CN110235786B - 一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法 - Google Patents
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，属于植物组织培养技术领域。包括以下步骤：1)‘黄油果’海棠种子消毒；2)不定芽的诱导培养；3)不定芽的伸长培养；4)生根培养；得到生根的幼苗。本发明结合‘黄油果’海棠的生长特点，诱导过程中，在培养基中添加了合适含量的分裂素和生长素，针对性诱导‘黄油果’海棠种胚形成不定芽，增殖系数高达12。该方法操作简单，生产成本低，诱导率和增殖系数高，可以通过单粒种子诱导多棵植株，缩短育种周期，培育大量无性系植株，为‘黄油果’海棠繁育和产业化生产奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法。
背景技术
‘黄油果’海棠为苹果属海棠，其花量大，单瓣、花瓣卵圆形花序伞形，花径3-3.5cm，萼筒密被毛，花粉白，果量大，果皮果肉皆为黄色，果皮无光泽，叶背有毛。‘黄油果’以花量大、果量大，果皮黄色为主要观赏特性，在园林绿化中有较高的应用和观赏价值。
‘黄油果’海棠的常规繁殖方法是播种繁殖，但种子细小，发芽率较低，繁殖量有限，而扦插、分株等其它繁殖方法也鲜见报道。所以中华野海棠种苗生产不能满足市场需求。
通过组织培养快速繁殖技术，可获得优质整齐的种苗，为多种植物的快速繁殖开辟了一条有效途径。但目前关于‘黄油果’海棠组织培养未见报道。
发明内容
发明目的：针对技术的不足，本发明的目的是提供一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，该方法操作简单，生产成本低，诱导率和增殖系数高，可以通过单粒种子诱导多棵植株，缩短育种周期，培育大量无性系植株。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚接入诱导培养基上，诱导培养基为：1/2MS+0-1.5mg/L 6-BA+0-0.2mg/L TDZ+0-0.4mg/L KT+0.1-0.2mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2；
3)不定芽的伸长培养
将步骤2)得到的不定芽接入伸长培养基上，伸长培养基为：MS+0.5-1.5mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2；
4)生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月，得到生根的幼苗。
步骤1)中‘黄油果’海棠种子的消毒步骤为：使用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分。
步骤2)中诱导培养基为：1/2MS+0.2mg/L TDZ+0.4mg/L KT+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2。
步骤2)中培养条件为暗培养0-25天后，转光培养20-45天，光照强度1200lx，时长16h/d。
步骤2)中培养条件为暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d。
步骤3)中伸长培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2。
步骤3)中培养条件为暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d。
将步骤4)中装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
有益效果：与现有技术相比，本发明通过对‘黄油果’海棠种子消毒，诱导培养形成不定芽，在此基础上伸长培养和生根培养，得到生根的幼苗。本发明结合‘黄油果’海棠的生长特点，诱导过程中，在培养基中添加了合适含量的分裂素和生长素，针对性诱导‘黄油果’海棠种胚形成不定芽，增殖系数高达12，伸长培养芽长增长高达36mm。该方法操作简单，生产成本低，诱导率和增殖系数高，可以通过单粒种子诱导多棵植株，缩短育种周期，培育大量无性系植株。
附图说明
图1是‘黄油果’胚刚接入组培瓶内图；
图2是‘黄油果’胚培养15天后状态图；
图3是‘黄油果’胚培养诱导不定芽图；
图4是‘黄油果’不定芽伸长生长图；
图5是‘黄油果’不定芽生根图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
以下实施例所使用的主要供试材料为：于10月份采摘江都市仙女镇的南京林业大学海棠种质资源圃中的‘黄油果’这一海棠品种，将海棠果去除外种皮洗净，晾干后放入冰箱4℃沙藏30天。
实施例1
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基上(图1，图2，图3)，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；诱导培养基为：1/2MS+1mg/L 6-BA+0mg/L TDZ+0mg/L KT+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，诱导系数为2.5；
3)不定芽的伸长培养
将从胚诱导出来的不定芽接入伸长培养基上(图4)，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；伸长培养基为：MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，芽长增长33.40±1.83mm；
4)生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基(图5)：1/2MS+0.5mg/LIBA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月；
5)炼苗
生根培养2个月后，将装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
实施例2
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；诱导培养基为：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0mg/L TDZ+0mg/L KT+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，诱导系数为1.75；
3)不定芽的伸长培养
将从胚诱导出来的不定芽接入伸长培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；伸长培养基为：MS+1mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，芽长增长24.02±9.11mm；
4)生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月；
5)炼苗
生根培养2个月后，将装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
实施例3
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；诱导培养基为：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0mg/L TDZ+0mg/L KT+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，诱导系数为1.5；
3)不定芽的伸长培养
将从胚诱导出来的不定芽接入伸长培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；伸长培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，芽长增长27.41±5.62mm；
4)生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月；
5)炼苗
生根培养2个月后，将装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
实施例4
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d诱导培养基为：1/2MS+0mg/L6-BA+0.2mg/L TDZ+0.4mg/L KT+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，诱导系数为12.83；
3)不定芽的伸长培养
将从胚诱导出来的不定芽接入伸长培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度12001x，时长16h/d；伸长培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，芽长增长26.31±5.05mm；
4)生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月；
5)炼苗
生根培养2个月后，将装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
实施例5
