WO2011071114A1 - クローン苗の生産方法 - Google Patents

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WO2011071114A1
WO2011071114A1 PCT/JP2010/072137 JP2010072137W WO2011071114A1 WO 2011071114 A1 WO2011071114 A1 WO 2011071114A1 JP 2010072137 W JP2010072137 W JP 2010072137W WO 2011071114 A1 WO2011071114 A1 WO 2011071114A1
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glutathione
medium
plant
production method
rooting
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PCT/JP2010/072137
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小川　健一
松永　悦子
直希 根岸
正淳 大石
史樹 河合
稔明 田邊
明義 河岡
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日本製紙株式会社
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    • A01G2/00—Vegetative propagation
    • A01G2/10—Vegetative propagation by means of cuttings
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    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to the production of cloned seedlings, and in particular, to a method for producing cloned seedlings by rooting a plant shoot and a rooting medium suitably used for the production method.
  • branches and stems and in some cases, apical buds, axillary buds, leaves, cotyledons or hypocotyls, etc. are cut out from individual plants to be proliferated to form cuttings, which are then inserted into a bed or culture medium. Roots to produce plant bodies.
  • tissue culture method an appropriate tissue is cut out from the individual plant to be proliferated, cultured, and expanded from adventitious buds, adventitious embryos, shoot primordia or these tissues. Collect stems and leaves (shoots) and root them. That is, regardless of which method is used to produce cloned seedlings, a process of rooting will be performed.
  • Patent Document 3 discloses that re-differentiation is promoted when rice or Eustoma calli are cultured in a medium containing glutathione.
  • Patent Document 4 the addition of 1 mM glutathione acts rather inhibitory on the formation of adventitious buds from tobacco callus, and callus is obtained by adding butionine sulfoximine (BSO), a glutathione synthesis inhibitor. It is disclosed that the number of adventitious bud differentiation increases significantly. This indicates that the effect of glutathione on callus regeneration differs depending on the type of callus plant.
  • BSO butionine sulfoximine
  • JP 2001-346464 A (published on December 18, 2001) JP 2006-141252 A (published on June 8, 2006) JP 2004-352679 A (released on December 16, 2004) JP 2008-120815 A (released May 29, 2008)
  • the present invention promotes rooting from plant shoots and improves the rooting rate thereof, so that clone seedlings by cutting methods, tissue culture methods, etc., especially clone seedlings belonging to plant species with low rooting ability
  • the goal is to improve productivity.
  • the purpose is to enable mass production and rapid production of cloned seedlings and open the way to its industrial use.
  • the method for producing a cloned seedling of the present invention is characterized by including a step of cultivating a plant shoot in the presence of glutathione.
  • the above step may be performed using a medium containing glutathione.
  • the glutathione concentration of the medium is preferably in the range of 1 mg / L to 5000 mg / L, and more preferably in the range of 1 mg / L to 100 mg / L.
  • the medium preferably contains no carbon source other than glutathione, and preferably contains nitrogen, phosphorus and potassium as essential elements.
  • the above step may be performed by bringing a solution containing glutathione into contact with a plant shoot.
  • the glutathione concentration of the solution is preferably in the range of 1 mg / L to 5000 mg / L, and more preferably in the range of 1 mg / L to 100 mg / L.
  • the glutathione is preferably oxidized glutathione.
  • the plant may be difficult to root.
  • the plant is a plant selected from the group consisting of Eucalyptus, Pine, Sakura, Mango and avocado. It is preferable that it is a Eucalyptus plant.
  • the above step is preferably performed under light irradiation containing a wavelength component of 650 to 670 nm and a wavelength component of 450 to 470 nm in a ratio of 9: 1 to 7: 3.
  • the above step is preferably performed while supplying carbon dioxide gas.
  • the supply amount of the carbon dioxide gas is preferably 300 to 2000 ppm.
  • the above process is preferably performed under conditions of a humidity of 80% or more.
  • the production method of the present invention may be performed using a chute with a scratched base.
  • the shoot is a cutting, a multi-bud obtained by aseptically culturing an organ collected from a mother plant, or a foliage obtained by aseptically growing the organ. It is preferable that
  • composition of the present invention is characterized by containing glutathione for rooting from plant shoots.
  • composition of the present invention is preferably used as a medium.
  • the glutathione concentration is preferably in the range of 1 mg / L to 5000 mg / L, and more preferably in the range of 1 mg / L to 100 mg / L.
  • the composition of the present invention may be used as an adjunct mixed with a medium or a solution, and has a final concentration of glutathione within the range of 1 mg / L to 5000 mg / L in the medium or solution after mixing. Preferably, providing a final concentration of glutathione within the range of 1 mg / L to 100 mg / L is more preferable.
  • the composition of the present invention is preferably in the form of a tablet, powder or granule.
  • composition of the present invention is preferably used for asexual propagation of plants, and may be used for preparing cloned seedlings from plant shoots.
  • the glutathione is preferably oxidized glutathione.
  • composition of the present invention preferably contains no carbon source other than glutathione, and preferably contains nitrogen, phosphorus and potassium as essential elements.
  • the present invention is characterized in that glutathione is used for rooting from plant shoots, and glutathione is more preferably used for preparing cloned seedlings from plant shoots. Furthermore, the present invention is characterized in that glutathione is used for preparing a composition for rooting from plant shoots, and for preparing a composition for preparing clonal seedlings from plant shoots. More preferably, glutathione is used.
  • the present invention by cultivating a plant shoot in the presence of glutathione, it is possible to promote rooting from the shoot and improve the rooting rate, thus improving the productivity of cloned seedlings. Can be made. Moreover, such an effect is particularly remarkable in plant species with low rooting ability. Therefore, the present invention contributes to the large-scale and rapid production of cloned seedlings of a wide variety of plant species, and in particular, even to plant species with low rooting ability, the cloned seedlings are produced in large quantities and rapidly. And open the way to its industrial use.
  • Plants maintain seed welfare through seed propagation (sexual reproduction) or vegetative reproduction (asexual reproduction). In plant breeding, it is required to obtain a large number of individuals having excellent traits. For this purpose, excellent individuals that meet the purpose are selected from a large number of genetically different individuals, and the selected individuals are cloned by vegetative propagation to obtain cloned seedlings. Vegetative propagation is a technique that can grow solids of the same trait, and includes cuttings, grafts, cuttings, stocking, and the like.
  • Cutting is a technique that collects a part of the target plant and generates adventitious roots and adventitious buds in the cutting floor to form an independent individual, and is the most widely used simple technique. It is very difficult to apply to plants with low root ability. Grafting is a technique that allows a part of a target plant to adhere to other plants and grow as a single plant, and it is possible to propagate even plants that are difficult to apply to cuttings and cuttings. Technically very difficult. The cuttings are used for plants that are difficult to apply to grafts and cuttings, but the reproduction efficiency is poor.
  • rooting promoters for example, auxin
  • agar, sucrose concentration, etc. in the medium affect root morphology.
  • rooting may be promoted by inserting a shoot in a bacterial state.
  • the present invention relates to the production of cloned seedlings from plant shoots. That is, the present invention is a technique for cultivating a plant shoot in the presence of glutathione and rooting from the shoot.
  • the present invention which can promote rooting from plant shoots and improve the rooting rate to such an extent that clone seedlings can be produced, is very efficient that can improve the productivity of cloned seedlings. Technology.
  • the present invention can be applied to any plant.
  • it is preferably applied to a woody plant, and more preferably applied to a woody plant having a lower rooting ability than a herbaceous plant because the effects of the present invention can be remarkably exhibited.
  • woody plants include Eucalyptus plants, Pinus plants, Prunus plants (Prunus spp., Prunus mume, Prunus tomentosa, etc.), avocados, etc.
  • Genus (Avocado) plant, Mangofera plant (such as Mangofera indica), acacia plant, bayberry (Myrica) plant, Quercus genus plant (Quercusactis plant, etc.) Plants of the genus Grapes (Vitis), plants of the genus Apple (Malus), plants of the genus Rose (Rosa), plants of the genus Camellia, plants of the genus Jacaranda (Jaka) Randa (such as Jacaranda mimosifolia) and genus Persea plants (such as Avocado (Persea americana)).
  • Eucalyptus plants such as Eucalyptus Globulus and Eucalyptus / Sumidiai are particularly difficult to root, and therefore, if the present invention is applied, a great effect can be obtained.
  • Eucalyptus has a very low rooting ability, and even in the presence of auxin, it is known that the rooting rate of Eucalyptus globulus elite trees is about 25% even if it is high ( For example, see Sotelo, M. and Monza, J. Agrociencia (2007) Vol XI, No.1, p.81-89).
  • Shoots refer to all tissues that have rooting ability. Examples of the tissue include branches, stems, apical buds, buds, adventitious buds, leaves, cotyledons, hypocotyls, adventitious embryos, shoot primordia, and the like.
  • the origin of the shoot is not particularly limited, and it may be obtained from a plant individual growing in a greenhouse or outdoors, may be a cultured tissue obtained by a tissue culture method, or may be a natural plant body. It may be a departmental organization.
  • a cloned seedling refers to a seedling obtained by rooting these tissues.
  • the shoot can be efficiently obtained from the main plant of the cutting head and the multi-bud. Among them, cuttings (cutting ears obtained from the mother plant), polyblasts obtained by aseptically culturing organs collected from the mother plant, or foliage obtained by aseptically growing the organs Preferably there is.
  • the multi-bud can be derived from a plant from which a clone seedling is to be produced by applying the present invention, by cutting out top buds, buds and the like, and tissue-cultivating them.
  • JP-A-8-228621 discloses It can be performed according to the described method and conditions. The method and conditions are as follows.
  • tissues such as apical buds and axillary buds are collected from the plant as a material, and about the collected tissues, an aqueous solution of sodium hypochlorite having an effective chlorine content of about 0.5% to about 4% or an effective chlorine content of about 5% to Surface sterilization is performed by immersing in an aqueous solution of about 15% hydrogen peroxide for about 10 minutes to about 20 minutes.
  • this is washed with sterilized water, inserted into a solid medium to open the buds, and the elongated foliage is subcultured in a medium having the same composition to form a multi-bud.
  • the solid medium is 1 to 5% by weight of sucrose, and benzyladenine (hereinafter abbreviated as BA) as a plant hormone is about 0.02 mg / L to about Murashige sukug (hereinafter abbreviated as MS) medium containing 1 mg / L, gellan gum about 0.2% to about 0.3% by weight or agar about 0.5% to about 1% by weight or ammonium nitrate of this MS medium It is preferable to use a modified MS medium in which the components and the potassium nitrate component are halved. The shoots are actively extended from the multi-buds thus formed.
  • the multi-blast body itself can be maintained and proliferated by appropriately dividing it and culturing it in a medium having the same composition as the medium used for forming the multi-bud body.
  • cutting ears may be used as shoots.
  • buds and leaves can be used in addition to green branches (current year branches) and mature branches (branches extending before the previous year).
  • green branches and mature branches are usually used as cuttings, and in the case of herbaceous plants, leaves and buds are usually used as cuttings.
  • glutathione is used for growing the shoots.
  • the production conditions of glutathione are not particularly limited, and may be artificially synthesized or derived from natural products. Further, the degree of purification is not particularly limited. Commercial products can also be used.
  • glutathione there are an oxidized form and a reduced form, and both can be used in the present invention, but oxidized glutathione is preferable.
  • oxidized glutathione when oxidized glutathione is used as glutathione, it is presumed that after being incorporated into the plant body, it changes to reduced glutathione having better stability in the plant body.
  • the step of cultivating a plant shoot in the presence of glutathione can be selected as appropriate from the type of plant, the state of the shoot, the cultivation method, and the like.
  • a method of culturing a shoot in a rooting medium containing glutathione; a solution containing glutathione; A method of contacting the chute is exemplified.
  • the former is preferable when a cultured tissue obtained by a tissue culture method is used as a shoot, and either the former or the latter may be used when an insertion ear is used as a shoot.
  • the concentration of glutathione in the rooting medium is preferably about 1 mg / L to about 5000 mg / L, more preferably about 5 mg / L to about 1000 mg / L, Particularly preferred is about 25 mg / L / l to about 500 mg / L.
  • the amount of glutathione added in the rooting medium Is preferably about 1 mg / L to about 100 mg / L, more preferably about 5 mg / L to about 75 mg / L, and particularly preferably about 25 mg / L to about 75 mg / L.
