CN117281166A - 一种生牛乳中细胞外囊泡的分离方法 - Google Patents

一种生牛乳中细胞外囊泡的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生牛乳中细胞外囊泡的分离方法，属于食品领域。一种生牛乳中细胞外囊泡的分离方法，维持生牛乳温度为4℃，将生牛乳进行至少两次离心分离，均收集中间层液A；将中间层液A的pH调节至4.6搅拌至沉淀完全，收集上清液B，将上清液B离心以沉淀酪蛋白，收集上清液C，过滤，得到滤液D；将滤液D进行超速离心，收集离心管底部果冻状沉淀上的一层疏松颗粒；将疏松颗粒在PBS中复溶，并继续进行超速离心，收集底部颗粒状沉淀即为细胞外囊泡。与传统未经酸化前处理的超速离心、超速离心结合密度梯度离心或试剂盒等方法相比，该方法的细胞外囊泡得率和纯度更高，并且减少了提取时间，降低了提取成本。

Description

一种生牛乳中细胞外囊泡的分离方法
技术领域
本发明涉及一种生牛乳中细胞外囊泡的分离方法，属于食品领域。
背景技术
细胞外囊泡是由各种类型细胞分泌的膜状囊泡，可以在大多数真核细胞生物的血液、尿液、乳汁等体液中找到。根据细胞外囊泡的尺寸大小可分为外泌颗粒(<50nm)，外泌体(30-150nm)，微泡/脱落微泡(100-1000nm)，凋亡小体(1000-5000nm)，迁移体(500-3000nm)，以及大的致癌体(1000-10000nm)。牛奶中存在丰富的细胞外囊泡，它们是具囊泡状结构的小球，外部是脂质双层膜的壳结构，表面含有多种特异性蛋白。内部是亲水的核内腔，携带来自母体细胞的多种功能性货物，包括核酸、蛋白质等。细胞外囊泡由于其独特的结构，可以作为多种药物分子的载体，包括紫杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、姜黄素等具有抗癌、降压降脂、抗氧化等功能活性的药物分子。细胞外囊泡在体内具有高生物相容性、低免疫原性以及低毒性副作用。并且牛乳来源的细胞外囊泡含量丰富，是培养细胞来源细胞外囊泡产量的200倍以上，因此牛乳是能够实现规模化生产细胞外囊泡的理想来源。
目前细胞外囊泡的分离方法主要包括超速离心、密度梯度离心、超滤离心、免疫亲和捕获、尺寸排阻色谱、微流控技术以及使用试剂盒等，或是这些方法的组合应用。超速离心法是分离细胞外囊泡的经典方法，但仅通过该方法获得的细胞外囊泡纯度较低。密度梯度离心通常与超速离心相结合使用，作为超速离心后的纯化步骤，这样获得的细胞外囊泡纯度有所提高。然而，二者结合的方法繁琐费时，不适用于大批量的生产。免疫亲和捕获是基于细胞外囊泡表面的特异性蛋白，利用抗原抗体原理实现有针对性性地捕获。该方法获得的细胞外囊泡纯度非常高，但是缺点是价格昂贵。此外，获得的细胞外囊泡上还会偶联外源抗体，洗脱不彻底会造成污染。尺寸排阻色谱是基于细胞外囊泡的流体动力学半径的大小进行分离的，该方法分离速度快，获得细胞外囊泡同样纯度较高，但价格昂贵。微流控是新发开用于细胞外囊泡分离的技术，尽管能够克服纯度低的问题但目前应用仍不成熟。利用基于沉淀原理的试剂盒可以快速简便的获得细胞外囊泡，成本低，但细胞外囊泡纯度低是难以扩大使用的问题。这些分离技术多是针对分离培养细胞来源外泌体进行开发的，牛乳中含有大量的脂肪和蛋白质，因此，需要在传统分离方法的基础上进行改进。
目前分离牛乳中细胞外囊泡的方法大多是几种传统方法的组合，包括超速离心+密度梯度离心、超速离心+超滤离心等。分离操作繁琐费时，使用特异性抗体、排阻色谱或微流控芯片则面临价格高昂的问题。因此，寻找一种针对牛乳样品的快速、简便、成本较低且获得细胞外囊泡纯度较高的分离方法显得尤为重要。
发明内容
为解决上述现有技术的不足之处，本发明提供了一种分离生牛乳中细胞外囊泡的方法。
一种生牛乳中细胞外囊泡的分离方法，维持生牛乳温度为4℃，将生牛乳进行至少两次离心分离，均收集中间层液A；将中间层液A的pH调节至4.6搅拌至沉淀完全，收集上清液B，将上清液B离心以沉淀酪蛋白，收集上清液C，过滤，得到滤液D；将滤液D进行超速离心，收集离心管底部果冻状沉淀上的一层疏松颗粒；将疏松颗粒在PBS中复溶，并继续进行超速离心，收集底部颗粒状沉淀即为细胞外囊泡。
