CN102459572A

CN102459572A - 银杏科的形成层来源的植物干细胞及其分离方法

Info

Publication number: CN102459572A
Application number: CN2010800289223A
Authority: CN
Inventors: 洪湳周; 陈荣雨; 李银庆; 洪宣美
Original assignee: UNWHA BIOTECH CORP
Current assignee: Shenzhen Luquan Industrial Co ltd
Priority date: 2009-05-26
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2030-05-26
Also published as: EP2436758A2; RU2011152868A; CN102459572B; WO2010137878A2; KR101141166B1; WO2010137878A9; WO2010137878A3; JP2012527889A; KR20100127724A

Abstract

本发明涉及银杏科(family Gingkoaceae)的形成层来源的干细胞及其分离方法。根据本发明的银杏科的形成层来源的干细胞无脱分化过程地分离成未分化状态，从而在长期培养时也细胞生长率与生长模式无变异地稳定地被维持而可大量培养，从而有用。此外，测定根据本发明的银杏科的形成层来源的干细胞的由氧化剂处理而发生的自由基消除能力的结果，呈现为与以往的合成抗氧化剂类似，或具有更高的抗氧化效果，从而可作为优秀的抗氧化用组合物有用地被使用。

Description

银杏科的形成层来源的植物干细胞及其分离方法

【技术领域】

本发明涉及银杏科(family Gingkoaceae)的形成层来源的干细胞及其分离方法。

【背景技术】

植物过去意味着粮食资源，但现在则是包括药剂，香料，色素，农药，颜料等的广谱的化学物质的供给原，其含义被扩大。尤其，植物来源的有用物质的大部分有抗病毒，抗细菌，抗癌，抗氧化能力等的生理活性，作为可发展为新药品的理想的资源而受到瞩目，且为弄清多种植物来源的物质的化学结构与活性之间的关系的研究正活泼地进行。

但是，生理活性物质开发为药品困难是实情，且其为主的理由如下。第一，植物内生理活性物质的含量极其有限。第二，植物的生长速度非常慢。第三，植物来源的生理活性物质只在植物的特定器官内少量存在。第四，牵涉被称为自然毁损的环境问题。第五，植物来源的生理活性物质的情况中，化学的结构非常复杂，要求多阶段聚合过程而有生产费用非常高的经济上的问题。从而，将植物来源的生理活性物质商业性地稳定地供给非常困难。

然而，作为生物工程学技术之一的植物细胞培养方法不诱发环境问题，且长期被评价为可稳定地供给植物来源的有用物质的，最理想的技术。根据韩国公开专利1995-0000870(1995.01.03)，由植物细胞培养的有用物质的生产与从植物直接提取的方法相比有多种优点。尤其，与以往的提取法不同，不受外部环境的影响，也可持续性的生产，被认为是可解决如生态系统破坏的明显问题等的最适的方法。但是，尽管也有对于植物细胞培养的大量关心与努力，产业化成功的例到现在还极其少。这是因为，在多种植物细胞培养中，细胞增殖与生产性的变异仍主要是问题。

在植物表达系统中利用植物细胞的情况中，植物细胞的分化组织，例如叶，茎，种子等由于是丧失分裂能力的永久组织，所以为使转变为具有分裂能力的细胞系而必需先进行脱分化过程。所述脱分化过程是指，利用植物体的一种组织或器官培养时，解除组织或细胞的已经为施行特定功能而分化的状态。但是，这样的脱分化过程中由染色体变异而可发生细胞系的严重的变异。

尤其，通过植物细胞培养的有用物质的生产只有在长期的培养期间稳定地维持快的细胞增殖与高的代谢物质生产能力才可产业化，但大部分的细胞系由传代培养而遭遇与本来不同的大量的变异。从而，为克服这样的变异问题，在通过植物细胞培养的有用物质生产中获得遗传稳定的细胞系的方案是切实的实情。

对此，本发明人中部分开发有只利用从植物的茎采集的形成层而诱导愈伤组织的方法(韩国注册专利第0533120号)，但此注册专利仅是简单地利用木本植物的茎形成层诱导了愈伤组织。愈伤组织(callus)是脱分化发生而形成的组织，对此所述注册专利仍有由脱分化的变异问题的问题。另外，本发明人中部分作为解决由脱分化的变异的问题，并可稳定地增殖的遗传稳定性高的细胞系的提供方法，开发有国际专利申请PCT/KR2006/001544号的发明。但是，属于落叶乔木的银杏作为有用植物广泛地被知，由此仍然需要获得解决由脱分化的变异的问题，并可稳定地增殖的遗传稳定性高的细胞系。

