CN115141789A - luterion及其分离和培养方法 - Google Patents

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Luterion Co ltd
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Abstract

本发明涉及作为线粒体样微物质的luterion，及其分离和培养方法，并且更特别地，涉及通过具有特定尺寸的孔径的过滤器分离luterion的方法，通过所述方法所分离的并具有独特特性的luterion，以及用于增殖所述luterion的培养方法。

Description

luterion及其分离和培养方法
本申请是申请日为2016年1月6日、申请号为201680009121.X、发明名称为“luterion及其分离和培养方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本公开涉及作为线粒体样微物质的luterion，及其分离和培养方法，并且更特别地，涉及使用具有特定尺寸的孔径的过滤器分离luterion的方法，以及培养和增殖由所述过滤收集的所分离的luterion的方法。
现有技术说明
本发明的发明人开发了一种有效分离luterial(存在于患者或正常人排出的体液中的微物质)方法，并澄清了所分离的luterial的特征，于2014年5月 9日提交了专利申请(见WO2015/108246)。此外，发现可以通过观察存在于从患者预先排出的体液中的微物质的特性而进行疾病的诊断和预测，并且专利申请于2014年1月14日提交(见WO2015/005553)。
所述luterial(1)是具有原核细胞和真核细胞之间中期融合特性的细胞或细胞类似物；(2)存在于诸如血液、精液、浆液、唾液以及细胞溶胶的体液中； (3)在免疫荧光试验中表现对于詹纳斯绿B(Janus green B)、吖啶橙(Acridine orange)以及罗丹明123(Rhodamine 123)的阳性显色反应；(4)在最佳环境(pH 7.2-7.4)下表现源于β-变形菌和γ-变形菌的基因的表达特性，并且具有30nm 至800nm的尺寸；(5)在酸化环境中：不仅表现源于β-变形菌和γ-变形菌的基因的表达特性而且表现源于真核细胞的基因的表达特性，表达主要与链型植物(sterptophyta)基因同源的基因，从400nm以上增大其尺寸至2000nm以上；(6)在常规条件下参与ATP产生；以及(7)是不同于线粒体以及完全不同于外来体的细胞或细胞类似物。
luterial主要存在于动物包括人类的血液中。同时，证实luterion(这样被命名以区别于luterial的微物质)也存在于植物或食物中，具有与luterial相似的结构和功能。
在这些技术背景下，本申请的发明人发现，由于集中努力地有效分离和培养便于临床适用的luterion，本发明的发明人成功收集了通过添加溶剂至植物或食物中并煮沸而产生的蒸发气体。此后，包含在所述蒸发气体中的 luterion可以通过过滤和离心而有效分离，并且由此分离的luterion可以在特定条件和培养基中培养，从而实现本公开。
发明内容
本公开的目的是提供luterion。
本公开的另一个目的是提供一种使用具有特定孔径的过滤器有效分离用于临床应用的luterion的方法。
本公开的还一个目的是提供一种有效培养luterion的方法。
为了实现上述目的，本公开提供具有选自如下特性中的至少一种特性的luterion：
(a)具有50nm至800nm尺寸的圆形或椭圆形，并且具有迁移性；
(b)具有核酸；
(c)当免疫化学荧光染色时显示与线粒体相似的反应；
(d)表现融合和/或分裂生态型；
(e)在不融合的情况下成熟至尺寸达500nm，成熟成含有DNA的假线粒体，在通过扫描电子显微镜(SEM)或透射电子显微镜(TEM)获得的图像上显示线粒体样结构；
(f)显示不同于外来体的光反应；
(g)当红外线(IR)辐射或加压时经历分裂；
(h)表达作为表面抗原的CD332、CD133、CD73或CD39；
(i)表现自发荧光：
(j)产生400nm或更小尺寸的ATP；
(k)双膜结构或多膜结构；
(l)具有粘附性：
(m)抑制癌细胞的端粒酶活性；
(n)促进正常细胞的端粒酶活性；
(o)具有细胞渗透性；以及
(p)具有血脑屏障(BBB)渗透性。
本公开提供一种分离luterion的方法，其包括如下步骤：(a)煮沸溶剂中的植物或食物，通过冷却蒸发的luterion获得冷凝液，并且使用具有0.8μm 至1.2μm孔径的过滤器过滤所述冷凝液；
(b)离心所过滤的冷凝液；以及
(c)从所离心的上清液中分离所述luterion。
本公开还提供另一种分离luterion的方法，所述方法包括如下步骤：(a) 将具有特异性结合luterion表面抗原的抗体或适体表面表达的颗粒添加至包含所述luterion的提取物，以诱导所述颗粒与luterion的结合；以及(b)回收与所述颗粒结合的luterion。
本公开还提供一种培养luterion的方法，其包括将水添加至luterion，在红外线光辐射或加压下于18℃至30℃增殖luterion。
本公开还提供一种培养所述luterion的方法，其包括在pH 5至pH 9和 18℃至30℃于含有糖的培养基中增殖所述luterion。
附图说明
图1是显示用共焦激光扫描显微镜(Zeiss)获取的luterion的照片及其尺寸。
图2是显示存在或不存在使用Mito-tracker对luterion染色的图像。
图3是显示存在或不存在使用罗丹明123对luterion染色的图像。
图4显示luterion的荧光/非荧光图像的对比(A：詹纳斯绿B阳性，B：罗丹明123阳性，C：Mito-tracker红阳性，以及D：无染色)。
图5显示luterion是否与罗丹明123、Mito tracker红以及詹纳斯绿B共染色 (A：詹纳斯绿B阳性，B：罗丹明123阳性，C：Mito-tracker红阳性，以及D：无染色)。
图6显示通过测量luterion荧光染色区尺寸的luterion尺寸(50nm至800nm) (A：詹纳斯绿B荧光尺寸测量，B：罗丹明123荧光尺寸测量，C：Mito-tracker 红荧光尺寸测量，D：无荧光尺寸测量)。
图7显示正常luterion的生命周期A和突变luterion的生命周期B。
图8是通过TEM电子显微镜获得的图像，其显示luterion具有双膜结构。
图9是通过原子力显微镜获得的图像，其显示luterion其中含有核酸。
图10a是由分析luterion中是否含有RNA而获得的生物分析仪结果(L：对照；1:50nm或更小，2：50nm至100nm，3：100nm至200nm，4：200nm 至400nm)。
图10b显示具有200nm至400nm尺寸的luterion的总RNA。
图11显示在5,000psi的压力和10℃至20℃的温度诱导的luterion分裂结果。
图12显示在15,000psi的压力和10℃至20℃的温度诱导的luterion分裂结果。
图13显示在35,000psi的压力和10℃至20℃的温度诱导的luterion分裂结果。
图14显示在使用PKH26-1、PKH26-2以及PKH26-3荧光染料(红色)对 luterion进行染色和使用DAPI(蓝色)对细胞核进行染色之后将luterion引入细胞的结果。
图15和16显示通过放大进入细胞中的luterion的染色图像而获得的结果 (红色：luterion，蓝色：细胞核，外侧红色虚线圆：细胞边界)。
图17显示口服管饲使用PKH26-1蓝染成蓝色的荧光luterion的结果。
图18和19显示腹腔内注射使用PKH26-1蓝染成蓝色的荧光luterion的结果。
图20显示luterion处理之后正常细胞(成纤维细胞)和癌细胞(肺癌、乳腺癌、结肠癌)中的端粒酶活性。
图21显示在使用不同浓度的luterion处理之后正常细胞(成纤维细胞)和不同癌细胞(肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、白血病)的细胞活力。
图22显示在使用不同来源的luterion处理的胰腺癌细胞系(AsPC-1)中的细胞增殖的抑制。
图23显示使用不同来源的luterion处理的肺癌细胞系(A549)中的细胞增殖的抑制。
图24显示使用不同来源的luterion处理的乳腺癌细胞系(BT-20)中的细胞增殖的抑制。
图25显示在使用luterion处理之后正常细胞(成纤维细胞)中的端粒酶活性。
图26是被设计以评价使用luterion处理后ATP产生的ATP测定的示意图。
图27显示从Carl Zeiss的扫描电子显微镜(SEM)获得的luterion的图像。
图28显示从Bruker Fast Scan AFM原子力显微镜获得的luterion图像。
图29显示在各自添加荧光标记的抗-CD39抗体、Mito-tracker以及DAPI 或它们的组合之后luterion的共染图形。
图30显示在各自添加荧光标记的抗-CD73抗体、Mito-tracker以及Hoechst 或它们的组合之后luterion的共染图形。
图31显示luterion与荧光标记的抗-CD332抗体结合的结果。
图32显示luterion与荧光标记的抗-CD133抗体结合的结果，以及其上部显示抗-CD133-PE(藻红蛋白)荧光染色的结果，和其下部显示抗 -CD133-FITC荧光染色的结果。