  • the contact method is not particularly limited, and can be appropriately selected from the type of plant, the state of the shoot, the cultivation method, and the like.
  • a method of directly spraying a glutathione solution on a shoot and a method of infiltrating a support with a glutathione solution can be mentioned.
  • the glutathione solution can be prepared by dissolving glutathione in a suitable solvent (for example, water).
  • a suitable solvent for example, water
  • water include deionized water, distilled water, reverse osmosis water, and tap water, and any of them can be used.
  • the concentration of glutathione in the glutathione solution is preferably about 1 mg / L to about 5000 mg / L, more preferably about 5 mg / L to about 1000 mg / L, and about 10 mg / L to about 1000 mg / L. Even more preferred.
  • the glutathione solution When spraying the glutathione solution directly on the chute, the glutathione solution may be sprayed on a part or the whole of the chute using a spray or the like.
  • the amount of the glutathione solution sprayed cannot be generally specified depending on the concentration of glutathione in the glutathione solution, but is generally about 0.5 ml to about 5.0 ml per shoot, preferably about 1.0 ml to about 3 0.0 ml is more preferred.
  • the number of spraying may be one time or two or more times, but is preferably sprayed at least at the start of cultivation. Further, depending on the cultivation conditions, additional spraying may be performed as appropriate during the cultivation period (for example, every few days (2 to 3 days)).
  • the support When the support is wetted with the glutathione solution, a method of spraying the glutathione solution from the top of the support, a method of placing the support in a container filled with the glutathione solution, and irrigating from the bottom are exemplified.
  • the amount of water sprayed from the upper part is preferably about 1.0 ml to about 30 ml, more preferably about 5.0 ml to about 10.0 ml per chute.
  • the glutathione solution When irrigating from the bottom, the glutathione solution may be wetted substantially uniformly on the support.
  • a rooting medium may be separately prepared in addition to the glutathione solution, and the support may be moistened with both, as described above.
  • Glutathione may be provided as an adjunct that is added to and mixed with the medium or solution when preparing a glutathione-containing medium (rooting medium) or a glutathione solution, and the rooting medium or glutathione solution can be successfully used.
  • the rooting medium or glutathione solution can be successfully used.
  • it is preferably in the form of tablets, powders or granules.
  • Glutathione is contained in the adjuvant so that the final concentration of glutathione in the prepared rooting medium or glutathione solution is within the above-described range.
  • the glutathione-containing medium or glutathione solution is preferably supplied to the plant after the glutathione is adjusted within the above concentration range, but it is sufficient that the glutathione is mixed with the medium or the solution at the stage of incorporation into the plant. Therefore, the medium or solution containing no glutathione and the above-mentioned adjuvant may be supplied directly or continuously to the outer surface of the plant or to the vicinity of the plant (support or soil). . By using such a procedure, the plant can take up the medium or solution mixed with the adjuvant.
  • the rooting medium means a medium used for rooting from plant shoots.
  • the rooting medium preferably contains silver ions and / or antioxidants, and more preferably contains both silver ions and antioxidants.
  • Silver ions may be added to the medium as a silver compound (silver ion source) such as STS or silver nitrate.
  • STS is preferable as a silver ion source used in the present invention, because when roots and elongation of healthy roots are promoted when added to a medium and shoots are cultured. This is presumably because the silver ions derived from STS take the form of silver thiosulfate ions in the medium and are negatively charged.
  • the concentration of silver ions added to the rooting medium depends on the type of silver ion source and other culture conditions, but the concentration of the silver ion source is preferably about 0.5 ⁇ M to about 10 ⁇ M, and about 2 ⁇ M to about 6 ⁇ M. Is more preferable.
  • antioxidants such as ascorbic acid and sulfite can be used as the antioxidant.
  • ascorbic acid is preferable as an antioxidant used in the present invention because of its low persistence in the medium.
  • the concentration of the antioxidant added to the rooting medium is preferably about 5 mg / L to about 200 mg / L, more preferably about 20 mg / L to about 100 mg / L.
  • the rooting medium used in the present invention may contain inorganic components, carbon sources, vitamins, amino acids, plant hormones and the like in addition to the above components.
  • Examples of the inorganic component include elements such as nitrogen, phosphorus, potassium, sulfur, calcium, magnesium, iron, manganese, zinc, boron, molybdenum, chlorine, iodine, cobalt, and inorganic salts containing these.
  • Examples of the inorganic salt include potassium nitrate, ammonium nitrate, ammonium chloride, sodium nitrate, potassium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium chloride, magnesium sulfate, ferrous sulfate, ferric sulfate, manganese sulfate, and zinc sulfate.
  • inorganic component 1 type can be selected from the said specific example, or it can use in combination of 2 or more type.
  • the rooting medium used in the present invention preferably contains nitrogen, phosphorus, and potassium as essential elements. Therefore, among the specific examples of these inorganic components, nitrogen, phosphorus, potassium, inorganic salts containing nitrogen, inorganic salts containing phosphorus, and inorganic salts containing potassium are preferable, and inorganic salts containing nitrogen, phosphorus, potassium, and nitrogen are preferred.
  • the inorganic component is preferably added so that the concentration in the rooting medium is about 1 ⁇ M to about 100 mM, and more preferably about 0.1 ⁇ M to about 100 mM in the case of one kind. . In the case of a combination of two or more, it is preferably added so as to be about 0.1 ⁇ M to about 100 mM, and more preferably about 1 ⁇ M to about 100 mM.
  • the carbon source compounds such as carbohydrates such as sucrose and derivatives thereof; organic acids such as fatty acids; primary alcohols such as ethanol can be used.
  • the carbon source is preferably added to the rooting medium so as to be about 1 g / l to about 100 g / l, more preferably about 10 g / l to about 100 g / l.
  • the culture medium does not need to contain a carbon source, and preferably does not contain it.
  • Organic compounds that can serve as carbon sources such as sucrose can also serve as carbon sources for microorganisms. Therefore, when using a medium supplemented with these, it is necessary to culture in a sterile environment, but do not contain any carbon source other than glutathione. By using a medium, it is possible to culture in a non-sterile environment.
  • vitamin B1 As vitamins, for example, biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B4), pyridoxal, pyridoxamine, calcium pantothenate, inositol, nicotinic acid, nicotinamide, and / or riboflavin (vitamin B2) are used. Can do.
  • Vitamins one type can be selected from the above specific examples, or two or more types can be used in combination. Vitamins are preferably added so that the concentration in the rooting medium is about 0.01 mg / L to about 200 mg / L in the rooting medium, and about 0.02 mg / L. More preferably, L is added so as to be about 100 mg / L.
  • amino acids examples include glycine, alanine, glutamic acid, cysteine, phenylalanine, and / or lysine.
  • amino acids one type can be selected from the above specific examples, or two or more types can be used in combination.
  • the amino acids are preferably added so that the concentration in the rooting medium is about 0.1 mg / L to about 1000 mg / L in the rooting medium in the case of one kind. In this case, it is preferable to add about 0.2 mg / L to about 1000 mg / L in the rooting medium.
  • auxins and / or cytokinins can be used as plant hormones.
  • auxins include naphthalene acetic acid (NAA), indole acetic acid (IAA), p-chlorophenoxyacetic acid, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4D), indolebutyric acid (IBA), and derivatives thereof.
  • NAA naphthalene acetic acid
  • IAA indole acetic acid
  • IBA 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
  • IBA indolebutyric acid
  • cytokinins include benzyladenine (BA), kinetin, zeatin, and derivatives thereof, and one or more selected from these can be used in combination.
  • auxins As plant hormones, only auxins, only cytokinins, or a combination of both auxins and cytokinins can be used.
  • it is preferably added to the rooting medium so as to be about 0.01 mg / L to about 10 mg / L, and about 0.02 mg / L to about 10 mg / L. It is more preferable to add so that it becomes.
  • it is preferable to add about 0.01 mg / L to about 10 mg / L in the rooting medium, respectively, so that it becomes about 0.02 mg / L to about 10 mg / L. It is more preferable to add.
  • a glutathione is added to a medium known as a plant tissue culture medium as needed, and further silver ions and / or antioxidants are added, and a carbon source other than glutathione, Plant hormones may be appropriately added and used as a rooting medium.
  • the plant tissue culture medium include MS medium, Rinsmeier Skoog medium, white medium, Gamborg B-5 medium, and niche niche medium. Of these, MS medium and Gamborg B-5 medium are preferred. These media can be used by appropriately diluting them as necessary.
  • the rooting medium may be either a liquid medium or a solid medium, but the liquid medium is preferable in terms of work efficiency and less damage to the roots during transplantation.
  • the medium composition can be mixed and prepared and used as it is.
  • the medium composition may be mixed and prepared in the same manner as the liquid medium, or at the same time or after preparation, it may be solidified with a solidifying agent such as agar or gellan gum.
  • the amount of solidifying agent added to the medium varies depending on the type of solidifying agent and the composition of the medium. When the solidifying agent is agar, it is preferably 0.5% by weight to 1% by weight. When the solidifying agent is gellan gum, the content is preferably 0.2% by weight to 0.3% by weight.
  • the method of inserting the shoot into the rooting medium can be appropriately selected depending on the type of medium, culture conditions, and the like.
  • the rooting medium is a solid medium
  • the root of the shoot may be directly inserted into the rooting medium and cultured.
  • the base of the shoot may be inserted and cultured in a support medium described later wetted with a rooting medium.
  • the base of the shoot means an area where the root is formed at one end of the shoot (opposite to the end where the leaf is formed).
  • the base in the case of using a multi-bud as a shoot is an area having a cut surface when dividing the multi-bud.
  • the size (size, shape, etc.) of the scratch on the base of the chute is not particularly limited.
  • scratching scissors and a knife can be used.
  • glutathione can be used for rooting from plant shoots.
  • glutathione can be used in applications for asexual propagation of plants.
  • glutathione as a compound may be used directly, or a composition containing glutathione may be used, and the glutathione or composition provided in the kit may be used. May be used.
  • the composition of the present invention include, but are not limited to, a rooting medium (glutathione-containing medium), a solution containing glutathione (glutathione solution or glutathione-containing solution), and an auxiliary agent as described above.
  • a composition is intended to be “a substance in which two or more components are present homogeneously as a whole and grasped as a single substance”, and as used herein, a “composition” is a combination of various components. It is intended to be in the form contained in the substance.
  • a “kit” is a container in which the various components to be contained in the composition are contained in separate containers (eg, bottles, plates, tubes, dishes, etc.). It is intended that all of these are packaged as a whole, and may be provided with a support or a culture vessel described later.
  • the support is a support for supporting plant shoots.
  • a support may be unnecessary. In other cases, a support is usually used.
  • the support is preferably one that can be held with the shoots inserted during the cultivation period.
  • a liquid rooting medium when used for cultivation, it is usually used by infiltrating a support. Therefore, it is preferable that the support can be infiltrated with a liquid, and among them, a support that can be substantially uniformly wetted with a glutathione solution or a liquid medium containing glutathione is preferable.
  • the liquid medium (without glutathione solution) and the glutathione solution may be separately added to the support, or the liquid medium containing glutathione prepared in advance is supported. It may be added to the body.
  • a conventional support can be used as the support, and is not particularly limited.
  • the support examples include natural soils such as sand and red bean clay; artificial soils such as rice husk charcoal, coconut fiber, vermiculite, perlite, peat moss, and glass beads; and porous molded products such as foamed phenol resin and rock wool. be able to.
  • the rooting bed can be prepared by placing such a support in a culture vessel and moistening with a glutathione solution or a liquid medium containing glutathione. When the rooting medium is a solid medium, the rooting bed can be prepared by placing the solid medium directly into the culture vessel.
  • a culture vessel for containing a rooting medium or a support can be used.
  • a conventional culture vessel can be used, and is not particularly limited.
  • the culture vessel may be a closed type or an open type, but a closed type is preferable.
  • the dispersed glutathione can be retained.
  • a branch As a chute, it is preferable to use a closed culture vessel as the culture vessel. This makes it easy to place the chute under high humidity, so that the transpiration action of the leaves on the branches is suppressed, and the conventional partial excision processing of the leaves can be omitted.
  • the culture container is a container capable of supplying carbon dioxide into the container.