优选地，将生牛乳3000-4000rpm/min、4℃下离心30min，收集中间层液；将中间层液在5000-7000rpm/min、4℃下离心30min，收集中间层液A；将中间层液A的pH调节至4.6，搅拌至沉淀完全，收集上清液B。
优选地，将调节pH后的上清液B在8000-10000rpm/min，4℃下离心30min以沉淀大酪蛋白，收集上清液C。
优选地，将上清液C依次通过0.45μm和0.22μm的滤膜进行过滤，得到滤液D；滤液D在100000-110000xg，4℃下超速离心1h，收集离心管底部果冻状沉淀上的一层疏松颗粒；将疏松颗粒在PBS中复溶，在130000-140000xg，4℃下超速离心1.5h，收集底部颗粒状沉淀即为细胞外囊泡。
优选地，再次将利用PBS复溶所得细胞外囊泡，并于4℃中储存。
优选地，使用1.5mol/L的冰醋酸将调节pH至4.6。
优选地，所述PBS的浓度为0.01mol/L，并在使用前通过0.22μm滤膜进行过滤。
本发明的另一目的是提供一种高负载蓝莓花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂的制备方法。
一种高负载蓝莓花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂的制备方法，将所得细胞外囊泡用PBS稀释，使细胞外囊泡蛋白浓度达到1.2mg/mL，稀释后取1.8mL加入1.0mL的2mg/mL蓝莓花色苷粗提物溶液，得混合溶液。再将所得混合溶液pH调至4.0后再加入皂苷溶液，室温孵育2h后离心分离，得负载花色苷的细胞外囊泡制剂。
优选地，所述PBS浓度为0.01mol/L，使用前经过0.22μm滤膜过滤。
优选地，所述蓝莓花色苷粗提物溶液，由pH＝3的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解蓝莓花色苷粗提物粉末而得，使花色苷终浓度为2mg/mL。
进一步地，浓度为2mg/mL的花色苷粗提物溶液超声助溶，然后经0.22μm滤膜过滤。
优选地，所述pH调节剂选择冰醋酸。
优选地，所述皂苷溶液浓度为20mg/mL，加入量为混合溶液:皂苷溶液＝45.6:1(v:v)。
优选地，所得混合溶液置于超滤管内管中，在4000rpm/min下离心45min以除去游离的花色苷，收集内管中液体，即为负载花色苷的细胞外囊泡制剂。
优选地，所述超滤管型号为Merck Millipore UFC801096，大小为10K。
进一步地，吸取100μLpH＝4.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冲洗超滤管内部残留液体并回收。
本发明的另一目的是提供一种高生物活性的负载花色苷细胞外囊泡制剂的制备方法。
一种高生物活性的负载花色苷细胞外囊泡制剂的制备方法，将所得细胞外囊泡用PBS稀释，使细胞外囊泡蛋白浓度达到1.2mg/mL，稀释后取1.8mL加入1.0mL的2mg/mL蓝莓花色苷粗提物溶液，得混合溶液。再将所得混合溶液pH调至2.81后放入超声细胞破碎仪进行超声处理，超声条件为：Ampl：20％；Engry：2kJ：Pulse：4s开/2s关；反复6个周期。超声后37℃孵育2h，然后离心分离，得负载花色苷的细胞外囊泡制剂。
优选地，所述PBS浓度为0.01mol/L，使用前经过0.22μm滤膜过滤。
优选地，所述蓝莓花色苷粗提物溶液，由pH＝3的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解蓝莓花色苷粗提物粉末而得，使花色苷终浓度为2mg/mL。
进一步地，浓度为2mg/mL的花色苷粗提物溶液超声助溶，然后经0.22μm滤膜过滤。
优选地，所述pH调节剂选择冰醋酸。
优选地，将混合溶液放入超声细胞破碎仪进行超声处理，超声条件为：Ampl：20％；Engry：2kJ：Pulse：4s开/2s关；反复6个周期。
优选地，所得混合溶溶液置于超滤管内管中，在4000rpm/min下离心45min以除去游离的花色苷，收集内管中液体，即为负载花色苷的细胞外囊泡制剂。
优选地，所述超滤管型号为Merck Millipore UFC801096，大小为10K。
进一步地，吸取100μLpH＝2.81的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冲洗超滤管内部残留液体并回收。