图33显示使用碳和羰基包覆小珠之后将特异性结合luterion表面抗原的抗体固定于所包覆的颗粒的步骤。
图34显示通过磁体使用特异性结合luterion表面抗原的抗体包覆的磁珠从血液分离luterion的步骤。
图35显示在分离luterion之后使用荧光显微镜获取的图像，其中，图35(a) 是在荧光显微镜下观察到的使用纳米过滤器由针对分离自漆树提取物的 CD39、CD73、CD133以及CD332的荧光抗体所结合的luterion的图像，图35(b) 是通过使用特异性结合luterion表面抗原的针对CD39、CD73、CD133以及CD332的荧光抗体结合的磁珠分离而获得的luterion的图像，图35(c)是在电子显微镜下观察到的使用纳米过滤器分离的luterion的图像，以及图35(d)是在电子显微镜下观察到的通过使用特异性结合luterion表面抗原的抗体结合的磁珠分离而获得的luterion的图像。
图36表现了所提取的luterion的数量，其中，图36(a)表现使用纳米过滤器分离之后所提取的luterion的数量，以及图36(b)表现在使用特异性结合 luterion表面抗原的抗体所结合的磁珠分离之后所提取的luterion的数量。
图37是特别显示luterion提取步骤的示意图。
图38显示通过使用luterion处理的癌细胞中ATP产生减少。
图39显示通过使用luterion处理的正常细胞(成纤维细胞)中的ATP产生。
具体实施方式
除非另外表明，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。一般而言，本文所使用的命名法和下文所描述的实验方法为本领域公知和常用。
本文所使用的术语“luterial”和“luterion”是本发明的发明人所命名的微物质，其具有50nm至400nm的尺寸，存在于包括动物和植物在内的所有活体，当融合时从病毒样尺寸生长至高达800nm至1200nm。当其尺寸大于1200nm时，将这些微物质列为突变，并且在此尺寸下，它们表现基因异常和病理现象。
luterial和luterion与外来体或微泡的区别在于它们具有DNA和RNA且具有迁移性和粘附性。已经确认线粒体通过詹纳斯绿B(Janus green B)和荧光染料如罗丹明123、Mitotracker、吖啶橙和DAPI的染色，并且luterial和luterion 也被证实通过相同染料染色(见图1至6)。它们具有与线粒体相似的膜结构，而无完整的内嵴(internal cristae)结构。其在与线粒体相同的激光波长范围内被观察到。因此，它们还可以被称为假线粒体、线粒体类似物或原线粒体。
luterial是指存在于生态系统中宿主体内的纳米尺寸的微物质。在包括人类的动物的情况下，其可存在于血液、唾液、淋巴液、精液、阴道液、母乳 (特别是初乳)、脐带血、脑细胞、脊髓或骨髓中。另一方面，luterion是指主要存在于宿主可以用作食物的植物中的纳米尺寸的微物质。
luterion在室温下在短时间内不溶解或消失，并且即使当长时间保存时也不通过融合而突变。
根据本公开的一方面，luterion具有选自如下特性中的至少一种特性：
(a)具有50nm至800nm尺寸的圆形或椭圆形，具有迁移性；
(b)具有核酸；
(c)当免疫化学荧光染色时具有与线粒体相似的反应；
(d)表现融合和/或分裂的生理现象；
(e)在不融合的情况下成熟至尺寸高达500nm，成熟成含有DNA的假线粒体，并且在通过扫描电子显微镜(SEM)或透射电子显微镜(TEM)获得的图像上显示线粒体样结构；
(f)显示不同于外来体的光反应；
(g)当红外线辐射或加压时经历分裂；
(h)表达作为表面抗原的CD332、CD133、CD73或CD39；
(i)表现自发荧光：
(j)产生400nm或更小尺寸的ATP；
(k)双膜结构或多膜结构；
(l)具有粘附性：
(m)抑制癌细胞的端粒酶活性；
(n)促进正常细胞的端粒酶活性；
(o)具有细胞渗透性；以及
(p)具有血脑屏障(BBB)渗透性。
根据本公开的一种示例实施方式，luterion是本公开的发明人所命名的微物质，其具有病毒样至约500nm的尺寸(正常分裂期：50nm至500nm，异常融合期：800nm以上)。其与微泡的区别在于含有DNA和/或RNA，并具有迁移性。其还具有自发荧光和光合成的特性。线粒体由使用罗丹明123、 Mitotracker、吖啶橙、DAPI以及詹纳斯绿B的荧光染色鉴定。由于luterion 由与线粒体的相同染色剂染色，能够证实luterion是否通过使用上述染料荧光染色而被适当地分离(见图1至6)。
此外，可以通过DAPI和吖啶橙(AO)染色方法证实luterion含有RNA以及DNA。具体地，可以证实在460nm的激发波长和650nm的发射波长下 RNA被吖啶橙染成橙色，在502nm发激发波长和525nm的发射波长下DNA 被染成绿色，并且通过DAPI染色方法证实luterion中存在DNA。使用上述染色方法可以证实本公开的luterion含有RNA和DNA。
在本公开的一种示例性实施方式中，证实luterion具有双层膜或多层膜 (见图8)，在luterion中包含核酸，特别是RNA(见图9和10)。
通常，并不知道luterion存在于植物或食物中。因此，没有关于分离或培养luterion的方法的描述。根据本公开，能够提供一种有效分离和培养 luterion的方法。
另一方面，本公开涉及一种分离luterion的方法，其包括如下步骤：(a) 使用具有0.8μm至1.2μm孔径的过滤器过滤通过冷却由煮沸溶剂中的植物或食物获得的水蒸汽或气体而得到的冷凝液；
(b)离心所过滤的冷凝液；以及
(c)从所离心的上清液中分离luterion。
首先，步骤(a)是使用具有0.8μm至1.2μm孔径的过滤器过滤通过冷却由煮沸植物或食物获得的蒸汽或气体而得到的冷凝液的步骤。
在一种示例性实施方式中，上述通过煮沸的提取可以通过将溶剂添加至植物或食物中并且在50℃-90℃的温度使用气体间歇鼓泡的同时煮沸而进行。用于本公开的Luterion具有1以下的密度，所述密度低于蛋白的密度，并且因此，可以通过蒸汽蒸馏方法从植物或食物中分离，但不限于此。
当在50℃至90℃使用气体间歇鼓泡的同时煮沸luterion时，以水蒸汽与气体的形式分离luterion。当使用鼓泡煮沸时，可以降低含有luterion的植物或食物溶液的沸点以防止luterion分解、劣化或损坏。
在某些情况下，步骤(a)可以通过煮沸8至10小时和每2至3小时鼓泡20至30分钟以防止植物或食物的luterion缠绕来进行，以增加分离luterion 的效率。
图37中显示了步骤(a)中提取-过滤的细节。将溶剂如蒸馏水添加至植物或食物，并且通过煮沸获得提取物，然后使其在约100g至250g、优选190 g经受初次离心，然后旋转减慢以去除杂质，并且使其在约1000g至5000g、优选约3000g经受二次离心。可以在稳定数分钟(优选约2小时)之后收集上清液。在某些情况下，此时，可以使用荧光标记物标记的抗-CD332抗体对 luterion进行染色，并检查其迁移性以初步证实luterion的存在。此后，为了获得纯的luterion，可以在100,000g至150,000g、优选120,000g进行第三次离心。
此后，收集使用约800nm的过滤器的过滤液，并且去除碎片沉淀如外来体的或胞内物质如血浆。此后，可以通过在140,000g以上进一步离心收集不含沉淀的上清液。使用400nm过滤器过滤上清液，收集过滤液，然后再次将luterion的CD332染色以证实其迁移性。此外，可以通过使用50nm 过滤器过滤收集luterion，收集过滤器上的未过滤部分以获得luterion，并且在pH 1或-90℃以下的温度固定。
在一个示例性实施方式中，植物可以从表1至4至所列的药用植物中选择。由于luterion存在于所有植物中，luterion不限于表1至4中所述的药用植物。
[表1]
Figure BDA0003509298580000081
Figure BDA0003509298580000091
[表2]
Figure BDA0003509298580000092
[表3]
Figure BDA0003509298580000093
Figure BDA0003509298580000101
[表4]
Figure BDA0003509298580000102
Figure BDA0003509298580000111
此外，预期植物中所包含的luterion大量分布于植物的茎部，并且优选从含有茎部的植物中分离luterion。
可以通过收集由煮沸而蒸发的水蒸汽或气体然后冷却来获得上述冷凝液。能够获得与收集的蒸发水蒸汽或气体分离的状态的luterion或获得与其混合的状态的luterion。当luterion与蒸发的水蒸汽或气体处于混合物状态时，可以通过进一步的分离过程获得luterion。
在某些情况下，可以增加使用红外线辐射步骤(a)中获得的冷凝液的步骤用于分离luterion。例如，能够通过使用红外线光辐射冷凝液20至60分钟、优选30至40分钟以防止luterion变形并收集朝所述光移动的luterion来收集高度浓缩的luterion。