对此本发明人分离了银杏科植物的形成层来源的干细胞，为了提供有用的植物细胞系而锐意研究的结果，分离银杏科植物的形成层来源的干细胞，并稳定地增殖所述干细胞，并确认培养时无变异，从而完成了本发明。

【发明概述】

本发明的目的在无脱分化过程地提供银杏科的形成层来源的干细胞及其分离方法。

为达成所述目的，本发明提供银杏科的形成层来源的干细胞，其特征在于，源于银杏科(family Gingkoaceae)的形成层，且是不经脱分化的先天性的未分化细胞。

本发明另外提供，银杏科(family Gingkoaceae)的形成层来源的干细胞的分离方法，包括下列步骤：

(a)从银杏科植物收获含有形成层的组织的步骤；

(b)将所述收获的含有形成层的组织在培养基中培养的步骤；及

(c)从所述形成层分离细胞，从而收获形成层来源的干细胞的步骤。

本发明另外提供抗氧化用组合物，其含有：所述银杏科的形成层来源的干细胞，其提取物，其破碎物及其培养物中任一种以上。

本发明另外提供抗氧化用功能性食品，其含有：所述银杏科的形成层来源的干细胞，其提取物，其破碎物及其培养物中任一种以上。

本发明的别的特征及实施方式将通过以下详述及随附的专利权利要求书而更加明晰。

【附图说明】

图1是从材料植物(银杏)的横断面观察形成层的照片。

图2作为根据本发明的干细胞的诱导及分离照片，而2A是呈现干细胞(箭标)与韧皮部(phloem)细胞(星号)的极其不同的形态的照片，并2B是分离干细胞之后培养3周后的照片。

图3是根据本发明的干细胞(A)及银杏的树皮外植体诱导愈伤组织(B)的固体培养时照片。

图4是观察在本培养过程的干细胞(A)及银杏的树皮组织中诱导的愈伤组织(B)的细胞凝集程度的显微镜照片(×100)。

图5是根据本发明的干细胞(B)及银杏体细胞(B)的显微镜照片，左侧下端的标尺是25μm。

图6是利用Neutral red染色液泡后观察的在根据本发明的干细胞(A)及银杏树皮组织中诱导的愈伤组织(B)的显微镜照片，而右侧下端的标尺是25μm。

图7是观察在根据本发明的干细胞(A)及银杏树皮组织中诱导的愈伤组织(B)的线粒体的照片。

图8是示根据本发明的干细胞的在生物反应器中的细胞生长曲线的坐标图。

图9是示在根据本发明的干细胞(Stem cell)及银杏树皮组织中诱导的愈伤组织(callus)的生长速度比的坐标图。

图10是示在3L气升式生物反应器(A)，20L气升式生物反应器(B)及250L气升式生物反应器(C)中培养10天的结果的照片。

图11是示在根据本发明的干细胞(Stem cell)及银杏树皮组织中诱导的愈伤组织(callus)的冷冻保存后细胞生存率的坐标图。

图12是呈现处理根据本发明的干细胞提取物(GG-E)及诱发剂而培养的培养物的提取物(GP-E)的依浓度自由基消除能力的坐标图。

【发明详述及具体的实施方式】

只要不以不同的方式定义，在本说明书中使用的全部技术性的及科学的术语具有与由本发明所属的技术领域中熟练的专家常规地理解相同的含义。一般情况下，在本说明书中使用的命名法在本技术领域中良好已知，并常规地被使用。

在本发明详述等中使用的主要术语的定义如下。

在本申请中，维管束“形成层”是位于植物的维管束组织(vascular tissue)内的侧生分生组织而位于茎与根。由形成层的活动而发生植物的加厚生长，且其结果便可存在具有11,000年以上的年轮的巨大植物体。从发生学来看，由于维管束形成层起源于前形成层，所以是维持着分生组织的连续性，并渐进性地分化的相同分生组织，仅为了方便而加以区别(植物形态学，LeeZaedu外7人共著，学院书籍，第10章，1993)，对于本发明而言，形成层被解释为包括前形成层。这样的形成层与前形成层作为相同的初生分生组织，对于本发明而言，明晰使用形成层及前形成层组织而得到相同的效果。

在本申请中植物“干细胞”(Stem cell)是指不经脱分化过程而在遗传上更加稳定的先天性的未分化细胞。

在本申请中“破碎物”是指将细胞用利用去污剂等的化学的方法或物理性的方法等破碎而得到的细胞裂解物，且细胞系的″提取物″是将细胞溶解于溶剂而分离的物质，而可利用蒸馏或蒸发浓缩。另外，细胞系″培养液″是指培养细胞之后，将细胞除去而留下的细胞培养溶液。额外地，在本申请中″培养物″是包括培养液和/或培养的细胞系的物质，此时培养的细胞系是全部包括由培养条件分化，或有用物质的生产能力和/或分泌能力提高的细胞系的概念。