  • a container having an opening covered with a carbon dioxide permeable membrane is exemplified.
  • the shape of the opening is not particularly limited.
  • the material for the carbon dioxide permeable membrane is not particularly limited, and examples thereof include polytetrafluoroethylene.
  • the pore diameter of the membrane is not particularly limited, and examples thereof include those having a thickness of about 0.1 ⁇ m to about 1 ⁇ m.
  • Cultivation conditions for cultivating shoots are not particularly limited as long as they are conditions that allow rooting from shoots. Although it is difficult to define cultivation conditions unconditionally depending on the type of plant, the state of shoots, the type of rooting medium, etc., for example, the temperature is more preferably about 23 ° C. to about 28 ° C.
  • Light intensity is expressed as a photosynthetic photon flux density, at about 10 ⁇ mol / m 2 / s ⁇ about 1000 micro mol / m is preferably from 2 / s, about 50 ⁇ mol / m 2 / s ⁇ about 500 ⁇ mol / m 2 / s More preferably. In either case, rooting from the shoot is usually observed in about 2 weeks to about 5 weeks.
  • Cultivation is preferably performed under light irradiation containing a wavelength component of 650 nm to 670 nm and a wavelength component of 450 nm to 470 nm in a ratio of 9: 1 to 7: 3, and these wavelength components are 9: 1 to 8: It is more preferable to carry out under irradiation of the light containing in the ratio of 2. By cultivating by irradiating light containing such a wavelength component, rooting from the shoot can be further promoted.
  • carbon dioxide gas in the cultivation environment so that it is usually 300 ppm to 2000 ppm, preferably 800 ppm to 1500 ppm.
  • Control of the supply amount of carbon dioxide gas can be performed using equipment such as an artificial weather device, a culture container having a carbon dioxide permeable membrane in the opening, or the like.
  • the humidity is preferably 80% or more, and more preferably 85% or more. With this humidity, shoot rooting can be promoted. There is no particular limitation on the upper limit.
  • the light blocking ratio is preferably 30 to 70%, more preferably 40 to 60%.
  • a clone seedling rooted from the shoot can be obtained.
  • the obtained shoots can be cultivated as they are for a certain period of time as needed to enrich the roots, then transplanted to a seedling container or seedling field, etc., and used for a predetermined purpose such as afforestation It can be made into a seedling. Conditions during this period, such as temperature and light intensity when growing seedlings, may be set as appropriate to suit the plant.
  • shoots derived from cultured tissues such as adventitious shoots and shoot primordia are rooted, it is usually necessary to undergo an acclimatization process before transplanting to a seedling container or the like.
  • Glutathione is generally known as an antioxidant and is said to reduce active oxygen stress in cells.
  • the clear knowledge that the redox reaction is related to plant rooting is not known.
  • the effects of carbon dioxide fertilization and light on the rooting of plants are shown. From this, it is highly possible that the photosynthetic enhancing action of glutathione is involved in some way in the photosynthetic enhancing action.
  • Example 1 From the shoots derived from the wild type of Eucalyptus globulus (hereinafter simply abbreviated as E. globulus), the leaves and leaves (shoots) having a length of 2 to 5 cm were cut.
  • the induction of multiblasts was in accordance with the method disclosed in JP-A-8-228621. That is, E.I. Tissues (apical buds and axillary buds) were collected from globulas (wild type), and the collected tissues were immersed in a sodium hypochlorite aqueous solution with an effective chlorine content of 1% for 20 minutes to perform surface sterilization.
  • the base of the obtained shoot was added with oxidized glutathione 25 mg / L, STS (AgS 4 O 6 ) 5 ⁇ M as a silver ion source, ascorbic acid 50 mg / L as an antioxidant, and IBA 2 mg / L as a plant hormone 4 Double dilution MS medium (composition: ammonium nitrate 412.5 mg / L, potassium nitrate 475 mg / L, potassium dihydrogen phosphate 42.52 mg / L, potassium iodide 0.21 mg / L, carbon sources other than glutathione in this medium) And added to a porous support made of foamed phenolic resin (made by Smithers Oasis, trade name: Oasis) wetted with a carbon dioxide concentration of 1000 ppm, a temperature of 25 ° C., and a wavelength component of 650 to 670 nm.
  • a porous support made of foamed phenolic resin (made by Smithers Oasis, trade name:
  • a photosynthetic effective photon flux containing a wavelength component of 450 to 470 nm in a ratio of 8.2: 1.8 2 months incubation was performed at the red light under irradiation of degrees 51.3 ⁇ mol / m 2 / S.
  • a cube having a maximum dimension of 10 to 11.5 cm ⁇ width of 10 to 11.5 cm ⁇ height of 10.0 cm and a slightly protruding body was used as the culture container.
  • the top surface of the culture vessel is provided with one circular opening to which a polytetrafluoroethylene film (made by Millipore, trade name: Milliceal) having a pore diameter of 0.45 ⁇ m is attached.
  • the concentration of carbon dioxide in the culture vessel is the concentration (about 1000 ppm) permeated from the membrane at the opening of the culture container because the carbon dioxide outside the culture vessel permeates through the membrane at the opening of the culture vessel.
  • Irradiation of the red light irradiation to the culture vessel was performed using a product name: CCFL light source unit and a manufacturer name: Nippon Medical Instruments Co., Ltd. as a light irradiation device.
  • the humidity in the culture container was adjusted by sealing the culture container with parafilm.
  • Example 2 Culture was carried out in the same manner as in Example 1 except that the amount of oxidized glutathione added to the medium was 50 mg / L. The results are shown in Table 1.
  • Example 3 Culture was carried out in the same manner as in Example 1 except that the amount of oxidized glutathione added to the medium was 75 mg / L. The results are shown in Table 1.
  • E. europhylla and Eucalyptus grandis (Eucalyptus grandis, hereinafter simply abbreviated as E. eurograndis) strain name: A was used as a material for cuttings. That is, from the harvested mother tree, a spiked tree having a length of 5 to 20 cm, a node extending from 1 to 3 nodes, and a leaf extending to about 2 to 6 leaves was cut out, and about half of the tip side of the leaf was excised to prepare an insertion ear. .
  • a seedling pot (inner diameter 3 cm ⁇ height 15 cm) previously filled with mixed soil of rice husk charcoal, coconut fiber, and vermiculite was used.
  • Oxidized glutathione was dissolved in water to a concentration of 50 mg / L to prepare an oxidized glutathione solution.
  • the amount of water sprayed per seedling pot was about 8.5 ml of oxidized glutathione solution (50 mg / L), and watering treatment was carried out with water from the upper part of the seedling pot and included in the support. Thereafter, the base of the cutting ear was inserted into the support. After insertion, seedlings were raised for 3 weeks in a greenhouse where sunlight was shielded by 50%. In the greenhouse, high humidity (over 80%) was maintained by spraying mist frequently. The rooting rate was calculated from the number of cuttings rooted after seedling for 3 weeks. The results are shown in Table 2.
  • Example 5 Seedlings were grown in the same manner as in Example 4 except that a solution having an oxidized glutathione concentration of 200 mg / L was used as the oxidized glutathione solution. The results are shown in Table 2.
  • Example 6 Seedlings were raised in the same manner as in Example 4 except that an oxidized glutathione solution having an oxidized glutathione concentration of 500 mg / L was used. The results are shown in Table 2.
  • Example 7 Seedlings were grown in the same manner as in Example 4 except that an oxidized glutathione solution having an oxidized glutathione concentration of 1000 mg / L was used. The results are shown in Table 2.
  • Example 8 Oxidized glutathione was added and added to the leaf surface of the ear. That is, E. Except for Eurograndis strain name: B, cuttings were prepared in the same manner as in Example 5, and the base of the cuttings was inserted into the same support as in Example 5. An oxidized glutathione solution was prepared in the same manner as in Example 5. Immediately after insertion, the solution was sprayed in the form of a mist onto the leaf surface of the chute. The application amount was about 1.1 ml per chute. The seedling raising conditions after the insertion were the same as in Example 5, and the rooting rate was calculated in the same manner. The results are shown in Table 3.
  • Example 9 Seedlings were raised in the same manner as in Example 8, except that a solution having an oxidized glutathione concentration of 500 mg / L was used as the oxidized glutathione solution. The results are shown in Table 3.
  • Example 10 Seedlings were grown in the same manner as in Example 8, except that a solution having an oxidized glutathione concentration of 1000 mg / L was used as the oxidized glutathione solution. The results are shown in Table 3.
  • Mango (Mangifera Indiana Linn. Variety: Irwin) was used as a material for cuttings. That is, from 1 to 3 nodes and 1 to 5 leaves of a spiked tree were cut out from the branches of the harvested mother tree, and a part of the leaves was cut out. Furthermore, the base was scratched with a cutter to prepare an insertion head.
  • the obtained shoot was treated with running water overnight and immersed in an insecticide solution such as potato, then oxidized glutathione 50 mg / L, 5 ⁇ M STS (AgS 4 O 6 ) as a silver ion source, and 50 mg ascorbic acid as an antioxidant. 4 times diluted MS medium (composition: ammonium nitrate 412.5 mg / L, potassium nitrate 475 mg / L, potassium dihydrogen phosphate 42.52 mg / L, potassium iodide) 21 mg / L, etc. In addition, a carbon source other than glutathione was not added to this medium.
  • a photosynthetic effective photon flux density 51 containing a carbon dioxide concentration of 1000 ppm, a temperature of 25 ° C., a humidity of 60%, a wavelength component of 650 to 670 nm and a wavelength component of 450 to 470 nm in a ratio of 8.2: 1.8.
  • the cells were cultured for 1.5 months under irradiation with red light of 3 ⁇ mol / m 2 / S.
  • a rectangular parallelepiped having a maximum dimension of about 20 to 22 cm in length, 33 to 37 cm in width, and 15 to 17 cm in height was used as the culture container.
  • the top surface of the culture vessel is provided with 10 circular openings to which a polytetrafluoroethylene membrane having a pore diameter of 0.45 ⁇ m (trade name: Milliceal, manufactured by Millipore) is attached.
  • the concentration of carbon dioxide in the culture vessel was adjusted and controlled by the membrane at the opening of the culture vessel.
  • the concentration of carbon dioxide in the culture vessel is the concentration (about 1000 ppm) permeated from the membrane at the opening of the culture vessel because the carbon dioxide outside the culture vessel permeates through the membrane at the opening of the culture vessel. there were.
  • Irradiation of the red light irradiation to the culture vessel was performed using a product name: CCFL light source unit and a manufacturer name: Nippon Medical Equipment Co., Ltd. as a light irradiation device. Moreover, the humidity in a culture container was about 100% by sealing a culture container with a parafilm.
  • the rooting rate was 26.9% in Example 11 in which 50 mg / L of oxidized glutathione was added to the medium, whereas Comparative Example 4 in which no oxidized glutathione was added.
  • the rooting rate was as low as 19.2%.
  • Example 12 As a method of giving oxidized glutathione, 1% granule was mixed in a mixed soil and used. That is, 15 g of oxidized glutathione 1% granule was mixed with 5.5 L of mixed soil of peat moss and vermiculite, and the mixture was packed in a seedling pot (inner diameter 3 cm ⁇ height 15 cm ⁇ 66 holes) to obtain a support.
  • the tea was used as the material for the cuttings.
  • a spiked tree with a length of 5 cm to 20 cm, 1 to 3 nodes and 1 to 6 leaves, cut off the top half of the leaf, and insert the cuttings. Prepared and prepared.
  • the base of the adjusted spike was inserted into the support (66 per seedling pot was inserted).
  • a photosynthetic effective photon flux density 51 containing a carbon dioxide concentration of 1000 ppm, a temperature of 25 ° C., a humidity of 60%, a wavelength component of 650 to 670 nm and a wavelength component of 450 to 470 nm in a ratio of 8.2: 1.8.
  • the cells were cultured for 1.5 months under irradiation with red light of 3 ⁇ mol / m 2 / S.
  • the seedling pot was moved to the greenhouse and raised for 2.5 months.
  • high humidity over 80% was maintained by spraying mist frequently.
  • the rooting rate was calculated from the number of cuttings rooted after seedling for 2.5 months. The results are shown in Table 5.
  • Example 13 Culturing was carried out in the same manner as in Example 12 except that the amount of 1% oxidized glutathione granule added to the mixed soil (5.5 L) was 75 g. The results are shown in Table 5.