步骤(b)是使用具有0.8μm至1.2μm的孔径的过滤器过滤所获得的冷凝液的步骤。考虑到luterion的长直径，具有0.8μm至1.2μm的孔径的过滤器是本发明的发明人所选择的最佳尺寸。在过滤之后，可以从步骤(a)中所获得的冷凝液分离所需的luterion。
步骤(c)是离心所过滤的冷凝液的步骤。可以通过此步骤获得较高纯度的luterion。可以在1200g至5000g重复进行离心5至10分钟，但是可以调整离心条件提高luterion的纯度。
步骤(c)是从所分离的上清液级分分离luterion的步骤。例如，使用具有 200μm至600μm波长的红外线光辐射离心的上清液，以聚集朝所述光移动的lureion。还可以通过收集表达诸如CD332、CD133、CD73以及CD39的表面抗原的luterion进一步从离心的上清液分离luterion。但是不限于此。
在步骤(c)之后，可以进一步使用孔径小于50nm的过滤器分离luterion，然后收集截留在过滤器上的未滤过物质。通过上述过程，可以去除除luterion 之外的微物质，并且可以获得尺寸为50nm以上的luterion。
在某些情况下，可以顺序使用200nm、400nm、600nm、800nm以及 1000nm的过滤器将它们分别分为50nm至200nm、200nm至400nm、400 nm至600nm、600nm至800nm以及800nm至1000nm尺寸的luterion。可以通过暗视野显微镜或共聚焦显微镜观察根据本公开所述的luterion，并且能够通过200nm、600nm、400nm以及800nm的过滤器顺序过滤luterion 而分类为50nm至200nm(生长期)、200nm至400nm(成熟期)、400nm至 600nm(分裂期)以及600nm至800nm(过分裂期)的luterion。(见图27和28)。
此后，可以增加在特定的pH和温度条件下固定luterion的步骤。例如，可以在pH7以下和0℃以下固定。优选地，在pH 1至5和-90℃至0℃固定。在本公开的一种示例性实施方式中，证实能够在0℃以下的温度和pH 1至3 的条件下固定能动的luterion。固定luterion能够提高分离效率。
还可以包括另外的增殖步骤，例如，分裂诱导步骤。可以通过施加25,000 psi(磅/平方英寸)以上的压力诱导分裂。在本公开的一种示例性实施方式中，证实施加25,000psi至35,000psi的压力以诱导分裂。此时，将温度保持在 10℃至20℃，并保持用于固定的pH 1至3的条件。
另一方面，本公开涉及一种分离luterion的方法，其包括如下步骤：(a) 将一种颗粒添加至包含luterion的提取物中以诱导所述颗粒与luterion结合，所述颗粒中具有所固定的特异性结合luterion表面抗原的抗体或适体；以及(b)回收与所述颗粒结合的luterion。
在本公开中，为了基于luterion表面的特定抗原表达而有效分离大量 luterion，尝试使用针对特定抗原的抗体或适体固定颗粒进行luterion的分离。因此，在本公开的一种示例性实施方式中，证实可以以短于常规方法的时间分离大量luterion。
含有luterion的提取物可以是，例如，(i)植物或食物的热水提取物，(ii) 植物或食物的溶剂提取物，或(iii)在溶剂存在下通过加热植物或食物产生的气体的冷凝液。
热水提取物没有特别限制，只要使用温度为例如40℃或更高的水从植物提取生理活性物质即可。当使用热水时，不存在有机溶剂毒性导致的问题。可以使用溶剂，例如乙醚、甲醇、乙醇以及己烷，提取溶剂提取物。
冷凝物通过将蒸馏水加入到植物或实物中，在50℃至90℃使用气体将其间歇鼓泡同时将其煮沸，并且收集通过煮沸蒸发的水蒸气或气体，并将其冷却来制备。
根据本公开所述的“luterion表面抗原”通过位于luterion膜上的脂质层上含有疏水性氨基酸的羧基末端结构域附着于细胞膜表面，并且能够发挥生物抗原效果，并可以包括，例如CD39(外生三磷酸核苷二磷酸水解酶1； ENTPD1)、CD73(外生-5’核苷酸酶；NT5E)、HBsAg、SLC3A2、CD109、 LY9、CD332、CD133或CD53，优选CD332、CD133、CD39或CD73。
“抗体”是指特异性结合并针对抗原位点的蛋白质分子。在本公开中，将颗粒固定于能够特异性结合luterion表面抗原的物质。可以使用特异性结合所述抗原的抗体。可用于本公开的抗体可以是，例如，抗-CD332抗体、抗 -CD133抗体、抗-CD39抗体或抗-CD73抗体。可以使用市售的抗体。可以使用结合表面表达抗原的适体代替此抗体。
根据其特性，“颗粒”可以具有磁性、发光、静电以及离子特性，根据其尺寸可以具有微米或纳米尺寸。如果可以通过与抗体结合而分离luterion(但不限于此)，可以从例如磁性颗粒、二氧化硅颗粒、量子点颗粒、玻璃颗粒、聚合物颗粒、纤维颗粒以及荧光颗粒中选择luterion。所述颗粒可以包括同时具有磁性和荧光特性的颗粒，量子点颗粒和金银颗粒结合的磁性颗粒。
所述颗粒可以是例如磁性颗粒，并且此磁性颗粒具有磁性，并通过磁场移动。磁性可以是顺磁性。磁性颗粒可以包括，例如，金属物质、磁性物质或磁性合金。磁性颗粒可以是表现磁性的颗粒，但是在本公开中，磁性颗粒不限于此。其可以是自身未被磁化但是可以是能够具有磁性或吸引成磁力的金属颗粒的磁性颗粒。所述金属颗粒可以由选自例如铁、铝、钴、镍、锰、锡、锌、镉、镁、铜、钡、锂或钇的氧化物中的任意一种来制作。这其中，优选铁。此颗粒为微米尺寸的铁磁体，而纳米尺寸的小颗粒则是超磁化的。这样的颗粒易于合成，且其尺寸能够容易地调整。例如，此颗粒可以具有1nm 至1,000nm、优选10nm至1,000nm、更优选10nm至500nm、并且最优选10nm至100nm的尺寸。
在某些情况下，可以修饰磁性颗粒以保持磁性颗粒的分散性和安全性。例如，可以包覆碳以修饰磁性颗粒。
其可以进一步包含适于结合抗体或适体的官能团。官能团可以是例如，酰胺基、酯基、胺基、羧基、巯基(SH)、环氧基、苯基、磺基、烷氧基、醛基以及酮基。胺基(NH2)可以是单胺、二胺、三胺、乙二胺或二亚乙基三胺。
在回收与颗粒结合的luterion的步骤中，当颗粒是磁性颗粒时，步骤(b) 可以特别包括使用外部施加的磁性回收与磁性纳米颗粒结合的luterion。
在通过luterion和使用luterion特异性抗体或适体包覆的颗粒之间的相互作用进行这样的回收与luterion结合的磁性颗粒之后，可以使用在室温下使用磁体或磁性激活的细胞分选仪(MACS)沉淀luterion，之后移除上清液并在缓冲液中重悬浮沉淀，并顺序通过凝集膜和过滤膜以捕获luterion-抗体-磁性颗粒复合物。
在本公开中，步骤(b)还可特别包括使用荧光激活的细胞分选仪回收与 luterion结合的荧光颗粒。
使用荧光激活的细胞分选仪回收是根据用于定性和定量分析的其荧光类型和密度对微物质进行分类的过程。其包括使得荧光颗粒能够流过预定管道的“流体系统”，用于在流体细胞控制下观察微物质流动的“光学系统”，以及将光学系统的光学信号转变为电子信号的“电子系统”。荧光激活的细胞分选装置是根据其特定荧光特性对于不同细胞进行有效分类和收集的装置，并且广泛用于生命科学(例如，动物科学、植物学、微生物学、农业、渔业科学以及林业)和医学研究。本公开荧光颗粒中所含有的荧光物质可以是能用于活体成像的任何荧光物质。所述荧光物质包括但不限于选自罗丹明及其衍生物、荧光素及其衍生物、香豆素及其衍生物、吖啶及其衍生物、芘及其衍生物、赤藓红及其衍生物、曙红及其衍生物、4-乙酰氨基-4’-异硫氰酸芪-2,2’二磺酸的一种。荧光物质的更具体实例如下：
罗丹明及其衍生物：6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明 X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(Texas红)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、核黄素、玫红酸、铽螯合物衍生物、Alexa衍生物、Alexa-350、Alexa-488、Alexa-547，以及Alexa-647；荧光素及其衍生物：5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素 (DTAF)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、QFITC(XRITC)、荧光胺、IR144、IR1446、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-甲基繖形酮、邻-甲酚酞、硝基酪氨酸、副蔷薇苯胺(pararosaniline)、酚红、B-藻红蛋白，以及邻苯二醛；香豆素及其衍生物：香豆素、7-氨基-4- 甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)、cyanocin、4’-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、5’,5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)、7-二乙氨基-3-(4’-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素二亚乙基三胺五乙酸酯、4-(4’-二异硫氰酸二氢-茋-2,2’-二磺酸、4,4’-二异硫氰酸茋-2,2’-二磺酸、 5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)、4-(4’-二甲基氨基苯偶氮基) 苯甲酸(DABCYL)，以及4-二甲基氨基苯偶氮基苯基-4’-异硫氰酸酯 (DABITC)；吖啶及其衍生物：吖啶、吖啶异硫氰酸酯、5-(2’-氨乙基)氨基萘 -1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸酯 (LuciferYellow VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺，以及亮黄(Brilliant Yellow)；芘及其衍生物：芘、芘丁酸酯、琥珀酰亚胺基1- 芘丁酸酯，以及活性红4(Reactive Red 4)(汽巴克隆亮红(Cibacron Brilliant Red)3B-A)；赤藓红及其衍生物：赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯，以及溴化乙锭；曙红及其衍生物：曙红，以及曙红异硫氰酸酯；以及4-乙酰氨基-4’- 异硫氰酸均二苯乙烯-2,2’二磺酸。