在本申请中″先天性的未分化状态(innately undifferentiated)″是指不是经脱分化过程而以未分化状态存在的，本来就维持分化前状态的状态。

在本申请中″愈伤组织″是指通过脱分化过程而成为不分化的状态的细胞或细胞块(PNAS，99(25)：15843，2002)。

根据本发明的一个观点，作为涉及银杏科的形成层来源的干细胞，而这来源于银杏科的形成层，且是不经脱分化的先天性的未分化细胞。

使用作为已经分化的组织的叶或茎，根部分的情况中，为形成愈伤组织，则应经从分化的组织返回未分化组织(rejuvenilation)的脱分化(dedifferentiation)过程，然而在此脱分化过程中在体细胞出现突变而成细胞不稳定性的原因。对此本发明人在研究几乎无体细胞变异的植物细胞系统时，只在作为分生组织的形成层中特异性地诱导细胞系的情况中，着眼于由于可不经脱分化而使用分生组织自身具有的旺盛的分裂能力，所以无体细胞变异而遗传稳定性高，并可诱导生理上均一的细胞系的点，由此分离了形成层来源的干细胞。

根据本发明的银杏科的形成层来源的干细胞可以具有下列中至少一个特性作为特征：

(a)悬浮培养时与银杏科的脱分化的愈伤组织相比而包括大量的单细胞，或包括小尺寸的细胞集合体；

(b)示具有多个液泡(vacuole)的形态学的特征；

(c)与银杏科的脱分化的愈伤组织相比而具有活性增加的线粒体；

(d)与银杏科的脱分化的愈伤组织相比而生长速度更快，并可长期生长；及

(e)与银杏科的脱分化的愈伤组织相比而在生物反应器中对于剪切应力(shear stress)具有更低的敏感性。

此时，具有″多个液泡″是指与银杏科的脱分化的愈伤组织等比较而具有2倍以上的多个液泡。此外，根据本发明的干细胞与银杏科的愈伤组织等比较而具有尺寸小的液泡。此外，具有″多个发达的形态的线粒体″是指与银杏科的脱分化的愈伤组织比较而具有2倍以上的多个在显微镜下活泼地运动的线粒体。

对于本发明而言，所述干细胞可以具有所述(a)～(e)的特性中至少两个以上的特性作为特征，且优选可以具有所述(a)～(e)的特性中至少三个以上的特性作为特征，且更优选可以具有所述(a)～(e)的特性中至少4个以上的特性作为特征。此外，对于本发明而言，所述干细胞可以具有(a)～(e)的特性之全部作为特征。

此外，诱导银杏科形成层来源的干细胞的分化而确认了具有可分化为导管元件(tracheary elements)的分化能力。构成植物干细胞的特征的特性中在自我再生能力(self renewal)以外有分化能力(pluripotency)，由此确认了根据本发明的银杏科形成层来源的细胞是干细胞。

另一方面，根据本发明的干细胞可由包括(a)从银杏科植物收获含有形成层的组织的步骤；(b)将所述收获的含有形成层的组织在培养基中培养的步骤；及(c)从所述形成层分离细胞，从而收获形成层来源的干细胞的步骤的分离方法而得到，此时，所述(b)步骤可以培养含有形成层的组织而诱导从形成层增殖的培养的形成层作为特征，而所述(c)步骤可以分离所述培养的形成层，从而收获形成层来源的干细胞作为特征。此外，所述(b)步骤可以在包括茁长素(auxin)的培养基中培养作为特征，此时，作为茁长素，可使用NAA(α萘乙酸)或IAA(吲哚3-乙酸)，且这样的茁长素可以以1～5mg/l的浓度包括作为特征。另外，所述(c)步骤可以由从形成层以外的部分增殖成无定形的愈伤组织层分离所述培养的形成层，从而收获形成层来源的干细胞作为特征。

在本发明的一实施例中，从作为银杏科银杏属的银杏分离了银杏的形成层来源的干细胞，且对此本发明优选以是银杏属植物的形成层来源的干细胞作为特征，且更优选可以是银杏的形成层来源的干细胞作为特征。

另外，在本发明中，确认了如上所述收获的银杏的形成层来源的干细胞的抗氧化效果，且对此本发明在别的观点，涉及含有所述银杏科的形成层来源的干细胞，其提取物，其破碎物及其培养物中任一种以上的抗氧化用组合物。