  • Example 14 Genetically modified E. coli Cultivation was carried out in the same manner as in Example 1 except that Globulus (strain name: Clone B) was used and the shoot base was scratched with scissors. The scratches were made with scissors in two orthogonal directions so that the base of the chute (the above-mentioned cut surface) was cross-shaped when viewed from the front. The results are shown in Table 6.
  • Example 15 Culture was carried out in the same manner as in Example 14 except that the amount of oxidized glutathione added to the medium was 75 mg / L. The results are shown in Table 6.
  • Example 16 Genetically modified E. coli Cultured in the same manner as in Example 1 except that a shoot of Globulus (strain name: Clone C) was used, the amount of oxidized glutathione added to the medium was 50 mg / L, and the shoot base was scratched with scissors. Went. The results are shown in Table 7.
  • Example 17 Culturing was carried out in the same manner as in Example 16 except that a shoot of genetically modified E. globulus (strain name: Clone D) was used. The results are shown in Table 7.
  • Example 18 Culturing was carried out in the same manner as in Example 16 except that a shoot of genetically modified E. globulus (strain name: Clone E) was used. The results are shown in Table 7.
  • Example 19 Culturing was performed in the same manner as in Example 16 except that E. globulae (wild type F) shoots were used. The results are shown in Table 7.
  • Example 20 Genetically modified E. coli that is clearly difficult to root as a material. Culturing was carried out in the same manner as in Example 16 except that Globulus (strain name: Clone G) was used. The results are shown in Table 8.
  • Example 21 Genetically modified E. coli that is clearly difficult to root as a material. Culturing was performed in the same manner as in Example 16 except that Globulus (strain name: Clone H) was used. The results are shown in Table 8.
  • Example 22 Genetically modified E. coli that is clearly difficult to root as a material. Culturing was carried out in the same manner as in Example 16 except that Globulus (strain name: Clone I) was used. The results are shown in Table 8.

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Abstract

　植物のシュートを、グルタチオンの存在下にて栽培し、シュートから発根させる。グルタチオンの存在下の栽培は、グルタチオンを含む発根用培地を用いるか、或いはグルタチオンを含む溶液をシュートに接触させて行い得る。グルタチオンとして好ましくは酸化型グルタチオンを用いる。植物のシュートからの発根を促進して、その発根率を向上させることにより、クローン苗の生産性を向上させる。

Description

クローン苗の生産方法
　本発明は、クローン苗の生産に関するものであり、詳しくは、植物のシュートを発根させて行うクローン苗の生産方法及び該生産方法に好適に用いられる発根用培地に関する。
　目的に適った形質を持つ均質な植物体（苗）を大量に生産するステップは、農業生産、植林、育種、その他の目的で植物体を産業的に利用しようとする場合に、必ず要求される。このとき植物体の大量生産手段として有用なのが、伝統的な挿し木法や、近年のバイオテクノロジーの発達により生まれた組織培養法である。これらの方法によれば、単に、苗の大量生産ができるばかりではなく、同一の遺伝的性質を有する植物体、即ちクローン苗を大量かつ迅速に生産することができる。特に、遺伝子組換えを行った優良な樹木の系統を大量増殖する場合には、選定された系統を用いて栄養繁殖による効率的な苗生産を行うことが必須である。
　挿し木法においては、増殖しようとする植物の個体から枝や茎、場合によっては頂芽、腋芽、葉、子葉又は胚軸等を切取って挿し穂とし、これを挿し床や培地に挿し付けて発根させ植物体を生産する。一方、組織培養法において植物を大量増殖しようとする場合には、増殖しようとする植物の個体から適当な組織を切取って培養し、不定芽、不定胚、苗条原基又はこれらの組織から伸長してくる茎葉（シュート）を採取して発根させる。つまり、いずれの方法を用いてクローン苗を生産するにしても、発根という過程を経ることとなる。
　従って、植物組織の発根能は、クローン苗の生産性に大きな影響を与える。特に、これらのクローン苗を産業的に利用しようとする場合、発根能が低い植物種では、これは深刻な問題となる。
　植物組織からの発根に影響する要因として様々な物質が関与することが知られている。例としては、植物組織自身が放出するエチレンの関与が考えられている。そこで、エチレンの発生を抑制するため、前記不定芽等の組織を培養するにあたり、培地中に硝酸銀を添加することが試みられている（特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、植物組織の枯死率は、ある程度減少するものの、発根自体は抑制されたり、遅延したりしてしまうため、植物組織からの発根率に対しては、向上効果が小さいか、むしろ阻害的に働くものであった。
　さらに、銀イオンとしてチオ硫酸銀（ＡｇＳ4Ｏ6、Ｓｉｌｖｅｒ　Ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ、以下ＳＴＳと略記する。）、抗酸化剤としてアスコルビン酸を含有する培地において、特にユーカリの発根率の向上が認められ、さらに光源としては白色光に比較して赤色光がより望ましいとの報告がある（特許文献２参照）。しかしながら、これらの改良によっても、発根率の向上が十分とはいえない植物種や有用形質を持つユーカリの系統があり、発根率が低いために苗の生産効率が低く、大きな問題となっていた。
　一方、グルタチオンがカルスからの不定胚の分化に関与することが報告されている。例えば、特許文献３において、イネやトルコギキョウのカルスを、グルタチオンを含有する培地で培養すると、再分化が促進されることが開示されている。
　しかし、特許文献４においては、タバコのカルスからの不定芽形成に対して、グルタチオン１ｍＭの添加はむしろ阻害的に働き、グルタチオン合成阻害剤であるブチオニンスルフォキシミン（ＢＳＯ）の添加によりカルス当たり不定芽分化数が顕著に増加することが開示されている。このことは、グルタチオンのカルスの再分化への影響は、カルスの植物体の種類によって異なるものであることを示している。
　このように、シュートからクローン苗を実用上十分な程度に得る技術はなく、また、グルタチオンについては、限られた植物種のカルスの不定胚形成に関わることが報告されているに過ぎなかった。以上の背景より、シュートを効率よく発根させクローン苗を得る、産業上有用な技術が望まれていた。
特開２００１－３４６４６４号公報（平成１３年１２月１８日公開） 特開２００６－１４１２５２号公報（平成１８年６月８日公開） 特開２００４－３５２６７９号公報（平成１６年１２月１６日公開） 特開２００８－１２０８１５号公報（平成２０年５月２９日公開）
　本発明は、植物のシュートからの発根を促進して、その発根率を向上させることにより、挿し木法や組織培養法などによるクローン苗、特に発根能が低い植物種に属するクローン苗の生産性を向上させることを目的する。さらに、クローン苗の大量かつ迅速な生産を可能として、その産業的利用に途を開くことを目的とする。
　本発明のクローン苗の生産方法は、植物のシュートをグルタチオンの存在下にて栽培する工程を包含することを特徴としている。
　本発明の生産方法において、上記工程は、グルタチオンを含む培地を用いて行われてもよい。
　本発明の生産方法において、上記培地のグルタチオン濃度は、１ｍｇ／Ｌ～５０００ｍｇ／Ｌの範囲内であることが好ましく、１ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌの範囲内であることがより好ましい。
　本発明の生産方法において、上記培地は、グルタチオン以外の炭素源を含まないことが好ましく、窒素、リンおよびカリウムを必須元素として含むことが好ましい。
　本発明の生産方法において、上記工程は、グルタチオンを含む溶液を植物のシュートに接触させることによって行われてもよい。
　本発明の生産方法において、上記溶液のグルタチオン濃度は、１ｍｇ／Ｌ～５０００ｍｇ／Ｌの範囲内であることが好ましく、１ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌの範囲内であることがより好ましい。
　本発明の生産方法において、上記グルタチオンは酸化型グルタチオンであることが好ましい。
　本発明の生産方法において、上記植物は難発根性であってもよく、この場合、ユーカリ属植物、マツ属植物、サクラ属植物、マンゴー属植物およびアボガドからなる群より選択される植物であることが好ましく、ユーカリ属植物であることがより好ましい。
　本発明の生産方法において、上記工程は、６５０～６７０ｎｍの波長成分と４５０～４７０ｎｍの波長成分とを９：１～７：３の割合で含む光照射下で行われることが好ましい。
　本発明の生産方法において、上記工程は、炭酸ガスを供給しながら行われることが好ましい。
　本発明の生産方法において、上記炭酸ガスの供給量は、３００～２０００ｐｐｍであることが好ましい。
　本発明の生産方法において、上記工程は、湿度８０％以上の条件下で行われることが好ましい。
　本発明の生産方法は、基部に傷をつけられたシュートを用いて行われてもよい。
　本発明の生産方法において、上記シュートは、挿し穂、または、母本植物から採取した器官を無菌的に培養することにより得た多芽体、もしくは該器官を無菌的に育成して得た茎葉であることが好ましい。
　本発明の組成物は、植物のシュートから発根させるために、グルタチオンを含有することを特徴としている。
　本発明の組成物は、培地として用いられることが好ましい。
　本発明の組成物において、グルタチオンの濃度は、１ｍｇ／Ｌ～５０００ｍｇ／Ｌの範囲内であることが好ましく、１ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌの範囲内であることがより好ましい。
　本発明の組成物は、培地または溶液に混合される補助剤として用いられてもよく、混合後の培地中または溶液中にて、１ｍｇ／Ｌ～５０００ｍｇ／Ｌの範囲内のグルタチオンの最終濃度を提供することが好ましく、１ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌの範囲内のグルタチオンの最終濃度を提供することがより好ましい。また、本発明の組成物は、錠剤、散剤または顆粒剤の形態であることが好ましい。
　本発明の組成物は、植物の無性繁殖を行うために用いられることが好ましく、植物のシュートからクローン苗を調製するために用いられてもよい。
　本発明の組成物において、上記グルタチオンは酸化型グルタチオンであることが好ましい。
　本発明の組成物は、グルタチオン以外の炭素源を含まないことが好ましく、窒素、リンおよびカリウムを必須元素として含むことが好ましい。
　本発明は、植物のシュートから発根させるために、グルタチオンが用いられることを特徴としており、植物のシュートからクローン苗を調製するために、グルタチオンが用いられることがより好ましい。さらに、本発明は、植物のシュートから発根させるための組成物を調製するために、グルタチオンが用いられることを特徴としており、植物のシュートからクローン苗を調製するための組成物を調製するために、グルタチオンが用いられることがより好ましい。
　本発明によれば、植物のシュートを、グルタチオンの存在下にて栽培することにより、前記シュートからの発根を促進させ、発根率を向上させることができるので、クローン苗の生産性を向上させることができる。しかも、このような効果は、発根能が低い植物種で特に顕著である。従って、本発明は、広く様々な植物種のクローン苗の大量かつ迅速な生産に寄与するものであり、特に、発根能が低い植物種であっても、クローン苗を大量かつ迅速に生産することを可能とし、その産業的利用に途を開くものである。
　［植物の繁殖法］
　植物は、種子繁殖（有性生殖）または栄養繁殖（無性生殖）を介して、種の繁栄を維持する。植物の育種において、優良な形質を有する個体を多数得ることが求められている。そのために、遺伝的に異なる多数の個体から、目的に合致する優良な個体を選抜し、選抜された個体が栄養繁殖を用いてクローン増殖され、クローン苗が取得される。栄養繁殖は、同一形質の固体を増殖させることができる技術であり、挿し木、接ぎ木、取り木、株分けなどが含まれる。