在本公开中，当颗粒为静电带电颗粒时，步骤(b)可包括通过施加不均匀电场形成颗粒上的偶极矩，和通过静电吸引回收与luterion结合的离子颗粒。
可以使用电颗粒分类器(微分迁移率分析仪，DMA)—一种颗粒分离仪器实施通过施加不均匀电场形成颗粒上的偶极矩和通过静电吸引回收与luterion结合的离子颗粒的方法。电颗粒分类器是一种使用由于静电力而导致颗粒迁移性的差异对颗粒进行分类的装置，并且还被称为微分电迁移率分析仪或微分颗粒静电分类器。具体地，电颗粒分类器是一种基于带电荷的颗粒的移动速率是颗粒直径的函数的理论从多分散颗粒中分选具有所需直径的单分散颗粒的装置。
在本公开中，当颗粒是离子颗粒时，例如，阴离子或阳离子颗粒，步骤 (b)可以包括使用静电吸引回收与luterion结合的离子颗粒。
可以通过电颗粒分类器(微分迁移率分析仪，DMA)实施通过静电吸引回收与luterion结合的纤维颗粒的方法。
本公开可以进一步包括从与颗粒结合的luterion中回收luterion。
将BSA/PBS缓冲液添加至与颗粒结合的luterion，在25℃温育，并且使用磁力或离子力分离仅吸附BSA(牛血清白蛋白)的颗粒，并且可以进一步将吸附BSA的颗粒与PBS一起温育以使颗粒解吸附，仅分离luterion。
另一方面，本公开涉及一种培养luterion的方法，其包括将液体添加至luterion，并且在红外线光辐射或压力下在18℃至30℃增殖。
在一种示例性实施方式中，培养过程中添加的液体可以是但不限于盐水溶液或PBS溶液。
另一方面，本公开涉及一种培养luterion的方法，其包括在pH 5-9(当固定时pH1-3)和18℃至30℃于含有糖的培养基中增殖luterion。
在一种示例性实施方式中，糖可以是鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、果糖或木糖，并且优选葡萄糖。在本公开的一种示例性实施方式中，证实可以在如下最佳条件培养luterion：其中，在pH 7以及约20℃的温度，将浓度约1％至10％、优选2％至8％的葡萄糖添加至DMEM或血培养基。所培养的luterion 的数量通过计算表达luterion特定表面抗原CD332、CD133、CD73或CD39 的luterion和被mitotracker红染色的luterion的数量而确认。
luterion的尺寸在培养前可以是50nm至200nm，但是在根据本公开的培养方法培养之后其尺寸可以为300nm至500nm。此时，能够在使用显微镜观察的同时保持luterion的尺寸不超过500nm。当结束培养时，能够根据尺寸进行分类，并且在-80℃冷却待储存，在所充的氮气中储存，或在大于0℃储存，并且在储存过程中可以添加保存剂。
可以经一定时间段储存所需尺寸(500nm或更小)的培养的luterion而不改变其特性，并且因此可以使用luterion有效用于治疗疾病。
具体地，可以将根据本公开所述的luterion引入胞内细胞质。将使用红色荧光染色的luterion引入细胞，其证实了将luterion引入DAPI染色的细胞核周围的胞内细胞溶胶。
此外，由于对于本公开所述的luterion的荧光染色及通过腹腔内注射(IP) 和口服管饲施用将其引入小鼠，证实了其在口服施用后至少3小时内或腹腔注射后5分钟内通过BBB(血脑屏障)。通过利用这些特性，根据本公开所述的luterion可克服药物由于，例如在脑退行性疾病的治疗中，不透过血脑屏障而不能用作治疗剂的限制。使用该可透过血脑屏障的特性，luterion能够用作脑退行性疾病的治疗剂，或用作药物载体使得已知的药物穿过血脑屏障。
另外，根据本公开所述的luterion具有抑制癌细胞中端粒酶活性的抗癌作用，而在正常细胞中无作用，或促进端粒酶活性，从而有效地仅抑制癌细胞的增殖。
同时，证实了通过luterion处理增加正常细胞中的端粒酶表达，由此增加端粒长度，其表明luterion通过促进正常细胞中的端粒酶活性而表现抗衰老活性。
“正常细胞”是指具有正常衰老过程的细胞，其并非具有增加的端粒酶活性和经过无限增殖的表型(例如癌细胞)的细胞。
“端粒酶”是指催化端粒重复序列添加至端粒末端的核糖核酸蛋白质。认为端粒为涵盖染色体末端并稳定染色体的一段长重复序列。在人类中，端粒的长度通常长为7kb至10kb，并且含有多个序列-TTAGGG-的重复序列。在大多数成人细胞中端粒酶不表达，并且端粒酶的长度通过连续的原始序列复制而减小。当细胞复制达到一定数量的次数以上时，端粒逐渐收缩，使得细胞进入终末崩溃阶段，其导致细胞衰老。在体细胞中，端粒酶无活性，但是在90％的癌细胞中具有活性，并且端粒酶抑制剂可以用于抗癌。
此外，证实使用luterion处理正常人成纤维细胞导致人正常细胞的端粒酶表达增加，和ATP产生增加。换句话说，证实luterion可以通过增加正常细胞的端粒酶活性抑制衰老。因此，根据本公开所述的luterion可以用于治疗对于端粒酶表达和/或端粒酶活性增加易感的疾病或病症的治疗，并且施用于需要治疗的患者以增加患者组织或细胞中的端粒酶活性。
“与衰老相关的疾病或病症”是指肿瘤发生、癌症恶性发展、心肌梗塞(心脏病发作)、小脑梗塞、中风、帕金森氏病、心力衰竭、动脉粥样硬化、高血压、白内障、伴随衰老的视敏度降低、肌营养不良、骨关节炎、骨质疏松症、骨髓流失、多发性硬化症、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、类风湿性关节炎、免疫功能受损、糖尿病、特发性肺纤维化、神经变性疾病、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)，以及由例如睾酮、雌激素、生长激素、IGF-I或能量产生减少引起的病症。
“抗衰老作用”是指表型包括线粒体生物合成和功能增加、ROS水平减少、诸如衰老细胞和神经细胞的体细胞分裂之后细胞寿命延长、预防与诸如肿瘤发生、癌症恶性发展、小脑梗塞以及心肌梗塞的衰老相关的现象。
线粒体(细胞的能量工厂)是最活跃的呼吸氧消耗场所，其中所有细胞进行其代谢活动。线粒体功能提供了细胞所有活动所需的能量(Boveris A等， Biochem.J.134:707-716,2973)。在将电子转移至线粒体氧的过程中产生的活性氧簇(ROS)，例如O2·-or OH·，破坏线粒体的结构和组分，导致呼吸速率和氧化磷酸化态改变，并且因此影响决定细胞代谢的ATP产生或 NADH/NAD+比。据报道，高等动物中的大部分能量产生被归因于线粒体中合成的ATP，并且线粒体中发生的能量代谢与衰老密切相关(Lee JW等，J Korean MedAssoc.52(10):1007-19,2009)。
证实正常细胞中的ATP产生通过luterion处理而增加。本文所使用的术语“预防衰老相关的疾病或病症”是指减少衰老相关疾病的发生和延迟或逆转衰老相关疾病。
本文所使用的术语“衰老或衰老细胞”是指有丝分裂细胞中细胞周期停滞，其可以由端粒功能障碍、DNA损伤或癌基因激活而导致。在萌芽酵母中，端粒功能障碍诱导的衰老细胞在细胞周期的G2/M期停滞。在哺乳动物细胞中，衰老细胞在G0期(细胞周期外的非有丝分裂期)停滞。WI-38成纤维细胞的衰老是指当在显微镜下观察时传代后10天过程中细胞的数量不增加，并表现β-半乳糖苷酶阳性染色。
本文所使用的术语“体细胞分裂之后的细胞”是指暂停在G0期(细胞周期外的非有丝分裂期)而其基本功能维持其余有机体生命的细胞群。体细胞分裂之后的细胞包括神经细胞、心肌细胞以及肌肉细胞。有些成熟生物体的细胞类型，例如肝脏实质细胞和肾脏实质细胞能够半永久进入G0期，并且在非常特定的情况下能够再被诱导开始分裂。当这些类型的细胞处于G0期时，将其考虑为体细胞分裂之后的细胞。
衰老相关的疾病或病症与线粒体功能丧失、端粒功能障碍、衰老细胞退化、年龄依赖性细胞损失、或线粒体退化或体细胞分裂之后细胞的细胞周期停滞相关。