在本发明中，所述培养物可以将所述干细胞在作为诱发剂，包括3～5重量％的粗糖或蔗糖；或茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate)，脱乙酰壳多糖，苯丙氨酸(phenylalanin)，苯甲酸，ABA，水杨酸(salicylic acid)及乙酸钠(sodium acetate)中任一种以上的培养基中额外施行额外培养的阶段而收获作为特征。此时，优选地，所述培养基的特征可以是包括选自3～5重量％的粗糖或蔗糖；及茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate)，真菌类提取物，细菌类提取物，酵母(yeast)提取物，脱乙酰壳多糖，葡甘露聚糖(glucomanan)，葡聚糖(glucan)，苯丙氨酸(phenylalanine)，苯甲酸(benzoic acid)，水杨酸(salicylicacid)，花生四烯酸(arachonic acid)，STS，甲羟戊酸N-苯甲酰甘氨酸，ABA，SNP，IPP，BHT，CCC，乙烯利(ethephon)，马尿酸(hippuic acid)，硝酸铈铵(amminoium ceric nitrate)，AgNO₃，硫酸氧钒(vanadyl sulfate)，p-氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)，油菜素甾醇(brassinosteroids)，藻酸钠(sodium alginate)，乙酸钠(sodium acteate)的物质的培养基。

本发明中另外可利用，向所述干细胞作为诱发剂，处理紫外线，热，乙烯，抗真菌剂，抗生素，重金属盐及高的盐浓度等而加物理性的化学的应激而收获的培养物。

对于本发明而言，另外，所述提取物可以利用选自蒸馏水，乙醇等醇，丙酮，DMSO(二甲基亚砜)及这些的混合溶剂的溶剂而提取出作为特征。

在本发明的一实施例中，确认了根据本发明的干细胞提取物及其培养物的提取物的对于以作为氧化剂的DPPH开始氧化的自由基的消除能力与作为合成抗氧化剂广泛地被使用的BHT类似或更优秀。从而，根据本发明的干细胞提取物可作为非常优秀的抗氧化用组合物有用地被使用。

对此，在本发明中即便无提示含有所述干细胞或其破碎物的组合物呈现抗氧化活性的具体的实施例，也如上所述确认了其干细胞及其培养物的提取物具有抗氧化活性，本领域普通技术人员明晰含有根据本发明的干细胞自身或其破碎物的组合物的情况也示抗氧化活性而抑制氧化。

含有根据本发明的干细胞，其提取物，其破碎物及其培养物中任一种以上作为有效成分的抗氧化用组合物可将这些各自单独地包括，或可包括一种以上的药学容许的载质，赋形剂或稀释剂而提供为药学组合物，且所述干细胞等可根据疾病及其患病程度，患者的年龄，体重，健康状态，性别，施用途径及治疗期间等以适当的药学有效量包括在药学组合物中。

所述″药学容许的″是指生理学地容许，且给人施用时，不常规地引起如胃肠障碍，头晕症的过敏反应或与此类似的反应的组合物。作为所述载质，赋形剂及稀释剂的例，则可举乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，甲基羟基苯甲酸盐，丙基羟基苯甲酸盐，滑石，硬脂酸镁及矿物油。

所述药学组合物可额外包括填充剂，抗凝集剂，润滑剂，润湿剂，香料，乳化剂及防腐剂等。另外，为将本发明的药学组合物施用到哺乳动物之后使可提供活性成分的迅速，持续或延迟的释放而可使用本领域中公知的方法剂型化。剂型可为粉末，颗粒，片剂，乳液，糖浆，气雾剂，软质或硬质明胶胶囊，灭菌注射溶液，灭菌粉末的形态。

本发明再一方面，涉及含有根据本发明的干细胞，其提取物，其破碎物及其培养物中任一种以上作为有效成分的抗氧化用功能性食品。

在本申请中′功能性食品′是指向一般食品添加根据本发明的干细胞或其提取物，其破碎物及其培养物中任一种以上，从而提高食品的功能性的食品。

【实施例】

以下，通过实施例更详细地说明本发明。本领域普通技术人员明晰，这些实施例仅旨在例示本发明，本发明的范围不受这些实施例的限制。

尤其，在以下实施例中，确认了银杏的形成层来源的干细胞提取物及其培养物的抗氧化效果，但本领域普通技术人员明晰，使用其干细胞自身或其破碎物也可得到类似的结果。

【实施例1：银杏科的形成层来源的干细胞的制备】

【1-1：植物材料的准备】

银杏科银杏属的银杏(Ginkgo biloba，忠清南道扶余，韩国)如图1，通过间苯三酚(Phloroglycinol)染色而可观察木质部(xylem)与韧皮部(phloem)纤维，可确认此间存在形成层(cambium)。为从这样的银杏收获所述形成层来源的干细胞，首先采集银杏的茎之后，立即浸渍到抗氧化剂100mg/L抗坏血酸(L-ascorbic acid，DUCHEFA，The Netherlands)溶液而运送-保存。此时，为利用前形成层而收获相同的干细胞，则代替茎采集残枝。