本发明的有益效果为：本发明所述对生牛乳中细胞外囊泡的分离方法通过优化的条件对生牛乳进行酪蛋白等电沉淀，这一前处理步骤除去了生牛乳中大部分酪蛋白杂质，减少了后续超速离心的次数和时间，与传统未经酸化前处理的超速离心、超速离心结合密度梯度离心或试剂盒等方法相比，该方法的细胞外囊泡得率和纯度更高，并且减少了提取时间，降低了提取成本。从获得的细胞外囊泡的纯度和形态方面对其进行鉴定，包括测定粒径、电位和总蛋白浓度，以及透射电子显微镜观察形态，更加全面准确地保证分离细胞外囊泡的纯度。
本发明同时提供了两种所得细胞外囊泡的应用方法，其一提供了一种负载蓝莓花色苷的细胞外囊泡制剂的制备方法，有效提高了蓝莓花色苷的负载率。相比较其他载药方式，如室温孵育法和电穿孔法，该方法获得的制剂花色苷载药量更高，储藏条件下更稳定，因此更有利于体内吸收和利用。其二提供了一种可耐受胃肠道消化、高肠黏液层穿透性和抗氧化活性的负载花色苷细胞外囊泡制剂及其制备方法。与其他现有载药技术如室温孵育法和冻融循环法相比，本发明所述超声法制备的制剂尽管载药量不是最高，但其更耐受消化环境，并且更有利于穿透肠粘液，可以更高效地发挥蓝莓花色苷的抗氧化等健康促进功效。
附图说明
图1为生牛乳经等电沉淀处理并过滤后的上清液图片。(A)6mol/L盐酸处理组；(B)1.5mol/L冰醋酸处理组；(C)1.5mol/L柠檬酸处理组。
图2为细胞外囊泡的粒径和PDI。(A)和(B)为等电沉淀+差速离心法处理组；(C)和(D)为差速离心处理组。
图3为细胞外囊泡的电位值。PI+DC为等电沉淀+差速离心法处理组；DC为差速离心处理组。
图4为细胞外囊泡的透射电子显微镜图片。(A)为等电沉淀+差速离心法处理组；(B)为差速离心处理组。
图5为细胞外囊泡的总蛋白含量。(A)为蛋白浓度标准曲线；(B)PI+DC为等电沉淀+差速离心法处理组，DC为差速离心处理组。
图6为根据本发明实施例2方法与对比例2、3方法制备的负载花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂的粒径、PDI和电位值。
图7根据本发明实施例2方法与对比例2、3方法制备的负载花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂的载药量对比。
图8根据本发明实施例3方法与对比例2、4方法制备的负载花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂的体外模拟消化稳定性对比。
图9根据本发明实施例3方法与对比例2、4方法制备的负载花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂的肠黏液层穿透能力对比。
图10根据本发明实施例3方法与对比例2、4方法制备的牛乳细胞外囊泡负载花色苷制剂对RAW细胞ROS累积的影响。
图11根据本发明实施例3方法与对比例2、4方法制备的牛乳细胞外囊泡负载花色苷制剂对RAW细胞SOD活力的影响。
图12根据本发明实施例3方法与对比例2、4方法制备的牛乳细胞外囊泡负载花色苷制剂对RAW细胞CAT活力的影响
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
具体实施方式之一：
一种生牛乳中细胞外囊泡的分离方法，包括下述工艺步骤：
(1)采集健康奶牛的新鲜生牛乳，低温运输，然后保藏于4℃冰箱中备用；
(2)前处理：生牛乳在3000-4000rpm/min、4℃下离心30min，收集中间层液；中间层液在5000-7000rpm/min、4℃下离心30min，收集中间层液A；
(3)调节中间层液A的pH至4.6，搅拌至沉淀完全，收集上清液B；
(4)将上清液B在8000-10000rpm/min，4℃下离心30min以沉淀大部分酪蛋白，收集上清液C；
(5)上清液C依次通过0.45μm和0.22μm的滤膜进行过滤，得到滤液D；
(6)滤液D在100000-110000xg，4℃下超速离心1h，收集离心管底部果冻状沉淀上的一层疏松颗粒；
(7)将疏松颗粒在PBS中复溶，在130000-140000xg，4℃下超速离心1.5h，收集底部颗粒状沉淀即为细胞外囊泡；
(8)PBS复溶步骤(7)所得疏松颗粒，并于4℃中储存备用。