　挿し木は、目的の植物の一部を採取して、挿し床において不定根、不定芽を発生させて、独立した一個体を形成させる技術であり、最も幅広く利用され得る簡便な技術であるが、発根能が低い植物に適用することは非常に困難である。接ぎ木は、目的の植物の一部を他の植物に接着させて一個体として生育させる技術であり、挿し木や取り木に適用することが困難な植物であっても繁殖させることが可能であるが、技術的に非常に困難である。取り木は、接ぎ木や取り木に適用することが困難な植物に用いられるが、繁殖効率が悪い。
　挿し木を試みる場合には、目的の植物の発根能が重要であるので、種々の発根促進剤（例えば、オーキシン）が用いられることが多い。培地中の寒天やショ糖濃度等が根の形態に影響を及ぼすことも知られている。また、ヒノキのように、活性炭による発根促進効果を示すものもある。さらに、有菌状態でシュートを挿しつけることによって発根が促進することがあることも知られている。
　このように、植物の栄養繁殖によって種苗を安定的に供給することが求められており、そのために、クローン苗を生産する効率的な手法の開発が望まれている。
　本発明は、植物のシュートからのクローン苗の生産に関するものである。すなわち、本発明は、植物のシュートを、グルタチオンの存在下にて栽培し、前記シュートから発根させる技術である。植物のシュートからの発根を促進させて、クローン苗を生産し得る程度にまで発根率を向上させることができる本発明は、クローン苗の生産性を向上させることができる非常に効率的な技術である。
　［対象植物］
　本発明は、どのような植物に対しても適用することができる。中でも木本植物に適用されることが好ましく、草本植物よりも発根能が劣っている木本植物に適用されることが、本発明の効果を顕著に発揮できる点でより好ましい。木本植物としては例えば、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）植物、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）植物、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）植物（サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ　ｓｐｐ．）、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ　ｍｕｍｅ）、ユスラウメ（Ｐｒｕｎｕｓ　ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）など）、アボカド属（Ａｖｏｃａｄｏ）植物、マンゴー属(Ｍａｎｇｉｆｅｒａ)植物（マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ　ｉｎｄｉｃａ）など）、アカシア属（Ａｃａｃｉａ）植物、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ）植物、クヌギ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）植物（クヌギなど（Ｑｕｅｒｃｕｓ　ａｃｕｔｉｓｓｉｍａ））、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ）属植物、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属植物、バラ属（Ｒｏｓａ）植物、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）植物、ジャカランダ属（Ｊａｃａｒａｎｄａ）植物（ジャカランダ（Ｊａｃａｒａｎｄａ　ｍｉｍｏｓｉｆｏｌｉａ）など）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）植物（アボカド（Ｐｅｒｓｅａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ）など）が挙げられる。このうち、ユーカリ、マツ、サクラ、マンゴー、アボカド、アカシア、ヤマモモ、クヌギ、ブドウ、リンゴ、バラ、ツバキ、ウメ、ユスラウメ、ジャカランタ等に適用した場合に、より本発明の効果を発揮しうる。中でもユーカリ属植物、マツ属植物、サクラ属植物、マンゴー属植物が好ましく、特に、難発根性として知られるユーカリ、マツ、サクラ、マンゴー、アボカド等に本発明を適用すれば、大きな効果が得られる。
　ユーカリの中でも、ユーカリ・グロビュラス、ユーカリ・スミジアイなどのユーカリ属植物は特に難発根性であるため、本発明を適用すれば、大きな効果が得られうる。なお、ユーカリは発根能が非常に低く、オーキシン存在下であっても、ユーカリ・グロビュラスの精英樹の発根率が、高いものであっても２５％程度であることが知られている（例えば、Sotelo, M. and Monza, J. Agrociencia (2007) Vol XI, No.1, p.81-89参照）。
　［シュート］
　シュートとは、発根能を有する組織全般をいう。該組織としては、枝、茎、頂芽、腋芽、不定芽、葉、子葉、胚軸、不定胚、苗条原基等が例示される。シュートの由来は特に限定されず、温室や屋外に生育している植物個体から得られたものでもよいし、組織培養法により得られた培養組織であってもよいし、天然の植物体の一部の組織であってもよい。また、クローン苗とは、これらの組織が発根して得られる苗をいう。シュートは、挿し穂の母本植物や、多芽体から効率良く取得することができる。中でも、挿し穂（母本植物から得た挿し穂）、母本植物から採取した器官を無菌的に培養することにより得た多芽体、もしくは前記器官を無菌的に育成して得た茎葉であることが好ましい。
　多芽体は、本発明を適用してクローン苗を生産しようとする植物から、頂芽や腋芽等を切取って、これを組織培養して誘導することができる。多芽体を、母本植物から採取した器官を無菌的に培養して得る方法としては、例えば、前記の木本植物から、多芽体を形成させるには、特開平８－２２８６２１号公報に記載の方法、条件に従って行い得る。その方法、条件は概ね次の通りである。まず、材料とする植物から頂芽、腋芽等の組織を採取し、採取した組織について、有効塩素量約０．５％～約４％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液又は有効塩素量約５％～約１５％の過酸化水素水溶液に約１０分～約２０分間浸漬して表面殺菌を行う。次いで、これを滅菌水で洗浄し、固体培地に挿し付けて芽を開じょさせ、伸長してきた茎葉を同じ組成の培地で継代培養することにより、多芽体を形成させる。ユーカリ属やアカシア属の組織（例えば腋芽）を用いる場合には、固体培地は、ショ糖１～５重量％、植物ホルモンとしてベンジルアデニン（以下、ＢＡと略す。）約０．０２ｍｇ／Ｌ～約１ｍｇ／Ｌ、ゲランガム約０．２重量％～約０．３重量％若しくは寒天約０．５重量％～約１重量％を含有するムラシゲスクーグ（以下、ＭＳと略す。）培地又はこのＭＳ培地の硝酸アンモニウム成分と硝酸カリウム成分とを半減させた改変ＭＳ培地を用いるのが好ましい。こうして形成された多芽体からは活発にシュートが伸長してくる。多芽体自体は、適当に分割して多芽体形成に用いた培地と同一組成の培地で培養することにより維持し、増殖させることができる。
　［挿し穂］
　本発明においては上述したように、植物のシュートを栽培するにあたり、シュートとして挿し穂を用いてもよい。挿し穂としては、緑枝（当年枝）や熟枝（前年以前に伸びた枝）の他、芽や葉も用いることができる。木本植物の場合では緑枝や熟枝を挿し穂として用い、草本植物の場合では葉や芽を挿し穂として用いるのが普通である。
　［グルタチオン］
　本発明においては、上記シュートを栽培するにあたり、グルタチオンを用いる。グルタチオンは、その製造条件は特に限定されず、人工的に合成されたものでも、天然物由来のものでもよい。また、精製度も特に問わない。市販品を利用することも可能である。グルタチオンとしては、酸化型と還元型とあり、本発明ではいずれも用い得るが、酸化型グルタチオンが好ましい。本発明においてグルタチオンとして酸化型グルタチオンを用いる場合には、植物体に取り込まれた後、植物体内にて、より安定性に優れる還元型グルタチオンに変化するものと推測される。
　植物のシュートをグルタチオンの存在下にて栽培する工程は、植物の種類やシュートの状態、栽培方法などから適宜選択でき、グルタチオンを含む発根用培地でシュートを培養する方法；グルタチオンを含む溶液をシュートに接触させる方法、が例示される。シュートとして組織培養法により得られた培養組織を用いる場合には前者が好ましく、シュートとして挿し穂を用いる場合には前者、後者のいずれでもよい。なお、本発明においては上記例示した両方法の併用、すなわち、グルタチオンを含む発根用培地でシュートを培養しつつ、グルタチオンを含む溶液をシュートに接触させる方法を採用することも、もちろん可能である。
　グルタチオンを含む発根用培地でシュートを培養する場合、発根用培地中のグルタチオンの濃度は、好ましくは約１ｍｇ／Ｌ～約５０００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約５ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌ、とりわけ好ましくは約２５ｍｇ／Ｌ／ｌ～約５００ｍｇ／Ｌである。
　発根用培地での培養の際に、後述のように支持体を用いる場合であって、支持体がオアシス等の活性成分の吸着の少ない支持体のときには、グルタチオンの発根用培地における添加量は、好ましくは約１ｍｇ／Ｌ～約１００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約５ｍｇ／Ｌ～約７５ｍｇ／Ｌ、とりわけ好ましくは約２５ｍｇ／Ｌ～約７５ｍｇ／Ｌである。
　グルタチオンを含む溶液（グルタチオン溶液）をシュートに接触させる場合、その接触の方法は特に限定されず、植物の種類やシュートの状態、栽培方法などから適宜選択しうる。例えば、シュートへグルタチオン溶液を直接散布する方法、支持体をグルタチオン溶液で浸潤させる方法が挙げられる。
　グルタチオン溶液は、グルタチオンを、適当な溶媒（例えば、水など）に溶解させて調製され得る。水としては、脱イオン水、蒸留水、逆浸透水、水道水などが例示され、いずれも利用可能である。グルタチオン溶液におけるグルタチオンの濃度は、約１ｍｇ／Ｌ～約５０００ｍｇ／Ｌであることが好ましく、約５ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌであることがより好ましく、約１０ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌであることがさらにより好ましい。
　グルタチオン溶液をシュートに直接散布する場合は、グルタチオン溶液を、スプレーなどを用いて霧状に、シュートの一部または全体に散布すればよい。グルタチオン溶液の散布量は、グルタチオン溶液中のグルタチオンの濃度にもより、一概には規定できないが、一般には１つのシュートあたり約０．５ｍｌ～約５．０ｍｌが好ましく、約１．０ｍｌ～約３．０ｍｌがより好ましい。散布回数は、１回でも２回以上であってもよいが、少なくとも栽培開始時に散布することが好ましい。さらに栽培条件に応じて、栽培期間中に適宜（例えば数日（２日～３日）おき）追加で散布を行ってもよい。
　支持体をグルタチオン溶液で湿潤させる場合は、グルタチオン溶液を支持体上部から散水する方法、グルタチオン溶液を満たした容器内に支持体を置床し底面から潅水させる方法などが例示される。支持体上部から散水する場合、上部からの散水量としては、１つのシュートあたり約１．０ｍｌ～約３０ｍｌが好ましく、約５．０ｍｌ～約１０．０ｍｌがより好ましい。底面から潅水させる場合は、グルタチオン溶液が支持体に、実質的に均一に湿潤されればよい。支持体をグルタチオン溶液で湿潤させる場合、グルタチオン溶液のほかに別途発根用培地を用意し、両者で支持体を湿潤させてもよく、このことは前述したとおりである。
　グルタチオンは、グルタチオン含有培地（発根用培地）またはグルタチオン溶液を調製する際に、培地または溶液に添加して混合される補助剤として提供されてもよく、発根用培地またはグルタチオン溶液を首尾よく調製するために、錠剤、散剤または顆粒剤の形態であることが好ましい。調製した発根用培地またはグルタチオン溶液におけるグルタチオンの最終濃度が上述した範囲内になるように、グルタチオンが上記補助剤に含有されている。
　なお、グルタチオン含有培地またはグルタチオン溶液は、グルタチオンが上記濃度範囲内に調整された後に植物に供給されることが好ましいが、植物に取り込まれる段階でグルタチオンが培地または溶液と混合されていればよい。よって、グルタチオンを含有しない培地または溶液と上記補助剤とが、同時にまたは連続的に、植物の外表面に直接的に供給されても、植物の近傍（支持体または用土）に供給されてもよい。このような手順をもちいることによって、植物は、補助剤が混合された培地または溶液を取り込むことができる。
　［発根用培地］
　本発明において発根用培地とは、植物のシュートから発根させるために用いられる培地を意味する。発根用培地は、銀イオン及び／又は抗酸化剤を含有することが好ましく、銀イオン及び抗酸化剤の両方を含有することがより好ましい。銀イオンは、ＳＴＳや硝酸銀等の銀化合物（銀イオン源）として培地中に添加すればよい。中でもＳＴＳは、培地に添加してシュートを培養すると、健全な根の発根・伸長が促進されるので、本発明で用いる銀イオン源として好ましい。これは、このＳＴＳに由来する銀イオンが、培地中で、チオ硫酸銀イオンの形態を取り、マイナスに帯電しているためと考えられる。発根用培地中に添加する銀イオンの濃度は、銀イオン源の種類その他の培養条件などにもよるが、銀イオン源の濃度として約０．５μＭ～約１０μＭが好ましく、約２μＭ～約６μＭがより好ましい。
　一方、抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸や亜硫酸塩等、公知のものを用いることができる。中でもアスコルビン酸は、培地への残留性が低いので、本発明で用いる抗酸化剤として好ましい。発根用培地中に添加する抗酸化剤の濃度は、約５ｍｇ／Ｌ～約２００ｍｇ／Ｌが好ましく、約２０ｍｇ／Ｌ～約１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。
　本発明で用いる発根用培地は、上記成分に加え、無機成分、炭素源、ビタミン類、アミノ酸類及び植物ホルモン類等を含み得る。
　無機成分としては、窒素、リン、カリウム、硫黄、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の元素や、これらを含む無機塩が例示される。該無機塩としては例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ホウ酸、三酸化モリブデン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等やこれらの水和物が挙げられる。無機成分として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。本発明で用いられる発根用培地においては、窒素、リン、カリウムが必須元素として含まれることが好ましい。よって、これら無機成分の具体例のうち、窒素、リン、カリウム、窒素を含む無機塩、リンを含む無機塩、及びカリウムを含む無機塩が好ましく、窒素、リン、カリウム、窒素を含む無機塩がより好ましい。無機成分は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は約１μＭ～約１００ｍＭとなるように添加することが好ましく、約０．１μＭ～約１００ｍＭとなるように添加することがより好ましい。２種以上の組み合わせの場合はそれぞれ約０．１μＭ～約１００ｍＭとなるよう添加することが好ましく、約１μＭ～約１００ｍＭとなるように添加することがより好ましい。
　炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘導体；脂肪酸等の有機酸；エタノール等の１級アルコール、などの化合物を使用することができる。炭素源として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。炭素源は、発根用培地中に約１ｇ／ｌ～約１００ｇ／ｌとなるよう添加することが好ましく、約１０ｇ／ｌ～約１００ｇ／ｌとなるように添加することがより好ましい。しかし、培養を炭酸ガスを供給しながら行う場合には、培地は炭素源を含む必要は無く、含まないことが好ましい。ショ糖等の炭素源となりうる有機化合物は微生物の炭素源ともなるので、これらを添加した培地を用いる場合には、無菌環境下で培養を行う必要があるが、グルタチオン以外の炭素源を含まない培地を用いることにより、非無菌環境下での培養が可能となる。
　ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ４）、ピリドキサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、イノシトール、ニコチン酸、ニコチン酸アミド及び／又はリボフラビン（ビタミンＢ２）等を使用することができる。ビタミン類として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。ビタミン類は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は発根用培地中に約０．０１ｍｇ／Ｌ～約２００ｍｇ／Ｌとなるように添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／Ｌ～約１００ｍｇ／Ｌとなるように添加することがより好ましい。２種以上の組み合わせの場合はそれぞれ、発根用培地中に約０．０１ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌとなるよう添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／Ｌ～約１００ｍｇ／Ｌとなるように添加することがより好ましい。
　アミノ酸類としては、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン酸、システイン、フェニルアラニン及び／又はリジン等を使用することができる。アミノ酸類として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。アミノ酸類は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は発根用培地中に約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌとなるように添加することが好ましく、２種以上の組み合わせの場合は、それぞれ発根用培地中に約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌとなるよう添加することが好ましい。
　また、植物ホルモン類としては、例えば、オーキシン類及び／又はサイトカイニン類を使用することができる。オーキシン類としては、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ｐ－クロロフェノキシ酢酸、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）及びこれらの誘導体等が例示され、これらから選択される１種以上又は２種以上を組み合わせて用い得る。また、サイトカイニン類としてはベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン及びこれらの誘導体等が例示され、これらから選択される１種以上又は２種以上を組み合わせて用い得る。植物ホルモン類としては、オーキシン類のみ、サイトカイニン類のみ、或いはオーキシン類とサイトカイニン類の両方を組み合わせて用いうる。植物ホルモン類は、１種を用いる場合には発根用培地中に約０．０１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌとなるように添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌとなるように添加することがより好ましい。２種以上の場合にはそれぞれ、発根用培地中に約０．０１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌとなるよう添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌとなるように添加することがより好ましい。
　なお、本発明においては、植物組織培養用培地として公知の培地に、必要に応じてグルタチオンを添加するほか、さらに銀イオン及び／又は抗酸化剤を添加し、さらにまた、グルタチオン以外の炭素源、植物ホルモン類を適宜添加等して、発根用培地として用いてもよい。かかる植物組織培養用培地としては、例えば、ＭＳ培地、リンスマイヤースクーグ培地、ホワイト培地、ガンボーグのＢ－５培地、ニッチニッチ培地等を挙げることができる。中でも、ＭＳ培地及びガンボーグのＢ－５培地が好ましい。これらの培地は、必要に応じて適宜希釈等して用いることができる。
　上記発根用培地は、液体培地、固体培地のいずれであってもよいが、液体培地の方が作業効率および移植時に根を傷つけることが少ない点で好ましい。液体培地の場合には培地組成を混合し調製してそのまま用い得る。また固体培地の場合には液体培地と同様に培地組成を混合し調製すると同時に、或いは調製後に、寒天又はゲランガム等の固化剤で固化させて使用しうる。固化剤の培地への添加量は、固化剤の種類や培地の組成にもっても異なる。固化剤が寒天の場合０．５重量％～１重量％であることが好ましい。固化剤がゲランガムの場合０．２重量％～０．３重量％であることが好ましい。
　発根用培地へのシュートの挿し付け方法は、培地の種類、培養条件等により適宜選択しうる。発根用培地が固体培地の場合は、発根用培地に直接シュートの基部を挿し付けて培養すればよい。一方発根用培地が液体培地の場合は、例えば、後述の支持体を発根用培地で湿潤させたものにシュートの基部を挿し付けて培養すればよい。なお、発根用培地に挿し付ける時にシュートの基部に傷をつけるといった物理的刺激を加えることも、発根率の向上のために好ましい。シュートの基部とは、シュートの一端であって根が形成される領域（葉の形成される端部に対し反対側）を意味する。シュートとして多芽体を用いる場合の基部は、多芽体を分割する際の切断面を有する領域である。シュートの基部への傷のサイズ（大きさ、形状など）は特に限定されない。例えば、シュートとして多芽体を用いる場合、シュートの基部（上述の切断面）を正面方向から見た際に十字型となるような傷を付けることが好ましい。傷を付ける際には、ハサミやナイフなどを用いることができる。
　このように、グルタチオンを、植物のシュートから発根させるための用途に用いることができる。また、グルタチオンを、植物の無性繁殖を行うための用途に用いることができる。
　このような用途を実現するためには、化合物としてのグルタチオンが直接用いられても、グルタチオンを含有している組成物が用いられてもよく、また、キットに備えられているグルタチオンまたは組成物が用いられてもよい。本発明の組成物としては、上述したような、発根用培地（グルタチオン含有培地）、グルタチオンを含む溶液（グルタチオン溶液またはグルタチオン含有溶液）および補助剤が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、組成物は「二種以上の成分が全体として均質に存在し、一物質として把握されるもの」が意図され、本明細書中で使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図される。また、本明細書中で使用される場合、「キット」は、組成物中に含有されるべき各種成分が別々の容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）に含まれておりかつ容器の全てが全体として1つに梱包されている形態であることが意図され、後述する支持体または培養容器を備えていてもよい。
　［支持体］
　本発明において支持体とは、植物のシュートを支持するための支持体である。発根用培地（特に固体培地）を用いる場合などには、支持体は不要の場合があるが、それ以外の場合には通常支持体が利用される。
　支持体は、栽培の期間中シュートを挿し付けた状態で保持できるものが好ましい。また、本発明において栽培にあたり液状の発根用培地を用いる場合には、通常、支持体に浸潤させて用いられる。よって支持体は液体で浸潤され得るものが好ましく、中でも、グルタチオン溶液、或いはグルタチオンを含む液体培地により実質的に均一に湿潤され得るものが好ましい。発根用培地として、液体培地を用いる場合には、液体培地（グルタチオン溶液を含まない）とグルタチオン溶液とを別個に支持体に添加してもよいし、予め調製したグルタチオンを含む液体培地を支持体に添加してもよい。支持体としては、従来慣用の支持体を用いることができ、特に限定されない。支持体としては例えば、砂、赤玉土等の自然土壌；籾殻燻炭、ココナッツ繊維、バーミキュライト、パーライト、ピートモス、ガラスビーズ等の人工土壌；発泡フェノール樹脂、ロックウール等の多孔性成形品などを挙げることができる。かかる支持体を培養容器内に入れ、グルタチオン溶液、或いはグルタチオンを含む液体培地にて湿潤させることにより発根床が調製され得る。なお、発根用培地が固体培地の場合には、固体培地を直接培養容器に入れることで、発根床が調製され得る。
　［培養容器］
　本発明においては、発根用培地または支持体を納めるための培養容器を用い得る。培養容器としては、従来慣用の培養容器を用いることができ、特に限定されない。例えば、育苗ポット、プラグトレーなどが例示される。培養容器は密閉型でもよいし開放型でもよいが、密閉型のものが好ましい。密閉型の培養容器を用いることにより、散布されたグルタチオンを保持することができる。また、シュートやこれから形成されるクローン苗を取り巻く環境の湿度維持が容易となる。
　シュートとして枝を用いる場合には、培養容器として密閉型の培養容器を用いることが好ましい。これによりシュートを高湿度下に置くことが容易となるので枝についた葉の蒸散作用が抑制され、従来行われていた葉の一部切除処理を省略することができる。
　培養容器は、容器内への炭酸ガス供給が可能な容器であることがより好ましい。このような培養容器としては、二酸化炭素透過性の膜で蔽われた開口部を有する容器が例示される。このような容器を用いることにより、培養環境の湿度をも容易に調整しうる。開口部の形状は特に問わない。二酸化炭素透過性の膜の材料は特に限定されず、ポリテトラフルオロエチレンなどが例示される。また、膜の孔径も特に限定されず、約０．１μｍ～約１μｍのものなどが例示される。
　［栽培条件］
　シュートを栽培する際の栽培条件としては、シュートから発根させ得る条件である限り特に限定されない。栽培条件は、植物の種類やシュートの状態、発根用培地の種類などにより一概に規定することは難しいが、例えば、温度は、約２３℃～約２８℃であることがより好ましい。光強度は、光合成有効光量子束密度として表され、約１０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ～約１０００μｍｏｌ／ｍ2／ｓであることが好ましく、約５０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ～約５００μｍｏｌ／ｍ2／ｓであることがより好ましい。いずれの場合でも、通常は約２週間～約５週間で、シュートからの発根が観察されるようになる。
　栽培は、６５０ｎｍ～６７０ｎｍの波長成分と４５０ｎｍ～４７０ｎｍの波長成分とを９：１～７：３の割合で含む光の照射下で行うことが好ましく、これらの波長成分を９：１～８：２の割合で含む光の照射下で行うことがより好ましい。かかる波長成分を含む光を照射して栽培を行うことで、シュートからの発根がより促進され得る。
　さらに、炭酸ガスを栽培環境中に、通常は３００ｐｐｍ～２０００ｐｐｍ、好ましくは８００ｐｐｍ～１５００ｐｐｍとなるように供給することが好ましい。炭酸ガスの供給量の制御は、人工気象器等の設備や、二酸化炭素透過性の膜を開口部に有する培養容器などを利用して行われうる。
　湿度は８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましい。この湿度であることにより、シュートの発根を促進することができる。また上限については特に制限はない。
　シュートとして挿し穂を用いる場合には、遮光を行うことが好ましい。遮光率は、３０～７０％が好ましく、４０～６０％がより好ましい。
　以上のようにして、シュートから発根したクローン苗が得られる。得られたシュートは、必要に応じてある程度の期間、そのまま培養を続け、根を充実させてから、これを育苗容器又は苗畑等に移植して育成し、植林等の所定の目的に使用可能な苗とすることができる。この間の用土や、苗を育成する際の温度・光強度等の条件は、その植物に適するように適宜設定すればよい。なお、不定芽や苗条原基等、培養組織由来のシュートを発根させた場合には、通常、育苗容器等への移植の前に、順化の過程を経る必要がある。
　［作用］
　本発明では、植物のシュートを、グルタチオンの存在下にて栽培することにより、前記シュートから発根させることができる。その理由は、以下のように推察される。
　グルタチオンは一般的には抗酸化剤として知られ、細胞中の活性酸素ストレスの低減を行うとされている。しかしながら、植物の発根に酸化還元反応が関係するとの明らかな知見は知られていない。一方、植物の発根において二酸化炭素施肥や光の効果が示されている。このことから、グルタチオンの発根促進作用には、光合成の増強作用が何らかの形で関与している可能性が高い。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
　［実施例１］
　ユーカリプタス・グロビュラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｌｏｂｕｌｕｓ、以下、単にＥ．グロビュラスと略記する。）の野生型より誘導した多芽体から、２～５ｃｍの長さに伸長した茎葉（シュート）を切取った。多芽体の誘導は、特開平８－２２８６２１号公報に示す方法に従った。すなわち、Ｅ．グロビュラス（野生型）から組織（頂芽および腋芽）を採取し、採取した組織について、有効塩素量１％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液に２０分間浸漬して表面殺菌を行った。次いで、これを滅菌水で洗浄し、固体培地（ショ糖２０ｇ重量％、ＢＡ０．２ｍｇ／Ｌ、ゲランガム２．５ｇ重量％を含むＭＳ培地）に挿し付けて芽を開じょさせた。培養開始後３～４週間目に、伸長してきた茎葉を同じ組成の培地で継代培養することにより、多芽体を形成させた。なお、多芽体からの茎葉の育成は、多芽体形成に用いた培地と同一組成の培地を用いて同一条件下で培養を維持して行った。