此后，在1％苯菌灵(benomyl，Dongbu Hannong Chemical，Korea)，1％百菌清(daconil，Dongbu Hannong Chemical，Korea)，1％链霉素(sterptomycin sulphate，DUCHEFA，The Netherlands)，0.1％头孢噻肟(cefotaxime sodium DUCHEFA，The Netherlands)的混合溶液中24小时预处理后为除去酚化合物(phenolic compound)与残留化学物质而用自来水(tap water)洗涤了30分钟。以及，在70％乙醇(ethanol，DC Chemical，Korea)中1分钟，在30％过氧化氢(hydrogen peroxide，LG Chemical，Korea)中15分钟，在1％CLOROX溶液中15分钟，在3％CLOROX溶液中5分钟而表面杀菌后洗涤了3～4次。

【1-2：从茎包括形成层的外植体的制备及组织分离】

拿镊子夹经实施例1-1的杀菌过程的茎(利用前形成层时是残枝)的作为中央部位的木质部，并举起包括形成层的树皮(bark)组织，则容易地从木质部(xylem)剥下。剥下的组织构成包括形成层，韧皮部(phloem)，皮层(cortex)，表皮(epidermis)的外植体。

【1-3：银杏的形成层来源的干细胞诱导步骤】

将所述实施例1-2在中准备的包括形成层的外植体接种到表1的干细胞诱导培养基(培养基1)中而进行培养。

表1：细胞系诱导培养基(培养基1)

向培养基中作为生长调节剂，可以1～5mg/L的浓度添加如NAA，IAA的茁长素(Auxin)，优选以2mg/L的浓度添加。培养在调节到25±1℃的暗室中实施。

初期培养第4～7天肉眼观察到从形成层的细胞分裂，并在培养15天以后，从由韧皮部、皮层及表皮组成的层开始诱导由脱分化的无定形的愈伤组织。培养经过30天后培养的形成层开始分离成包括韧皮部的层，即无定形的愈伤组织层，并(图2A：干细胞(箭标)，韧皮部(pholem)细胞(星号))，等到两层自然地分离，一旦完美的分离形成则分离培养到各自不同的平皿(petridish)。分离后，将生长率好的白，并熟的部分向与诱导培养基相同的新的培养基每第14天传代培养。图2B是分离所述形成层来源的干细胞而培养3周之后的照片。

另一方面，为了比较而将银杏的树皮(bark)外植体消毒之后在所述<表1>的培养基中培养，其结果，如图3B所示，可观察到树皮(bark)外植体由脱分化而形成愈伤组织。从树皮外植体衍生出的愈伤组织如包括韧皮部的组织，由多种细胞之间的分裂速度的差异而形成无定形，并生长率不稳定，且呈现了容易褐变的倾向。从褐变及凝集的树皮外植体衍生出的愈伤组织终究由自身分泌的酚化合物而生长方缓，终究坏死。即，从6个月后开始，从树皮诱导的愈伤组织难以维持及培养。反面，如图3A所示，银杏的形成层来源的干细胞在长期培养时细胞的生长率，生长模式，凝集程度无变异地稳定地被维持而可大量培养。

【实施例2：银杏属的形成层来源的干细胞的增殖及特性观察】

将在所述实施例1分离的形成层来源的干细胞放入含有如下<表2>的液态培养基的瓶而在暗条件下于25±1℃在100rpm的旋转搅拌机(shaker)中培养。传代培养的周期固定为2周，从而可致使培养细胞始终在对数生长期状态维持高的活力。

表2：悬浮培养基(培养基2)

观察细胞凝集程度(biological microscope C×31，Olympus，Japan)时，根据本发明的干细胞如图4A所示，可确认悬浮培养时包括大量的单细胞，且部分以小尺寸的细胞集合体存在，但作为对照组的银杏的体细胞(从树皮组织衍生出的愈伤组织)的情况中，如图4B所示可观察到凝集。

另一方面，如图5A所示，根据本发明的干细胞可观察到具有多个液泡(vacuole)的形态学的特征。这样的特征是在存在于植物体内的未分化的细胞中由如压力等的原因而出现的特征，由此可确认根据本发明的干细胞处于未分化状态。一般银杏的体细胞(在树皮组织中诱导的愈伤组织)的情况中，如图5B所示，不可确认这样的特征。为对其更详细地观察，将液泡用中性红染色的结果，根据本发明的干细胞可确认如图6A所示红色的多个小的液泡(vacuole)，且一般银杏的体细胞(在树皮组织中诱导的愈伤组织)的情况中，如图6B所示，可确认存在一个大的中心液泡。