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；诱导培养基为：1/2MS+0mg/L6-BA+0.2mg/L TDZ+0.4mg/L KT+0.1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，诱导系数为9.14；
3)不定芽的伸长培养
将从胚诱导出来的不定芽接入伸长培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度12001x，时长16h/d；伸长培养基为：MS+1mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，芽长增长24.70±8.28mm；
4)生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月；
5)炼苗
生根培养2个月后，将装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
实施例6
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；诱导培养基为：1/2MS+0mg/L6-BA+0.1mg/L TDZ+0.4mg/L KT+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，诱导系数为3.78。
3)不定芽的伸长培养
将从胚诱导出来的不定芽接入伸长培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；伸长培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，芽长增长20.87±2.87mm；
4)生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月；
5)炼苗
生根培养2个月后，将装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
实施例7
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；诱导培养基为：1/2MS+0mg/L6-BA+0.05mg/L TDZ+0.4mg/L KT+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，诱导系数为4.1；
3)不定芽的伸长培养
将从胚诱导出来的不定芽接入伸长培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；伸长培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，芽长增长36.87±8.96mm；
4)生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基：1/2MS+0.5mg/LIBA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月；
5)炼苗
生根培养2个月后，将装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
实施例8
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；诱导培养基为：1/2MS+0mg/L6-BA+0.2mg/L TDZ+0.4mg/L KT+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，诱导系数为12.83；
3)不定芽的伸长培养
将从胚诱导出来的不定芽接入伸长培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；伸长培养基为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，芽长增长23.52±6.49mm；
4)生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月；
5)炼苗
生根培养2个月后，将装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
实施例9
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；诱导培养基为：1/2MS+0mg/L 6-BA+0.2mg/L TDZ+0.4mg/L KT+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，诱导系数为12.83；
3)不定芽的伸长培养
将从胚诱导出来的不定芽接入伸长培养基上，暗培养25天后，转光培养20天，光照强度1200lx，时长16h/d；伸长培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2，芽长增长19.34±6.86mm；
4)生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月；
5)炼苗
生根培养2个月后，将装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
对比例1：
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基上，以1mg/L6-BA为分裂素，以0.2mg/LNAA为生长素，只改变基本培养基，不同基本培养基对海棠芽诱导影响的结果如表1所示，‘黄油果’胚培养最优基本培养基为1/2MS。
表1不同基本培养基对海棠芽诱导影响
| 培养基 | 诱导率/％ | 增殖系数 |
| WPM+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA | 92 | 4.174 |
| MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA | 75.76 | 1.8 |
| 1/2MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA | 90 | 5.22 |
对比例2：
一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)‘黄油果’海棠种子消毒
将‘黄油果’海棠种子用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分；
2)不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚灭菌后接入诱导培养基1/2MS+1mg/L6-BA+0.2mg/LNAA上，设置不同的暗培养时间，观察不同暗培养天数对种子发芽及诱导的影响。结果如表2所示，暗培养5天与暗培养25天，其不定芽诱导系数分别为4.3和4.7，在生产中，为了减少成本，可使用暗培养5天的处理。在本实施例中选取暗培养25天，诱导系数较高。
表2不同暗培养时间对种子胚诱导影响
| 编号 | 暗培养时间/d | 光培养时间/d | 诱导率/％ | 增殖系数 |
| 1 | 0 | 45 | 81.82 | 3.3 |
| 2 | 5 | 40 | 90 | 4.3 |
| 3 | 15 | 30 | 80 | 3 |
| 4 | 25 | 20 | 92.31 | 4.7 |
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）‘黄油果’海棠种子消毒；
2）不定芽的诱导培养
消毒后的海棠种子剥去外种皮，将胚接入诱导培养基上，所述诱导培养基为：1/2MS+0.2mg/L TDZ+0.4mg/L KT+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L 蔗糖，pH为5.8±0.2；培养条件为暗培养25天后，转光培养20-45天，光照强度1200lx，时长16h/d；
3）不定芽的伸长培养
将步骤2）得到的不定芽接入伸长培养基上，所述伸长培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L 蔗糖，pH为5.8±0.2；培养条件为暗培养25天后，转光培养20-45天，光照强度1200lx，时长16h/d；
4）生根培养
将生长健壮，长度超过2cm的不定芽转入生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+7g/L琼脂+30g/L 蔗糖，pH为5.8±0.2内，培养2个月，得到生根的幼苗。
2.根据权利要求1所述的‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，其特征在于，步骤1）中‘黄油果’海棠种子的消毒步骤为：使用75%酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25%次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分。
3.根据权利要求1所述的‘黄油果’海棠的组培快速繁殖方法，其特征在于，将步骤4）中装有生根幼苗的培养瓶放入玻璃温室内，太阳光照强时，使用遮阳网进行遮荫，数天后，将瓶盖打开，放置3-5天，洗去无菌苗根部培养基，蘸过泥浆后，将组培苗栽入灭过菌或浇过多菌灵的基质内，控制外界温度及湿度进行培育。
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