在一种示例性实施方式中，luterion与端粒酶相互作用，刺激和/或增加个体的组织或细胞的端粒酶表达和/或活性。在一些示例性实施方式中，这样的活性可被降低或缺失，由此导致与疾病相关的病原体或综合征的生长或发展。这样的疾病或病症包括：(a)阿尔茨海默氏病；(b)帕金森氏病；(c)亨廷顿氏病； (d)癫痫发作；(e)神经损害，运动神经元疾病，多发性硬化症(MS)，外周和中枢神经系统损伤(包括脊髓损伤和中风)；(f)皮肤衰老相关的疾病，例如皮肤萎缩和变薄，弹性纤维融合，皮肤皱纹，皮脂腺增生或低常增生，衰老黑斑，色素缺陷，白发和脱发或头发稀疏(变秃、脱发)或慢性皮肤溃疡；(g)退行性关节病；(h)骨质疏松症，关节炎以及骨骼系统的其他退行性症状；(i)血管系统的衰老和应激相关疾病，包括动脉粥样硬化、钙化、血栓形成、高血压以及动脉瘤；(j)衰老相关的黄斑变性；(k)AIDS；(l)衰老和应激相关的免疫系统损害，包括组织周转发病，其发生于天然衰老、癌症、癌症治疗、急性或慢性感染、导致细胞周转加快的退行性炎性疾病或遗传疾病，以及伴随的贫血和其他退行性症状；(m)表皮伤口的治疗、烧伤、磨损或其他急性或慢性症状； (n)先天性角化异常；(o)肌肉减少症和/或其他肌肉疾病或病症；(p)黄体缺陷； (q)卵巢功能早衰(原发性卵巢功能衰竭或性腺功能减退)；(r)精子产生受损；(s) 精子输送受损；和/或(t)记忆性T细胞中端粒酶表达和/或活性增加以增强免疫记忆反应和对于疫苗的反应；和/或(u)增加健康组织中的端粒酶表达和/或活性，以在延长个体的生命同时维持个体健康，和/或临床治疗和/或诊断领域，包括涵盖在本文所使用的术语“治疗”内的任何示例性实施方式。
实施例
以下，将参考实施例更详细地描述本公开。本领域技术人员应该理解的是这些实施例仅用作说明的目的，并且本公开的范围不被解释为局限于这些实施例。
实施例1：luterion的分离
(1)luterion的提取
将100g药用植物漆树切割成适合尺寸为药用植物20至30倍的容器(即具有2至3升尺寸的容器)，并置于容器中。将500g至800g蒸馏水(为植物量的5至8倍，优选植物的6倍，即600g)添加至容器中，然后进行煮沸。约每3小时使用氧气进行鼓泡20至30分钟，从而在8小时的煮沸过程中植物的luterion不会缠绕。在烧瓶中收集从煮沸和鼓泡获得的蒸汽。使用红外线光(波长：约3μm至约1000μm，优选200μm至600μm)辐射通过冷却和冷凝所收集的蒸汽而获得的冷凝液1至2小时，以防止luterion突变和诱导分裂。此过程在图37中示例。
(2)通过离心和过滤分离
将步骤(1)中收集的冷凝液在190g经受初次离心以去除沉淀的杂质，之后在3000g进行二次离心，并稳定数分钟(优选约2小时)，并收集其上清液。此时，使用荧光探针标记的抗-CD332抗体对luterion进行染色，然后通过荧光成像检查其迁移性初步证实luterion的存在。接下来，使溶液在120,000g 经受第三次离心，以从上清液获得纯luterion。
具体地，在140,000g以上对于使luterion穿过尺寸为800nm的过滤器之后的过滤液进行离心，以去除诸如外来体的碎片沉淀和诸如原生质的胞内物质，然后收集无沉淀的上清液。使用400nm过滤器过滤上清液，并收集过滤液，之后使用荧光抗-CD332抗体染色以证实luterion的迁移性。使用 50nm过滤器过滤，并且收集截留于过滤器上的未滤过部分以获得luterion，并在pH 1或低于-90℃固定。
通过此过程，获得50nm-800nm长轴直径的luteiron，其能够通过暗视野显微镜或共聚焦显微镜观察。根据其尺寸，将所获得的luterion分成50nm 至200nm(生长期)/200nm至400nm(成熟期)/400nm至600nm(分裂期)/600nm至800nm(过分裂期)。
以相同的方式，从表1至4中描述的药用植物朝鲜当归(angelica gigas)、漆树(rhois vernicifluae cortex)以及猕猴桃获得luterion。
(3)通过表面抗原特异性抗体分离
3-1)luteiron表面抗原的鉴定
使抗-CD39抗体(sc-18766,Santa Cruz Biotechnology)、抗-CD73抗体 (sc-25603，Santa Cruz Biotechnology)或抗-CD332抗体(BS-0675R,Bioss Inc) 与从植物中分离的luterion结合，并使抗-FITC抗体与之结合，以观察luterion 的表面抗原的荧光(蓝色荧光：CD133/1-VIOBRIGHT-FITC)。使用PE (Phycoerythrin:Miltenyi Bitech GmbH)标记获得红色荧光。在使用 Mito-tracker、DAPI以及Hoechst染色之后，通过荧光显微镜鉴定阳性染色显影。
结果，证实与luterion结合的抗-CD39抗体、抗-CD73抗体、抗-CD133 抗体或抗-CD332抗体被mito-tracker、DAPI或Hoechst染色，由此，证实了在luterion的表面存在CD39、CD73、CD133或CD332(见图29至32)。
3-2)抗体固定颗粒的制备
步骤1.碳包覆的铁(Fe)磁性纳米颗粒的制备
将0.5mmol乙酰丙酮亚铁水合物置于含有10mL辛醚的锥形瓶中，并且通过搅拌制备金属前体溶液。然后使用超声波辐射器在20kHz(50％)下将超声波辐射至溶液10分钟。观察到随着使用超声波辐射金属前体溶液最初呈橙色的溶液改变为黑褐色。此变化表明成功制备了氧化铁(Fe2O3)磁性纳米颗粒。将大量乙醇添加至其中制备氧化铁磁性纳米颗粒的混合溶液中，并且对于所得到的磁性纳米颗粒进行沉淀。然后，通过离心分离磁性纳米颗粒和上清液，并除去上清液。在重复上述洗涤过程3次以上之后，在50℃的温度干燥磁性纳米颗粒12小时，以制备具有300nm尺寸的氧化铁磁性纳米颗粒。在氩气(Ar)气氛中在600℃热处理所制备的氧化铁磁性纳米颗粒3小时以获得碳包覆的铁磁性纳米颗粒。
步骤2.羧基包覆的磁性纳米颗粒的制备
将步骤1中所获得的0.5g碳包覆的铁磁性纳米颗粒和1g琥珀酸酐分散于25ml乙醇连同5ml硅烷聚乙二醇羧酸，之后反应24小时。在完成反应之后，使用乙醇洗涤通过离心获得的沉淀，然后在真空烘箱中干燥以获得被碳和羧基双包覆的铁磁性纳米颗粒。上述双包覆颗粒制备步骤简要地示于图 33的前半部分。
步骤3.抗体固定的颗粒的制备
通过与巯基反应试剂反应对于抗-CD39抗体、抗-CD73抗体、抗-CD133 抗体或抗-CD332抗体进行巯基化。使步骤2中制备的具有羧基官能团的铁磁性纳米颗粒与具有巯基的抗体反应以使抗体附着于铁磁性纳米颗粒。抗体固定的颗粒简要地示于图33的后半部分。
3-3)源于植物或食物的luterion的制备
将100μl至200μl植物提取物和5μl CD39抗体-铁磁性纳米颗粒或 CD73抗体-铁磁性纳米颗粒置于烧杯中以使得彼此相互结合30分钟，并且通过将其置于磁性分离器中洗涤1至2分钟以收集luterion-磁性纳米颗粒并去除上清液。将0.033％(w/w)BSA(牛血清白蛋白)/PBS缓冲液添加至与 luterion结合的铁磁性纳米颗粒，并在25℃温育1小时，然后使用磁棒仅分离BSA吸附的纳米颗粒。将一定量的PBS再添加至BSA吸附的铁磁性纳米颗粒通过温育吸附BSA。通过FP-640荧光光谱仪(JASCO)在280nm使用标准校准曲线方法(发射狭缝：0.5nm，吸收狭缝：0.5nm)对于所吸附的BSA 进行定量分析。使用铁磁性纳米颗粒分离植物luterion简要地示于图34。
3-4)分离的luterion的鉴定
使抗-FITC抗体与结合每个从上述3-3分离的luterion和通过(2)过滤分离的luterion中的CD39、CD73、CD133或CD332的各抗体结合，以观察是否存在阳性荧光染色(见图35(a)至35(d))。通过荧光激活细胞分选器比较两种分离方法的提取率。
结果，在使用纳米过滤方法分离的情况下，luterion的数量是1.5×108/ml，而在使用结合CD39、CD73、CD133或CD332抗原的颗粒分离的情况下， luterion的数量是7.18×108/ml。其luterion的数量是纳米过滤方法的4倍以上(见图36(a)和36(b))。
[表5]
luterion的分离方法 50～400nm luterion提取效率比 损失率
(2)纳米过滤方法 40～45％ 50～60％
使用抗体分离 >90～95％ <10％
如表5所示，证实当使用纳米过滤方法时，具有50nm至400nm尺寸的luterion最终提取效率比是40％至45％，并且损失率是50％至60％，而使用本公开所述的与CD39、CD73、CD133或CD332表面抗原结合的抗体-铁纳米颗粒分离导致90％至95％以上的最终提取效率比，并且损失率为10％以下。此结果证实使用抗体-铁纳米颗粒分离方法提取效率比显著较高。
从这些结果可以证实，与使用纳米过滤器的传统luterion分离方法相比，使用本公开的结合luterion表面抗原的抗体固定颗粒或适体固定颗粒的分离方法在分离过程中增加最终提取比率，并减少损失率。
(4)证实植物线粒体和luterion之间的差异
如表6所示，证实植物线粒体不表达CD332、CD39、CD73、CD133以及CD326中的任何表面抗原。另外，当在大于140,000g离心时，线粒体爆发，而luterion保持其形态。进一步地，证实当应用超过35,000psi的加压以诱导分裂时，线粒体破裂，而luterion保持其形状。
[表6]
Figure BDA0003509298580000231
实施例2：luterion的固定