另一方面，将根据本发明的干细胞通过光学显微镜B×41TF观察的结果，可观察到多个在运动方面活性非常高的线粒体。图7A示根据本发明的干细胞具有多个线粒体，而箭标示线粒体。与此相反，一般银杏的体细胞(在树皮组织中诱导的愈伤组织)的情况中，如图7B所示，不可确认这样的特征。

另一方面，为依培养期间测定增殖速度，利用具有3L的内容积的气升式生物反应器(airlift bioreactor，三星科学，Korea)而测定细胞培养物的生长速度的结果，如图8所示，可确认培养1周时2倍，培养2周时总3倍的生长率。此时，培养基使用了<表2>的液态培养基，并在暗条件下一定地维持在了25±1℃。此外，以与此相同的培养基与条件在3L的气升式生物反应器中培养在银杏树皮组织中诱导的愈伤组织与根据本发明的银杏的形成层来源的干细胞而进行了相互比较。

表3：生长速度及GI测定结果

细胞系	生长速度(倍)	GI
			干细胞	3.1	2.27
愈伤组织	2.3	1.3

其结果，如<表3>及图9所示，在银杏树皮组织中诱导的愈伤组织的生长速度是2.3倍，且GI(生长指数＝(最大DCW-初始DCW)/初始DCW)不过就是1.3，但根据本发明的形成层来源的干细胞的生长速度是3.1倍，且GI是2.27，可确认与在银杏树皮组织中诱导的愈伤组织相比更高。常规反应器的情况中，在反应器内的生长轮(growthring)生成与培养中的植物培养体凝集性与细胞壁坚实而由对于剪切的敏感性而细胞生存率(cell viability)急剧地减小，但形成层来源的干细胞培养物非常小地形成生物反应器内的生长轮面积，并给培养箱简单的刺激而运动培养基则内壁的轮(ring)简单解除。另外，凝集小，并具有多个液泡(vacuole)而对于剪切的敏感性弱而细胞生存率(cell viability)几乎未减小。

表4：大量培养步骤

	生物反应器	最大干细胞重量(g/L)
			A	3L气升式生物反应器	11.3
B	20L气升式生物反应器	10.1
			C	250L气升式生物反应器	11.7

此外，从<表4>及图10可如，在3L气升式生物反应器，20L气升式生物反应器及250L气升式生物反应器中培养10天的结果，如250L大量培养时也可确认增殖，且250L的大量培养时反倒呈现为每升干燥细胞量增加。

即，根据本发明的形成层来源的干细胞由于在为大量培养的生物反应器中对于剪切应力具有低的敏感性，所以确认在生物反应器内可急速大量生长。从而，可知根据本发明的形成层来源的干细胞与银杏的脱分化的愈伤组织来源的细胞系相比而对于剪切应激具有更低的敏感性。

另一方面，对于在银杏树皮组织中诱导的愈伤组织与根据本发明的银杏形成层来源的干细胞而实施了冷冻保存。悬浮培养物使用培养6天～8天的，且冷冻保存剂是包括0.5M甘油(DUCHEFA，TheNetherlands)与0.5M DMSO(DUCHEFA，The Netherlands)与1M蔗糖(DUCHEFA，The Netherlands)的培养基，并移到5ml冷冻瓶(Duran，USA)中。冷冻保存剂中处理的细胞接种量是200mg/ml。将冷冻保存剂处理的悬浮细胞在冰箱中维持30分钟之后在低温冰箱中保存3小时后使浸渍到液氮中而冷冻。

此后为解冻而拿出在液氮中维持20分钟以上的培养细胞放入40℃恒温水槽，并解冻1～2分钟。为细胞再生长，细胞悬浮液使用了无菌状态的漏斗及滤纸。过滤的细胞放在包括滤纸的固体生长培养基上，并于室温使稳定化30分钟之后，再次移到新鲜的固体生长培养基。

表5：冷冻保存时生存率测定结果

其结果，从图11及表5可如，可确认在银杏树皮组织中诱导的愈伤组织与本发明的银杏形成层来源的干细胞相比而呈现非常低的生存率。

此外，构成植物干细胞的特征的特性中在自我再生能力(selfrenewal)以外有分化能力(pluripotency)。对此，为诱导银杏形成层来源的干细胞的导管元件分化，在包括生长调节剂的MS培养基条件下25±1℃，暗条件下培养的结果，可确认从形成层来源的干细胞分化出导管元件。