　得られたシュートの基部を、酸化型グルタチオン２５ｍｇ／Ｌ、銀イオン源としてＳＴＳ（ＡｇＳ4Ｏ6）５μＭ、抗酸化剤としてアスコルビン酸５０ｍｇ／Ｌ、及び植物ホルモンとしてＩＢＡ２ｍｇ／Ｌを添加した、４倍希釈ＭＳ培地（組成：硝酸アンモニウム　４１２．５ｍｇ／Ｌ、硝酸カリウム　４７５ｍｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム　４２．５２ｍｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム　０．２１ｍｇ／Ｌ、なお、本培地にグルタチオン以外の炭素源は添加されていない。）にて湿潤した発泡フェノール樹脂製多孔性支持体（スミザースオアシス社製、商品名：オアシス）に挿し付け、炭酸ガス濃度１０００ｐｐｍ、温度２５℃、６５０～６７０ｎｍの波長成分と４５０～４７０ｎｍの波長成分とを８．２：１．８の割合で含む、光合成有効光量子束密度５１．３μｍｏｌ／ｍ2／Ｓの赤色光照射下で２ヶ月間培養を行った。なお、このとき培養容器としては、最大寸法が縦１０～１１．５ｃｍ×横１０～１１．５ｃｍ×高さ１０．０ｃｍ程度の、胴部がやや張出した形状の立方体のものを用いた。この培養容器の頂面には、孔径０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン製膜（ミリポア社製、商品名：ミリシール）を貼り付けた円形開口部１個が設けられている。培養容器内の炭酸ガスの濃度は、培養容器外の炭酸ガスが培養容器の開口部の炭酸ガス透過性の膜より透過するため、培養容器の開口部の膜より透過した濃度（約１０００ｐｐｍ）であった。赤色光照射の培養容器への照射は、光照射装置として商品名：ＣＣＦＬ光源ユニット、メーカー名：日本医化器械製作所を用いて行った。また、培養容器をパラフィルムで封鎖する事により培養容器内の湿度の調整を行った。
　シュートは、この培養容器１個当たり９本を挿し付けた。シュートの供試数と、２ヶ月間培養後に発根したシュートの数（発根数）から、発根率を算出した。結果を表１に示す。
　［実施例２］
　酸化型グルタチオンの培地への添加量を５０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして培養を行った。結果を表１に示す。
　［実施例３］
　酸化型グルタチオンの培地への添加量を７５ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして培養を行った。結果を表１に示す。
　［比較例１］
　酸化型グルタチオンを培地に添加しなかった以外は、実施例１と同様にして培養を行った。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１より明らかなように、酸化型グルタチオンを２５～７５ｍｇ／Ｌ添加した発根用培地を用いた実施例１～３の発根率は５１．９．６～８５．２％と高いのに対し、発根用培地に酸化型グルタチオンを添加しなかった比較例１は発根率が２２．２％と低かった。
　［実施例４］
　挿し穂の材料として、ユーカリプタス・ユーロフィラとユーカリプタス・グランディスの雑種（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ×Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ、以下、単にＥ．ユーログランディスと略記する。）系統名：Ａを用いた。すなわち採穂母樹から、５～２０ｃｍの長さ、節が１～３節、葉が２～６葉程度に伸長した穂木を切り出し、葉の先端側約半分を切除し、挿し穂を調製した。
　支持体としては、籾殻燻炭、ココナッツ繊維、バーミキュライトの混合土を、育苗ポット（内径３ｃｍ×高さ１５ｃｍ）に予め詰めたものを用いた。酸化型グルタチオンを濃度が５０ｍｇ／Ｌとなるように水に溶解して、酸化型グルタチオン溶液を作製した。育苗ポット１つあたりの散水量を、酸化型グルタチオン溶液（５０ｍｇ／Ｌ）約８．５ｍｌとして、育苗ポット上部よりジョウロにより散水処理し、支持体に含ませた。その後、挿し穂の基部を、支持体に挿し付けた。挿し付け後は、太陽光を５０％遮光した温室にて３週間育苗を行った。温室内は、ミストを頻繁に噴霧することで高い湿度（８０％以上）を保った。３週間育苗後に発根した挿し穂の数から、発根率を算出した。結果を表２に示す。
　［実施例５］
　酸化型グルタチオン溶液として、酸化型グルタチオンの濃度が２００ｍｇ／Ｌの溶液を用いたこと以外は、実施例４と同様にして育苗を行った。結果を表２に示す。
　［実施例６］
　酸化型グルタチオン溶液として、酸化型グルタチオン濃度が５００ｍｇ／Ｌのものを用いた以外は、実施例４と同様にして育苗を行った。結果を表２に示す。
　［実施例７］
　酸化型グルタチオン溶液として、酸化型グルタチオン濃度が１０００ｍｇ／Ｌのものを用いた以外は、実施例４と同様にして育苗を行った。結果を表２に示す。
　［比較例２］
　酸化型グルタチオン溶液の散水処理をしなかった以外は、実施例４と同様にして育苗を行った。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表２より明らかなように、シュートに酸化型グルタチオンを５０～１０００ｍｇ／Ｌの濃度で含む酸化型グルタチオン溶液を散布した実施例４～７の発根率は、７２．７％～８４．１％と高いのに対し、酸化型グルタチオン溶液を散布しなかった比較例２は５６．８％と低かった。
　［実施例８］
　酸化型グルタチオンの付与を挿し穂の葉面へ添加した。すなわち、挿し穂の採穂母樹をＥ．ユーログランディス　系統名：Ｂとしたほかは、実施例５と同様にして挿し穂を調製し、実施例５と同様の支持体に挿し穂の基部を挿し付けた。酸化型グルタチオン溶液を実施例５と同様に調製し、挿し付け直後に、シュートの葉面に向けてスプレーを用いて霧状に散布した。散布量はシュート１つあたり約１．１ｍｌとした。挿し付け後の育苗条件は実施例５と同様とし、同様に発根率を算出した。結果を表３に示す。
　［実施例９］
　酸化型グルタチオン溶液として、酸化型グルタチオン濃度が５００ｍｇ／Ｌの溶液を用いたこと以外は、実施例８と同様にして育苗を行った。結果を表３に示す。
　［実施例１０］
　酸化型グルタチオン溶液として、酸化型グルタチオン濃度が１０００ｍｇ／Ｌの溶液を用いたこと以外は、実施例８と同様にして育苗を行った。結果を表３に示す。
　［比較例３］
　酸化型グルタチオン溶液の葉面への散布をしなかった以外は、実施例８と同様にして育苗を行った。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　表３より明らかなように、シュートに酸化型グルタチオン溶液２００～１０００ｍｇ／Ｌを葉面散布した実施例８～１０の発根率は５４．５％～６０．２％と高いのに対し、酸化型グルタチオンを葉面散布添加しなかった比較例３は４３．２％と低かった。
　［実施例１１］
　挿し穂の材料として、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ　Ｉｎｄｉｃａ　Ｌｉｎｎ．　品種名：アーウィン）を用いた。すなわち、採穂母樹の枝から、１～３節、１～５枚の葉を含む穂木を切り出し、葉の一部を切除した。さらに基部にカッターによる傷付けを行い、挿し穂の調製をした。
　得られたシュートを、一晩流水処理し、コテツなどの殺虫剤溶液に浸漬した後、酸化型グルタチオン５０ｍｇ／Ｌ、銀イオン源としてＳＴＳ（ＡｇＳ4Ｏ6）５μＭ、抗酸化剤としてアスコルビン酸５０ｍｇ／Ｌ、及び植物ホルモンとしてＩＢＡ１０ｍｇ／Ｌを添加した、４倍希釈ＭＳ培地（組成：硝酸アンモニウム　４１２．５ｍｇ／Ｌ、硝酸カリウム　４７５ｍｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム　４２．５２ｍｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム　０．２１ｍｇ／Ｌなど、なお、本培地にグルタチオン以外の炭素源は添加されていない。）にて湿潤した支持体に挿し付けた。ここで、支持体としては、砂、赤玉土等の自然土壌；バーミキュライト、パーライト、ピートモスなどの混合土を用いた。挿し付け後は炭酸ガス濃度１０００ｐｐｍ、温度２５℃、湿度６０％、６５０～６７０ｎｍの波長成分と４５０～４７０ｎｍの波長成分とを８．２：１．８の割合で含む、光合成有効光量子束密度５１．３μｍｏｌ／ｍ2／Ｓの赤色光照射下で１．５ヶ月間培養を行った。
　なお、このとき培養容器としては、最大寸法が縦２０～２２ｃｍ×横３３～３７ｃｍ×高さ１５～１７ｃｍ程度の、直方体のものを用いた。この培養容器の頂面には、孔径０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン製膜（ミリポア社製、商品名：ミリシール）を貼り付けた円形開口部１０個が設けられている。培養容器内の炭酸ガスの濃度は、培養容器の開口部の膜により調整して制御した。培養容器内の炭酸ガスの濃度は、培養容器外の炭酸ガスが培養容器の開口部の炭酸ガス透過性の膜より透過するため、培養容器の開口部の膜より透過した濃度（約１０００ｐｐｍ）であった。赤色光照射の培養容器への照射は、光照射装置として商品名：ＣＣＦＬ光源ユニット、メーカー名：日本医化機器製作所を用いて行った。また、培養容器をパラフィルムで封鎖する事により、培養容器内の湿度は約１００％であった。
　シュートは、この培養容器１個当たり１０～２０本を挿し付けた。シュートの供試数と、１．５ヶ月間培養後に発根したシュートの数（発根数）から、発根率を算出した。結果を表４に示す。
　［比較例４］
　酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１１と同様にして培養を行った。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　表４より明らかなように、培地に酸化型グルタチオンを５０ｍｇ／Ｌ添加した実施例１１では発根率が２６．９％であったのに対し、酸化型グルタチオンを添加しなかった比較例４の発根率は１９．２％と低かった。
　［実施例１２］
　酸化型グルタチオンの与え方として、１％粒剤を混合土に混ぜ込んで使用した。すなわち、ピートモス、バーミキュライトの混合土５．５Ｌに対し、酸化型グルタチオン１％粒剤を１５ｇ混ぜ込み、それを育苗ポット（内径３ｃｍ×高さ１５ｃｍ×６６穴）に詰め、支持体とした。この育苗ポット上部より、植物ホルモンとして、ＩＢＡ１０ｍｇ／Ｌを添加した４倍希釈ＭＳ培地（組成：硝酸アンモニウム４１２．５ｍｇ／Ｌ、硝酸カリウム　４７５ｍｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム　４２．５２ｍｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム　０．２１ｍｇ／Ｌ、なお、本培地に炭素源は添加されていない。）をジョウロにより散水処理し、支持体に含ませた。
　挿し穂の材料として、チャを用いた。すわなち、採穂母樹から、５ｃｍ～２０ｃｍの長さ、節が１～３節、葉が１～６枚程度に伸長した穂木を切り出し、葉の先端側半分を切除し、挿し穂を調整調製した。
　調整調製した挿し穂の基部を支持体に挿し付けた（育苗ポット１個当たり６６本挿し付けた）。挿し付け後は炭酸ガス濃度１０００ｐｐｍ、温度２５℃、湿度６０％、６５０～６７０ｎｍの波長成分と４５０～４７０ｎｍの波長成分とを８．２：１．８の割合で含む、光合成有効光量子束密度５１．３μｍｏｌ／ｍ２／Ｓの赤色光照射下で１．５ヶ月間培養を行った。その後、育苗ポットを温室に移動し、２．５ヶ月育苗した。温室内は、ミストを頻繁に噴霧することで高い湿度（８０％以上）を保った。２．５ヶ月育苗後に発根した挿し穂の数から、発根率を算出した。結果を表５に示す。
　［実施例１３］
　酸化型グルタチオン１％粒剤の混合土（５．５Ｌ）への添加量を７５ｇとした以外は、実施例１２と同様にして培養を行った。結果を表５に示す。
　［比較例５］
　酸化型グルタチオン１％粒剤を培地に添加しなかった以外は、実施例１２と同様にして培養を行った。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　表５より明らかなように、シュートに酸化型グルタチオン粒剤を３～１５ｍｇ／Ｌの濃度で混合土に混ぜ込んだ実施例１１～１２の発根率は９６．０％～９９．６％と高いのに対し、酸化型グルタチオン粒剤を混ぜ込まなかった比較例５は６２．１％と低かった。
　［実施例１４］
　遺伝子組換えＥ．グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ　Ｂ）を用い、さらに、シュート基部にハサミによる傷を付けた以外は、実施例１と同様にして培養を行った。なお、傷付けは、シュートの基部（上述の切断面）を正面方向から見た際に十字型となるよう、直行する２方向にハサミを入れて行った。結果を表６に示す。
　［実施例１５］
　酸化型グルタチオンの培地への添加量を７５ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１４と同様にして培養を行った。結果を表６に示す。
　［比較例６］
　酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１４と同様にして培養を行った。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　表６より明らかなように、培地に酸化型グルタチオンを２５～７５ｍｇ／Ｌ添加した実施例１４～１５の発根率は７７．８％～８８．９％と高いのに対し、酸化型グルタチオンを添加しなかった比較例６の発根率は２２．２％と低かった。
　［実施例１６］
　遺伝子組換えＥ．グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ　Ｃ）のシュートを用い、酸化型グルタチオンの培地への添加量を５０ｍｇ／Ｌとし、さらに、シュート基部にハサミによる傷を付けた以外は、実施例１と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。
　［実施例１７］
　遺伝子組換えＥ・グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ　Ｄ）のシュートを用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。
　［実施例１８］
　遺伝子組換えＥ・グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ　Ｅ）のシュートを用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。
　［実施例１９］
　Ｅ・グロビュラス（野生型Ｆ）のシュートを用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。
　［比較例７］
　酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。
　［比較例８］
　酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１７と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。