固定具有迁移性的luterion和含有CD39、CD73、CD133或CD332作为表面抗原的luterion，然后对于luterion进行计数。辐射红外线以鉴定所吸引的luterion。对于针对CD332、CD39、CD133或CD73的初级抗体和使用FITC 标记的二级抗体所结合的luterion数量进行计数。还对于使用mito-tracker染色的luterion进行计数。在此过程中，在pH 1至3和-90℃至0℃的温度固定 luterion。在不同pH和温度条件中计数的结果示于下表7和8(其中，+是指所计数的luterion的数量)。
[表7]
1月 2月 3月
pH1 +++ +++ +++
pH3 +++ +++ +++
pH5 +++ +++ ++
pH7 ++ ++ +
[表8]
1月 2月 3月
RT(37℃) +++ ++ +
0℃ +++ +++ +++
－90℃以下 +++ +++ +++
如表7和8所示，证实在pH 1至3和-90℃至0℃的温度条件下，luterion 以固定的状态保存超过1至3个月，而对其数量没有影响。
实施例3：使用加压对于luterion进行分裂诱导
如下表9中所示，通过弗氏细胞压碎器将压力施加于实施例1中分离的 luterion。此外，证实了温度对于luterion分裂的影响(+表示分裂的程度)。
[表9]
5,000 10,000 15,000 25,000 35,000 35,000以上
0-10℃ +++ +++ ++ ++ ++ +
10-20℃ +++ +++ +++ +++ +++++ +
20-25℃ +++ +++ ++ ++ ++ +
根据表9和图11至13，证实在pH 1至3、25,000psi至35,000psi的压力以及10℃至20℃的温度诱导分裂以增殖luterion。
实施例4：luterion的特性
(1)结构
使用共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss)、透射电子显微镜、扫描电子显微镜、原子力显微镜以及共聚焦扫描仪(Leica TCS-SP8)观察实施例1中获得的具有约50nm至约400nm尺寸的luterion，以证实luterion也具有与线粒体相似的双膜或多膜的膜结构，其中，内嵴结构不完整，并且观察到其处于与线粒体相同的激光波长范围。另外，观察到luterion的形状是圆形或椭圆形(见图6)。
此外，从透射电子显微镜捕获实施例1中分离的luterion的图像。因此，证实luterion具有如图8所示的双膜或多膜结构。
(2)染色特性
分别使用Mito-tracker、罗丹明123、詹纳斯绿B对于实施例1中获得的具有约50nm至约800nm尺寸的luterion进行染色，并且观察是否存在染色。因此，证实使用Mito-tracker、罗丹明123以及詹纳斯绿B的染色为阳性(见图2、3以及5)。
(3)自发荧光
实施例1中所获得的具有约50nm至800nm尺寸的luterion表现如荧光照片中所观察到的光反应(见图4)。
(4)分析luterion中RNA的存在
如图9所示，由于实施例1中分离的具有200nm至400nm尺寸的 luterion的原子显微镜成像的结果，能推断luterion中含有核酸如RNA或DNA。
将QIAGEN试剂盒(AllPrep DNA/RNA micro kit：目录80284)用于从实施例1中分离的200nm至400nm luterion分离总RNA和DNA，然后使用 Experion RNA(DNA)StdSens(Bio-Rad)芯片对于终产物进行定量。
在离心(8000g，90分钟)和收集luterion之后，将试剂盒中所含有的3.5 μlβ-巯基乙醇和50μl降解缓冲液RLT+(异硫氰酸胍，洗涤剂)与收集的 luterion一起混合，并且使所产生的样品穿过带有20号针头的注射器5至10 次以匀化luterion。将样品降解缓冲液转移至AllPrep DNA旋转柱，然后离心(≥8000g，15秒)以将沉积于柱子上的DNA与穿过柱子的含有RNA的缓冲液分离。
首先，将350μl 70％乙醇添加至相同体积的穿过柱子的缓冲液，充分混合，然后将700μl混合物转移至RNA酶MinElute旋转柱，离心(≥8000g， 15秒)，并且移除穿过柱子的缓冲液。分别使用700μl RW1、500μl RPE缓冲液以及80％乙醇顺序进行洗柱。本文所使用的所有离心(≥8000g，15秒) 在相同条件下进行。为了获得RNA，将14μl无RNA酶的溶液添加至柱子，之后离心(≥8000g，60秒)以分离luterion RNA。
在用于基因组DNA的第一步中，分别使用500μl AW1和500μl AW2 洗涤附着于AllPrep DNA旋转柱的DNA。如上所述的所有离心速率(≥8000g， 15秒)和时间均用于RNA分离。在将50μl EB缓冲液置入柱子中后，置于室温2至5分钟，进行离心(≥8000g，60秒)以分离luterion DNA。由于使用 Experion RNA(DNA)StdSens(Bio-Rad)芯片定量的结果，如图10a和10b所示证实luterion中包含RNA，luterion中还含有DNA。尤其，证实在200至 400nmluterion中包含含有RNA和DNA。
实施例5：luterion的培养
(1)将PBS添加至实施例1中所获得的具有约50nm至200nm尺寸的 luterion，使用红外线光辐射，并且在18℃至30℃培养约3小时。在红外线光辐射之后，立即使用显微镜以约1小时的间隔观察luterion的尺寸。在约 1小时至约6小时之后，证实在培养前具有约200nm尺寸的luterion生长至约500nm。因此，发现当将水添加至luterion，并在红外线光辐射下于18℃至30℃培养时，其尺寸可以生长高达约500nm。
(2)将PBS添加至实施例1中所获得的具有约400nm至800nm尺寸的luterion，使用红外线光辐射，并且在18℃至30℃培养约3小时。在红外线光辐射之后，立即使用显微镜以约1小时的间隔观察luterion的尺寸和状态。在约1小时至约6小时之后，证实在培养前具有约400nm至约800nm尺寸的luterion尺寸并未生长，而是以经历分裂替代。
(3)使用补充浓度为5％的葡萄糖的培养基(DMEM或血培养基)在pH 7 和20℃的温度培养luterion。进行红外线辐射以检测聚集的luterion。luterion 分别结合抗-CD332抗体、抗-CD73抗体、抗-CD133以及抗-CD39，然后结合使用FITC标记的二级抗体。由此，对于显示荧光的luterion进行计数。另外，对于使用mitotacker染色的luterion进行计数。结果示于下表10(+表示 luterion数量的相对比)。
[表10]
培养前 3周
朝鲜当归 + +++
漆树 + +++
猕猴桃 + +++
实施例6：将luterion引入细胞内的鉴定
分别使用PKH26-1、PKH26-2以及PKH26-3红色荧光对于luterion进行荧光染色，并且将其与A549非小细胞肺癌细胞(ATCC#：CCL-185)一起温育24小时。固定细胞并使用显微镜观察其形态学。结果示于图14至16。
参照图14，发现使用PKH26-1、PKH26-2以及PKH26-3染成红色的 luterion被引入细胞处于DAPI染色的细胞内细胞核周围。图15和16中的放大图像进一步证实luterion进入细胞内。
实施例7：穿过血脑屏障(BBB)的鉴定
向小鼠腹腔内注射(IP)或通过口腔管饲PKH26染色的荧光luterion，以证实所施用的luterion是否穿过BBB。根据图17，能够证实在至少3小时之后，luterion经口腔管饲穿过BBB。
根据图18，能够证实当腹腔内注射时，luterion在5分钟之内穿过BBB。根据图19，能够观察到即使自腹腔内注射24小时之后，其仍分布在心脏、肺脏、脾脏、肝脏、胰腺、肾脏、睾丸、腹部以及全身。
实施例8：luterion抗癌作用的鉴定(端粒/端粒酶活性)
(1)癌细胞端粒酶活性的抑制
将1×106个细胞/ml的正常细胞(成纤维细胞)和癌细胞(NCl-H1975, MDA-MA-468,WiDr)分别接种于60mm培养板，并且在约12小时之后，以 50μg/ml的浓度处理实施例1中分离的luterion并进行培养。在37℃和5％ CO2的培养箱中及在在缺乏抗生素PSF(抗生素-抗真菌剂)的1％FBS下进行细胞培养。在细胞接种之后48小时使用1％FBS DMEM培养基收获各细胞以获得端粒酶活性。
通过TRAP测定(
Figure BDA0003509298580000271
端粒酶检测试剂盒(Millipore))进行的端粒酶活性分析揭示通过luterion处理降低癌细胞(NCl-H1975，MDA-MA-468， WiDr)的端粒酶表达和活性(见图20B)。
此外，由于对于正常细胞，成纤维细胞，进行相同实验和分析，证实与对照组(未使用luterion处理的组)相比人类正常细胞的端粒酶表达和活性增加(见图20A)。
(2)通过使用luterion处理抑制癌细胞的增殖
在几种类型人癌细胞系(肺癌(NCl-H1975)、结肠癌(WiDr)、乳腺癌 (MDA-MB-486)、肝癌(HCC38)以及白血病(AGH-77))以及正常细胞系(成纤维细胞)进行MTT测定以测量luterion针对癌细胞的细胞毒性。