【实施例3：诱发剂的处理及银杏的形成层来源的干细胞的提取物制备】

【3-1：诱发剂的处理】

收集如实施例2悬浮培养14天的干细胞而分为2个处理组而施行了实验。即，利用了(1)所述悬浮培养14天的细胞系(生长期)，(2)将所述悬浮培养14天的细胞系在向灭菌水添加粗糖3～5重量％(g/L)及茉莉酮酸甲酯100μM的培养基中暗培养14天的细胞系(诱发期)。

【3-2：提取物的制备】

将所述两细胞系各自除去培养液之后，将冷冻干燥的冷冻干燥细胞系(Dry)2g用50ml的80％乙醇于15℃搅拌48小时而溶解。所述溶解后，以3,000rpm离心20分钟而将上清液冷冻干燥而得到的提取粉末溶解于PBS，从而各自收获对于所述两细胞系的乙醇提取物而使用。

【实施例4：银杏的形成层来源的干细胞提取物的抗氧化效果确认】

为确认根据本发明的干细胞的抗氧化效果，用作为氧化剂的DPPH开始氧化之后，测定了对于实施例3-2的各乙醇提取物的自由基(radical)的消除能力。

即，向96-孔平板(96-孔板)加入实施例3-2的各乙醇提取物20μl与100μM的DPPH溶液180μl之后，于常温反应20分钟而在520nm处测定了吸光度。作为对照组，则使用了作为合成抗氧化剂广泛地被使用的BHT，且自由基消除能力以百分率表示。

其结果，如图12所示，在从不处理诱发剂的悬浮培养14天的细胞系收获的乙醇提取物(GG-E：生长期乙醇提取物)的情况中，呈现为浓度越增加，抗氧化力越增加，且以2.5mg/ml，则呈现为具有与作为合成抗氧化剂广泛地被使用的BHT类似的抗氧化力而呈现为具有优秀的抗氧化力。另外，从作为诱发剂处理粗糖与茉莉酮酸甲酯的细胞系收获的乙醇提取物(GP-E：诱发期乙醇提取物)也随着浓度增加而抗氧化力增加，且以2.5mg/ml的浓度，示比BHT更高的抗氧化活性。这样的实验结果提示根据本发明的形成层来源的干细胞有优秀的抗氧化效果。

【制备例1：药学制剂制备例】

【制剂例1-1：片剂的制备】

将在实施例3中制成的干细胞提取物100mg与玉米淀粉100mg，乳糖100mg及硬脂酸镁2mg混合而根据常规的片剂制备方法进行了制备。

【制剂例1-2：胶囊剂的制备】

将在实施例3中制成的干细胞提取物500mg填充于软质明胶胶囊而制备胶囊剂。

【制剂例1-3：糖浆剂的制备】

将在实施例1中收获的干细胞1g，异构糖10g，甘露糖醇5g，适量的纯化水的含量根据常规的液剂的制备方法而制备了100ml的糖浆剂。

【制剂例1-4：注射剂的制备】

将在实施例3中制成的干细胞提取物200mg加热溶解到含有聚氧化乙烯氢化蓖麻油的生理盐水200mg而制备了含有0.1％的浓度的混合提取物的注射剂。

【制备例2：功能性食品的制备】

【制备例2-1：功能性饮料的制备】

将在实施例1中收获的干细胞200mg溶解于96ml的水之后，作为佐剂，加维生素C 500mg，作为矫味剂，加柠檬酸，寡糖各自1g，作为保存剂，加苯甲酸钠0.05g之后加纯化水而将全量制成100ml而制备了功能性饮料。

【制备例2-2：功能性饮料的制备】

将在实施例3中制备的干细胞提取物200mg溶解于96ml的水之后，作为佐剂，加维生素C 500mg，作为矫味剂，加柠檬酸，寡糖各自1g，作为保存剂，加苯甲酸钠0.05g之后加纯化水而将全量制成100ml而制备了功能性饮料。

【工业实用性】

如上所述，根据本发明的银杏科的形成层来源的干细胞无脱分化过程地分离成未分化状态，从而在长期培养时也细胞生长率与生长模式无变异地稳定地被维持而可大量培养，从而有用。此外，测定根据本发明的银杏科的形成层来源的干细胞的由氧化剂处理而发生的自由基消除能力的结果，呈现为与以往的合成抗氧化剂类似，或具有更高的抗氧化效果，从而可作为优秀的抗氧化用组合物有用地被使用。

以上详细地记述了本发明内容的特定的部分，本领域普通技术人员明晰，这样的具体的描述仅是优选的实施方式，本发明的范围不受此限制。因此，本发明的实质性的范围由随附的权利要求及其等价物定义。