　［比較例９］
　酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１８と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。
　［比較例１０］
　酸化型グルタチオンを添加しなかった以外は、実施例１９と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　表７より明らかなように、培地に酸化型グルタチオンを５０ｍｇ／Ｌ添加した実施例１６～１９の発根率は８８．９～１００％と高いのに対し、酸化型グルタチオンを添加しなかった比較例７～１０の発根率は１１．１～５３．１％と低かった。
　［実施例２０］
　材料として発根が非常に難しいことが明らかである遺伝子組換えＥ．グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ　Ｇ）を用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。
　［実施例２１］
　材料として発根が非常に難しいことが明らかである遺伝子組換えＥ．グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ　Ｈ）を用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。
　［実施例２２］
　材料として発根が非常に難しいことが明らかである遺伝子組換えＥ．グロビュラス（系統名：Ｃｌｏｎｅ　Ｉ）を用いた以外は、実施例１６と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。
　［比較例１１］
　酸化型グルタチオンを添加せず、シュート基部への傷つけをしなかった以外は、実施例２０と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。
　［比較例１２］
　酸化型グルタチオンを添加せず、シュート基部への傷つけをしなかった以外は、実施例２１と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。
　［比較例１３］
　酸化型グルタチオンを添加せず、シュート基部への傷つけをしなかった以外は、実施例２２と同様にして培養を行った。結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　表８より明らかなように、酸化型グルタチオンを添加せず、シュート基部への傷つけをしなかった比較例１１～１３では全く発根しなかったのに対し、培地に酸化型グルタチオンを５０ｍｇ／Ｌ添加した実施例２０～２２の発根率は２０．０～４０．０％と向上した。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　本発明を用いれば、植物のシュートからクローン苗の大量かつ迅速な生産が可能となり、その産業的利用に道を開くことが期待される。

Claims (26)

  1. 　植物のシュートをグルタチオンの存在下にて栽培する工程を包含する、クローン苗の生産方法。
  2. 　前記工程は、グルタチオンを含む培地を用いて行われる、請求項１に記載の生産方法。
  3. 　前記培地のグルタチオン濃度は、１ｍｇ／Ｌ～５０００ｍｇ／Ｌの範囲内である、請求項２に記載の生産方法。
  4. 　前記培地は、グルタチオン以外の炭素源を含まない、請求項２または３に記載の生産方法。
  5. 　前記工程は、グルタチオンを含む溶液を植物のシュートに接触させることによって行われる、請求項１に記載の生産方法。
  6. 　前記溶液のグルタチオン濃度は、１ｍｇ／Ｌ～５０００ｍｇ／Ｌの範囲内である、請求項５に記載の生産方法。
  7. 　前記グルタチオンが、酸化型グルタチオンである、請求項１～６のいずれか１項に記載の生産方法。
  8. 　前記植物が難発根性である、請求項１～７のいずれか１項に記載の生産方法。
  9. 　前記植物がユーカリ属植物である、請求項８に記載の生産方法。
  10. 　前記工程は、６５０～６７０ｎｍの波長成分と４５０～４７０ｎｍの波長成分とを９：１～７：３の割合で含む光照射下で行われる、請求項１～９のいずれか１項に記載の生産方法。
  11. 　前記工程は、炭酸ガスを供給しながら行われる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の生産方法。
  12. 　前記炭酸ガスの供給量は、３００～２０００ｐｐｍである、請求項１１に記載の生産方法。
  13. 　前記工程は、湿度８０％以上の条件下で行われる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の生産方法。
  14. 　基部に傷をつけられたシュートを用いて行われる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の生産方法。
  15. 　前記シュートが、挿し穂、または母本植物から採取した器官を無菌的に培養することにより得た多芽体、もしくは該器官を無菌的に育成して得た茎葉である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の生産方法。
  16. 　グルタチオンを含有する、植物のシュートから発根させるための組成物。
  17. 　培地として用いるための、請求項１６に記載の組成物。
  18. 　１ｍｇ／Ｌ～５０００ｍｇ／Ｌの範囲内のグルタチオンを含有する、請求項１７に記載の組成物。
  19. 　１ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌの範囲内のグルタチオンを含有する、請求項１７に記載の組成物。
  20. 　培地または溶液に混合される補助剤として用いるための、請求項１６に記載の組成物。
  21. 　混合後の培地中または溶液中にて、１ｍｇ／Ｌ～５０００ｍｇ／Ｌの範囲内のグルタチオンの最終濃度を提供する、請求項２０に記載の組成物。
  22. 　混合後の培地中または溶液中にて、１ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌの範囲内のグルタチオンの最終濃度を提供する、請求項２０に記載の組成物。
  23. 　錠剤、散剤または顆粒剤の形態である、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 　植物の無性繁殖を行うための、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 　前記グルタチオンが、酸化型グルタチオンである、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 　窒素、リンおよびカリウムを必須元素として含み、かつ、グルタチオン以外の炭素源を含まない、請求項１７～２５のいずれか１項に記載の組成物。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103314765A (zh) * 2013-07-09 2013-09-25 句容市林场 一种宝华玉兰种苗繁殖方法
JP2013189378A (ja) * 2012-03-12 2013-09-26 Hiroshi Kabasawa 動植物生体用活性水溶液の製造方法及び装置
CN104054501A (zh) * 2014-07-15 2014-09-24 广西壮族自治区林业科学研究院 一种闽楠扦插繁殖方法
CN106508360A (zh) * 2016-10-25 2017-03-22 潘克稳 一种紫心火龙果的种植方法
JP2018121590A (ja) * 2017-02-02 2018-08-09 昭和電工株式会社 人工光による育苗方法
US10662124B2 (en) 2015-07-03 2020-05-26 Kaneka Corporation Fertilizer composition containing oxidized glutathione and fertilizer element for foliar application

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101557709B (zh) 2006-12-11 2016-01-27 国立研究开发法人科学技术振兴机构 植物生长调整剂及其利用
WO2013088956A1 (ja) * 2011-12-12 2013-06-20 岡山県 植物のアミノ酸含量を高めるための化合物およびその利用
NO2923561T3 (ja) * 2014-03-28 2018-04-14
DK3527067T3 (da) * 2016-10-14 2021-08-09 Sunshine Horticulture Co Ltd Fremgangsmåde til dyrkning af plante i gennemsigtig forseglet beholder
CN110235786B (zh) * 2019-07-19 2022-03-25 南京林业大学 一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004267044A (ja) * 2003-03-06 2004-09-30 Mitsubishi Paper Mills Ltd ユーカリ属植物の形質転換方法
JP2005110506A (ja) * 2003-10-02 2005-04-28 Bridgestone Corp 組織培養によるパラゴムノキ精英樹の大量増殖法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5211738A (en) 1991-04-12 1993-05-18 Mitsubishi Gas Chemical Co., Inc. Adenine derivatives and their use as a plant growth regulator
JPH089523B2 (ja) * 1991-10-31 1996-01-31 三菱瓦斯化学株式会社 植物の発根促進剤
US5643853A (en) * 1995-02-28 1997-07-01 Purdue Research Foundation Thiol activation of cytotoxic and auxin-herbicidal agents and root formation stimulation
JPH08228621A (ja) 1995-03-02 1996-09-10 Nippon Paper Ind Co Ltd 組織培養苗の効率的作出方法
JP4817397B2 (ja) 2000-04-25 2011-11-16 岡山県 細胞または器官の分化調節剤およびそれを用いる形態形成の調節法
WO2001080638A1 (fr) 2000-04-25 2001-11-01 Okayama Prefecture Systemes de commande de differenciation des cellules ou des organes et procede de commande de morphogenese mettant en oeuvre lesdits systemes de commande
JP2001346464A (ja) 2000-06-07 2001-12-18 Nippon Paper Industries Co Ltd 生長抑制用培地及びこれを用いたクローン苗の生産方法
JP4329410B2 (ja) 2003-05-30 2009-09-09 岡山県 植物生長調整補助剤及び該植物生長調整補助剤を使用した再分化植物体の作製方法
JP4661178B2 (ja) 2004-11-17 2011-03-30 日本製紙株式会社 植物体の生産方法
CN101557709B (zh) 2006-12-11 2016-01-27 国立研究开发法人科学技术振兴机构 植物生长调整剂及其利用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004267044A (ja) * 2003-03-06 2004-09-30 Mitsubishi Paper Mills Ltd ユーカリ属植物の形質転換方法
JP2005110506A (ja) * 2003-10-02 2005-04-28 Bridgestone Corp 組織培養によるパラゴムノキ精英樹の大量増殖法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BELMONTE M.F. ET AL: "Alterations of the glutathione redox state improve apical meristem structure and somatic embryo quality in white spruce (Picea glauca)", J EXP BOT., vol. 56, no. 419, September 2005 (2005-09-01), pages 2355 - 2364 *
BELMONTE M.F. ET AL: "Glutathione-induced growth of embryogenic tissue of white spruce correlates with chages in pyrimidine nucleotide metabolism", PLANT SCIENCE, vol. 168, 2005, pages 803 - 812 *
IMIN N. ET AL: "Factors involved in root formation in Medicago truncatula", J EXP BOT., vol. 58, no. 3, 2007, pages 439 - 451 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013189378A (ja) * 2012-03-12 2013-09-26 Hiroshi Kabasawa 動植物生体用活性水溶液の製造方法及び装置
CN103314765A (zh) * 2013-07-09 2013-09-25 句容市林场 一种宝华玉兰种苗繁殖方法
CN104054501A (zh) * 2014-07-15 2014-09-24 广西壮族自治区林业科学研究院 一种闽楠扦插繁殖方法
US10662124B2 (en) 2015-07-03 2020-05-26 Kaneka Corporation Fertilizer composition containing oxidized glutathione and fertilizer element for foliar application
CN106508360A (zh) * 2016-10-25 2017-03-22 潘克稳 一种紫心火龙果的种植方法
JP2018121590A (ja) * 2017-02-02 2018-08-09 昭和電工株式会社 人工光による育苗方法

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