将10μl 5×104个细胞/ml(8×103/孔)的细胞悬浮液接种至具有平底的微量滴定板的96孔的各孔，培养24小时，然后替换包含不同浓度的luterion 的培养基，再培养48小时。然后，将使用培养基稀释10倍的100μl无水黄色MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)溶液添加至各孔。将细胞储存在37℃和5％CO2浓度的培养箱中以产生甲臜(formazan)晶体。在约4小时之后，去除额外的培养基，并且将200μl DMSO添加至各孔以溶解细胞中形成的非水溶性甲臜，然后使用微孔板读数仪在595nm分析吸光度。
将各浓度癌细胞的存活率作为未使用luterion处理的对照组的吸光度的 100％进行测量，并且癌细胞的存活率以浓度依赖性方式降低。另一方面，正常细胞中无细胞毒性(见图21)。
此外，除了上述癌细胞系外，还在AsPC-1胰腺癌细胞系、A549肺癌细胞系以及BT-20乳腺癌细胞系中证实了不同来源的luterion的癌细胞增殖抑制作用。以与上述MTT测定相同的方式测量细胞活力，通过实施例1的方法分离的不同来源的luterion显示对于癌细胞的增殖抑制作用(图22至24)。
因此，发现本公开的luterion能够通过抑制癌细胞增殖而预防或治疗癌症。
实施例9：luterion增加正常细胞中的端粒酶激活
将1×106个细胞/ml的正常细胞(成纤维细胞)分别接种于60mm培养板，在约12小时之后，以50μg/ml的浓度将实施例1中分离的luterion添加至各孔。在37℃和5％CO2的培养箱中使用缺乏抗生素PSF(抗生素-抗真菌剂) 的1％FBS DMEM培养基进行细胞培养。在细胞接种之后48小时收获，测量端粒酶活性。
通过TRAP测定(
Figure BDA0003509298580000281
端粒酶检测试剂盒(Millipore))进行的端粒酶活性分析揭示通过luterion处理增加正常细胞(成纤维细胞)的端粒酶表达和活性(见图25)。
实施例10：luterion对于ATP产生的作用
为了证实通过使用luterion处理增加癌细胞和成纤维细胞正常细胞中的 ATP产生，分别将1×106个细胞/ml的三种类型癌细胞A549、WTM266-4以及AsPC-1和正常细胞(MRC-5)接种至60mm常规DMEM培养基的培养板，然后培养1天，之后再使用无抗生素-抗真菌剂(PSF)的0.1％FBS DMEM培养基于血清饥饿状态培养1天。在此后第三天，以50μg/ml浓度添加实施例1 中所分离的luterion，然后分别在0分钟、10分钟、30分钟以及120分钟测量ATP产生(见图26)。ATP检测试剂盒购自Abcam(Cambridge,MA,USA)。
结果证实在使用luterion处理的正常细胞中ATP的产生显著增加(见图 39)。此外，证实在使用luterion处理的癌细胞中ATP产生降低(见图38)。
因此，发现本公开的luteiron能够通过增加正常细胞的能量产生而抑制衰老。此外，其能够降低癌细胞的能量产生以用于癌症治疗。因此，可以考虑癌细胞特异性化学治疗而不影响正常细胞。
工业实用性
根据本公开，能够有效分离作为存在于植物或食物中的微物质的luterion，并培养所分离的luterion至具有预定尺寸，由此开发了用于预防和治疗疾病的多种用途。
如上所述，详细描述了本公开，但是对于本领域技术人员显而易见的是，该具体说明仅仅是优选的实施方式，并且本公开的范围并非局限于此。因此，本公开的实际范围将由所附权利要求及其等同方案来定义。
更具体地，本申请提供下列各项：
1.具有选自如下特性中的至少一种特性的luterion：
(a)具有50nm至800nm尺寸的圆形或椭圆形，并且具有迁移性；
(b)具有核酸；
(c)当免疫化学荧光染色时显示与线粒体相似的反应；
(d)表现融合和/或分裂生物学现象；
(e)在不融合的情况下成熟至尺寸高达500nm，成熟为含有DNA的假线粒体，并且在通过扫描电子显微镜(SEM)或透射电子显微镜(TEM)获得的图像上显示线粒体样结构；
(f)显示不同于外来体的光反应；
(g)当红外线辐射或加压时经历分裂；
(h)表达CD332、CD133、CD73或CD39作为表面抗原；
(i)表现自发荧光：
(j)产生200nm至400nm尺寸的ATP；
(k)具有双膜结构或多膜结构；
(l)显示粘附性：
(m)抑制癌细胞的端粒酶活性；
(n)促进正常细胞的端粒酶活性；
(o)显示细胞渗透性；以及
(p)显示血脑屏障(BBB)渗透性。
2.根据项1所述的luterion，其中，所述luterion被选自下组的一种或多种染料阳性染色：罗丹明123、Mito-tracker(线粒体荧光探针)、吖啶橙、DAPI 以及詹纳斯绿B。
3.一种分离luterion的方法，其包括如下步骤：
(a)将通过冷却由煮沸食物或植物的提取物获得的水蒸汽或气体而获得的冷凝液使用具有0.8μm至1.2μm孔径的过滤器过滤；
(b)离心所过滤的冷凝液；以及
(c)从所离心的上清液中分离所述luterion。
4.根据项3所述的方法，其中，所述植物是选自表1至4的药用植物。
5.根据项3所述的方法，其中，所述植物选自朝鲜当归(angelica gigas)、漆树(rhois vernicifluae)以及猕猴桃(kimifruit)。
6.根据项3所述的方法，其中，所述煮沸提取通过将溶剂添加至植物或食物中并煮沸同时在50℃至90℃使用气体间歇鼓泡而进行。
7.根据项6所述的方法，其中，所述煮沸提取通过煮沸8至10小时和每2至3小时鼓泡20至30分钟来防止植物或食物的luterion缠绕而进行
8.根据项3所述的方法，其进一步包括使用红外线辐射所述步骤(a)中获得的所述冷凝液。
9.根据项3所述的方法，其中，以1200g至5000g重复进行所述步骤 (b)中的离心5至10分钟。
10.根据项3所述的方法，其中，所述步骤(c)是通过如下分离luterion 的步骤：辐射具有200μm至600μm波长的红外线光和分离具有迁移性的聚集的luterion颗粒，或者分选结合识别表面抗原如CD39、CD73、CD133或 CD332的luterion的颗粒的luterion。
11.根据项3所述的方法，其进一步包括使用小于50nm孔的过滤器过滤所分离的luterion颗粒，然后收集捕获于所述过滤器上的未滤过物质。
12.根据项11所述的方法，其进一步包括顺序使用200nm、400nm、 600nm、800nm以及1000nm的过滤器分别将尺寸为50nm至200nm、200 nm至400nm、400nm至600nm、600nm至800nm以及800nm至1000nm 的luterion分类。
13.根据项3所述的方法，其进一步包括在pH 7或更低和0℃或更低固定的步骤。
14.根据项3所述的方法，其进一步包括在pH 1至5和-90℃至0℃固定的步骤。
15.根据项3所述的方法，其进一步包括通过施加25,000-35,000psi(磅 /平方英寸)的压力诱导分裂的步骤。
16.根据项3所述的方法，其进一步包括通过在pH 1至3和10℃至20℃诱导分裂而增殖所述luterion的步骤。
17.一种分离所述luterion的方法，其包括如下步骤：
(a)将颗粒添加至包含所述luterion的提取物，以诱导所述颗粒与所述 luterion的结合，所述颗粒中具有特异性结合所述luterion表面抗原的固定的抗体或适体；以及
(b)回收与所述颗粒结合的luterion。
18.根据项17所述的方法，其进一步包括从luterion结合的所述颗粒中回收所述luterion的步骤。
19.根据项17所述的方法，其中，所述包含luterion的提取物是食物或植物的提取物。
20.根据项17所述的方法，其中，所述包含luterion的提取物是(i)食物或植物的热水提取物，(ii)食物或植物的溶剂提取物，或(iii)在溶剂的存在下通过加热食物或植物产生的气体的冷凝液。
21.根据项20所述的方法，其中，所述冷凝液通过如下制备：(i)将蒸馏水添加至植物或食物，并煮沸同时在50℃至90℃使用气体间歇鼓泡，以及收集通过煮沸蒸发的水蒸汽或气体，并冷却以获得冷凝液。
22.根据项17所述的方法，其中，所述luterion表面抗原是CD39、CD73、 CD133或CD332。
23.根据项17所述的方法，其中，所述颗粒选自下组：磁性颗粒、二氧化硅颗粒、量子点颗粒、玻璃颗粒、聚合物颗粒、纤维颗粒和荧光颗粒。
24.根据项23所述的方法，其中，所述磁性颗粒选自下组：铁、铝、钴、镍、锰、锡、锌、镉、镁、铜、钡、锂以及钇的氧化物。
25.根据项23所述的方法，其中，所述磁性颗粒用官能团双包覆用于结合抗体或适体。
26.根据项25所述的方法，其中，所述官能团选自下组：酰胺基、酯基、胺基、羧基。
27.根据项17所述的方法，其中，所述颗粒具有10nm至1,000nm的尺寸。
28.根据项17所述的方法，其中，所述颗粒是磁性纳米颗粒，并且所述步骤(b)包括通过外部应用的磁性收集与所述luterion结合的磁性纳米颗粒，然后回收与所述颗粒结合的luterion。
29.根据项17所述的方法，其中，所述颗粒是荧光颗粒，并且所述步骤 (b)包括使用荧光激活的细胞分选仪回收与所述luterion结合的颗粒。
30.根据项17所述的方法，其中，所述颗粒是静电带电颗粒，并且所述步骤(b)包括通过施加不均匀电场经由静电吸引回收所述与luterion结合的颗粒。
31.根据项17所述的方法，其中，所述颗粒是离子颗粒，并且所述步骤 (b)包括使用静电吸引回收所述与luterion结合的离子颗粒。