Claims

1.银杏科的形成层来源的干细胞，其特征在于，来源于银杏科(family Gingkoaceae)的形成层，且是不经脱分化的先天性的未分化细胞。

2.权利要求1的银杏科的形成层来源的干细胞，其特征在于，额外具有下列中的至少一个特性：

(b)示具有多个液泡(vacuole)的形态学的特征；

3.权利要求2的银杏科的形成层来源的干细胞，其特征在于，具有所述(a)～(e)的特性中至少两个特性。

4.权利要求2的银杏科的形成层来源的干细胞，其特征在于，具有所述(a)～(e)的特性中至少三个特性。

5.权利要求2的银杏科的形成层来源的干细胞，其特征在于，具有所述(a)～(e)的特性中至少四个特性。

6.权利要求2的银杏科的形成层来源的干细胞，其特征在于，具有所述(a)～(e)的特性之全部。

7.权利要求1的银杏科的形成层来源的干细胞，其特征在于，所述银杏科的形成层来源的干细胞由包括下列步骤的分离方法分离出：

(a)从银杏科植物收获含有形成层的组织的步骤；

8.权利要求1～7中任一项的银杏科的形成层来源的干细胞，其特征在于，所述银杏科的植物是银杏属(genus Gingko)。

9.权利要求1～7中任一项的银杏科的形成层来源的干细胞，其特征在于，所述银杏科的植物是银杏(Gingko biloba)。

10.银杏科(family Gingkoaceae)的形成层来源的干细胞的分离方法，包括下列步骤：

(a)从银杏科植物收获含有形成层的组织的步骤；

11.权利要求10的方法，其特征在于，所述(b)步骤在包括茁长素(auxin)的培养基中培养。

12.权利要求11的方法，其特征在于，所述培养基以1～5mg/l的浓度包括茁长素。

13.权利要求10的方法，其特征在于，所述(c)步骤将培养的形成层从源于形成层以外部分的增殖成无定形的愈伤组织层分开之后，从形成层分离细胞而收获形成层来源的干细胞。

14.权利要求10的方法，其特征在于，所述银杏科的植物是银杏属(genus Gingko)。

15.权利要求10的方法，其特征在于，所述银杏科的植物是银杏。

16.抗氧化用组合物，其含有权利要求1～7中任一项的银杏科的形成层来源的干细胞，其提取物，其破碎物及其培养物中任一种以上。

17.权利要求16的抗氧化用组合物，其特征在于，所述培养物是将所述干细胞在包括3～5重量％的粗糖或蔗糖；或茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate)，真菌类提取物，细菌类提取物，酵母(yeast)提取物，脱乙酰壳多糖，葡甘露聚糖(glucomanan)，葡聚糖(glucan)，苯丙氨酸(phenylalanine)，苯甲酸(benzoic acid)，水杨酸(salicylicacid)，花生四烯酸(arachonic acid)，STS，甲羟戊酸N-苯甲酰甘氨酸，ABA，SNP，IPP，BHT，CCC，乙烯利(ethephon)，马尿酸(hippuic acid)，硝酸铈铵(amminoium ceric nitrate)，AgNO₃，硫酸氧钒(vanadyl sulfate)，p-氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)，油菜素甾醇(brassinosteroids)，藻酸钠(sodium alginate)及乙酸钠(sodium acteate)中任一种以上的培养基中额外培养而收获的。

18.权利要求16的抗氧化用组合物，其特征在于，所述银杏科的植物是银杏属(genus Gingko)。

19.权利要求16的抗氧化用组合物，其特征在于，所述银杏科的植物是银杏。

20.抗氧化用功能性食品，其含有权利要求1～7中任一项的银杏科的形成层来源的干细胞，其提取物，其破碎物及其培养物中任一种以上。

21.权利要求20的抗氧化用功能性食品，其特征在于，所述培养物是将所述干细胞在包括3～5重量％的粗糖或蔗糖；或茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate)，真菌类提取物，细菌类提取物，酵母(yeast)提取物，脱乙酰壳多糖，葡甘露聚糖(glucomanan)，葡聚糖(glucan)，苯丙氨酸(phenylalanine)，苯甲酸(benzoic acid)，水杨酸(salicylicacid)，花生四烯酸(arachonic acid)，STS，甲羟戊酸N-苯甲酰甘氨酸，ABA，SNP，IPP，BHT，CCC，乙烯利(ethephon)，马尿酸(hippuic acid)，硝酸铈铵(amminoium ceric nitrate)，AgNO₃，硫酸氧钒(vanadyl sulfate)，p-氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)，油菜素甾醇(brassinosteroids)，藻酸钠(sodium alginate)及乙酸钠(sodium acteate)中任一种以上的培养基中额外培养而收获的。

22.权利要求20的抗氧化用功能性食品，其特征在于，所述银杏科的植物是银杏属(genus Gingko)。

23.权利要求20的抗氧化用功能性食品，其特征在于，所述银杏科的植物是银杏。