所述高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.1MPa，灭菌20分钟。
10.根据权利要求4所述的翅果油树组织培养基的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述分装为分装成20瓶；所述高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.1MPa，灭菌20分钟。
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