32.一种培养根据项1所述的luterion的方法，其包括将水添加至所述 luterion，以及在红外线光辐射下或压力下于18℃至30℃增殖。
33.一种培养根据项1所述的luterion的方法，其包括在pH 5-9和18℃至30℃于含有糖的培养基中增殖所述luterion。
34.根据项33所述的方法，其中，所述糖是鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、果糖或木糖。
35.根据项32或33所述的方法，其中，在培养之前所述luterion的尺寸是50nm至200nm，在培养之后所述luterion的尺寸是300nm至500nm。

Claims (35)

1.具有选自如下特性中的至少一种特性的luterion：
(a)具有50nm至800nm尺寸的圆形或椭圆形，并且具有迁移性；
(b)具有核酸；
(c)当免疫化学荧光染色时显示与线粒体相似的反应；
(d)表现融合和/或分裂生物学现象；
(e)在不融合的情况下成熟至尺寸高达500nm，成熟为含有DNA的假线粒体，并且在通过扫描电子显微镜(SEM)或透射电子显微镜(TEM)获得的图像上显示线粒体样结构；
(f)显示不同于外来体的光反应；
(g)当红外线辐射或加压时经历分裂；
(h)表达CD332、CD133、CD73或CD39作为表面抗原；
(i)表现自发荧光：
(j)产生200nm至400nm尺寸的ATP；
(k)具有双膜结构或多膜结构；
(l)显示粘附性：
(m)抑制癌细胞的端粒酶活性；
(n)促进正常细胞的端粒酶活性；
(o)显示细胞渗透性；以及
(p)显示血脑屏障(BBB)渗透性。
2.根据权利要求1所述的luterion，其中，所述luterion被选自下组的一种或多种染料阳性染色：罗丹明123、Mito-tracker(线粒体荧光探针)、吖啶橙、DAPI以及詹纳斯绿B。
3.一种分离luterion的方法，其包括如下步骤：
(a)将通过冷却由煮沸食物或植物的提取物获得的水蒸汽或气体而获得的冷凝液使用具有0.8μm至1.2μm孔径的过滤器过滤；
(b)离心所过滤的冷凝液；以及
(c)从所离心的上清液中分离所述luterion。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述植物是选自表1至4的药用植物。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述植物选自朝鲜当归(angelica gigas)、漆树(rhois vernicifluae)以及猕猴桃(kimifruit)。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述煮沸提取通过将溶剂添加至植物或食物中并煮沸同时在50℃至90℃使用气体间歇鼓泡而进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述煮沸提取通过煮沸8至10小时和每2至3小时鼓泡20至30分钟来防止植物或食物的luterion缠绕而进行。
8.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括使用红外线辐射所述步骤(a)中获得的所述冷凝液。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，以1200g至5000g重复进行所述步骤(b)中的离心5至10分钟。
10.根据权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(c)是通过如下分离luterion的步骤：辐射具有200μm至600μm波长的红外线光和分离具有迁移性的聚集的luterion颗粒，或者分选结合识别表面抗原如CD39、CD73、CD133或CD332的luterion的颗粒的luterion。
11.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括使用小于50nm孔的过滤器过滤所分离的luterion颗粒，然后收集捕获于所述过滤器上的未滤过物质。
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括顺序使用200nm、400nm、600nm、800nm以及1000nm的过滤器分别将尺寸为50nm至200nm、200nm至400nm、400nm至600nm、600nm至800nm以及800nm至1000nm的luterion分类。
13.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括在pH 7或更低和0℃或更低固定的步骤。
14.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括在pH 1至5和-90℃至0℃固定的步骤。
15.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括通过施加25,000-35,000psi(磅/平方英寸)的压力诱导分裂的步骤。
16.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括通过在pH 1至3和10℃至20℃诱导分裂而增殖所述luterion的步骤。
17.一种分离所述luterion的方法，其包括如下步骤：
(a)将颗粒添加至包含所述luterion的提取物，以诱导所述颗粒与所述luterion的结合，所述颗粒中具有特异性结合所述luterion表面抗原的固定的抗体或适体；以及
(b)回收与所述颗粒结合的luterion。
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括从luterion结合的所述颗粒中回收所述luterion的步骤。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述包含luterion的提取物是食物或植物的提取物。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述包含luterion的提取物是(i)食物或植物的热水提取物，(ii)食物或植物的溶剂提取物，或(iii)在溶剂的存在下通过加热食物或植物产生的气体的冷凝液。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述冷凝液通过如下制备：(i)将蒸馏水添加至植物或食物，并煮沸同时在50℃至90℃使用气体间歇鼓泡，以及收集通过煮沸蒸发的水蒸汽或气体，并冷却以获得冷凝液。
22.根据权利要求17所述的方法，其中，所述luterion表面抗原是CD39、CD73、CD133或CD332。
23.根据权利要求17所述的方法，其中，所述颗粒选自下组：磁性颗粒、二氧化硅颗粒、量子点颗粒、玻璃颗粒、聚合物颗粒、纤维颗粒和荧光颗粒。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述磁性颗粒选自下组：铁、铝、钴、镍、锰、锡、锌、镉、镁、铜、钡、锂以及钇的氧化物。
25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述磁性颗粒用官能团双包覆用于结合抗体或适体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述官能团选自下组：酰胺基、酯基、胺基、羧基。
27.根据权利要求17所述的方法，其中，所述颗粒具有10nm至1,000nm的尺寸。
28.根据权利要求17所述的方法，其中，所述颗粒是磁性纳米颗粒，并且所述步骤(b)包括通过外部应用的磁性收集与所述luterion结合的磁性纳米颗粒，然后回收与所述颗粒结合的luterion。
29.根据权利要求17所述的方法，其中，所述颗粒是荧光颗粒，并且所述步骤(b)包括使用荧光激活的细胞分选仪回收与所述luterion结合的颗粒。
30.根据权利要求17所述的方法，其中，所述颗粒是静电带电颗粒，并且所述步骤(b)包括通过施加不均匀电场经由静电吸引回收所述与luterion结合的颗粒。
31.根据权利要求17所述的方法，其中，所述颗粒是离子颗粒，并且所述步骤(b)包括使用静电吸引回收所述与luterion结合的离子颗粒。
32.一种培养根据权利要求1所述的luterion的方法，其包括将水添加至所述luterion，以及在红外线光辐射下或压力下于18℃至30℃增殖。
33.一种培养根据权利要求1所述的luterion的方法，其包括在pH 5-9和18℃至30℃于含有糖的培养基中增殖所述luterion。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述糖是鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、果糖或木糖。
35.根据权利要求32或33所述的方法，其中，在培养之前所述luterion的尺寸是50nm至200nm，在培养之后所述luterion的尺寸是300nm至500nm。
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