优选地，步骤(1)中采集生牛乳500mL，置于装有冰袋的保温箱中运输，然后立即保藏在4℃或-80℃的冰箱中备用。
优选地，步骤(2)中3000-4000rpm/min，4℃离心后上层为牛乳中的脂肪和细胞碎片，底部为一些蛋白质杂质，收集离心管中间层乳液；再次离心后同样收集中间层液进行后续分离。
优选地，步骤(3)中使用1.5mol/L的冰醋酸调节pH至4.6。
优选地，步骤(7)和(8)所述PBS的浓度为0.01mol/L，并在使用前通过0.22μm滤膜进行过滤。
优选地，步骤(1)所述低温冰箱型号为EppendrofU725-86；步骤(2)和(4)所述高速离心机型号为EppendrofAG；步骤(7)和(8)所述超速离心机型号为Optima XPN-100，转子型号为SW 32Ti，离心管型号为Ultra Clear open-top。
上述生牛乳中细胞外囊泡的鉴定方法如下，包括透射电镜观察鉴定和粒径分析鉴定，
(1)吸取10μL所得细胞外囊泡复溶液，滴加至100目的铜网上，静置后用滤纸从液珠边缘吸走多余液体；
(2)向步骤(1)所述铜网上滴加10μL磷钨酸，染色1-2min，而后用滤纸吸去染液，所述磷钨酸为染色液，使用前将蒸馏水溶解磷钨酸盐配制成0.5％-3％的溶液备用；
(3)室温干燥后进行透射电镜观察并拍照，所述透射电子显微镜型号为HitachiHT7700。
(4)分别吸取0.5mL所得细胞外囊泡复溶液，加入1mL PBS稀释后置于比色皿和电位池中，测定悬液中细胞外囊泡的粒径、PDI和电位值；
上述生牛乳中细胞外囊泡细胞外囊泡的蛋白浓度测定方法如下：
(1)制作标准曲线：配制标准品浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，取20μL标准品于96孔板中，再加入200μL BCA工作液，37℃恒温培养箱中孵育30min后用酶标仪在562nm处测定吸光度值。绘制标准曲线。
(2)取所得细胞外囊泡复溶液20μL于96孔板中，再加入200μL BCA工作液，37℃恒温箱中孵育30min后用酶标仪在562nm处测定吸光度值。根据标准曲线计算所得细胞外囊泡复溶液中细胞外囊泡的蛋白浓度。
恒温培养箱型号为GNP-9050E；酶标仪型号为Infinite M200 Pro。
实施例1
使用等电沉淀与差速离心相结合分离生牛乳中胞外囊泡的方法：
选择健康奶牛，采集新鲜生牛乳500mL，装入无菌袋内并置于装有冰袋的保温箱中。将牛乳样品运输至实验室后立即放入4℃的冰箱中保存待用，4h内处理，不能立即使用的样品放入无菌离心管中置于-80℃的超低温冰箱中保存。
取4℃中待用的生牛乳样品于离心管中，在3000rpm/min、4℃下离心30min。离心后收集离心管中间层乳，弃上层和底层沉淀，用来除去生牛乳中的大部分脂肪和少部分蛋白。将收集的中间层乳在6000rpm/min、4℃下再次离心30min，收集离心后离心管中间层乳，弃上层和底层沉淀，用来除去少部分脂肪、细胞碎片和少部分蛋白质。将收集的中间层乳置于烧杯中，加入酸(分别加入6mol/L的盐酸、1.5mol/L的冰醋酸或1.5mol/L的柠檬酸)调节pH至4.6，搅拌样品至呈现明显沉淀。将pH为4.6的乳汁样品加入离心管中，在9000rpm/min，4℃下离心30min，离心后收集离心管上层液体，弃底部沉淀，此步骤目的是使生牛乳中含量最高的酪蛋白达到等电点而沉淀，然后通过离心将其除去。除去大部分酪蛋白的上层液体依次通过0.45μm和0.22μm的滤膜进行过滤。过滤后的上清液如图1所示，图1(A)(B)(C)依次为使用6mol/L的盐酸、1.5mol/L的冰醋酸以及1.5mol/L的柠檬酸调节pH至4.6，并进行离心后收集的上清液图片。结果如图所示，使用1.5mol/L的冰醋酸调节pH得到的上清液更加澄清。因此，优选地，采用1.5mol/L的冰醋酸调节pH得到的上清液进行后续精纯操作。
过滤后的上清液置于超速离心管中，在110000xg，4℃下超速离心1h，弃去上清液，用0.01mol/L的PBS轻轻吹洗底部果冻状沉淀上方的一层疏松颗粒。收集含有疏松颗粒的PBS混合液于超速离心管中，并用PBS补足至距离心管0.5cm处，再次在135000xg，4℃下超速离心1.5h。离心后底部颗粒状沉淀即为细胞外囊泡。PBS复溶并收集细胞外囊泡，存于4℃冰箱中待用。
对比例1
仅使用差速离心分离生牛乳能够细胞外囊泡的方法：
对比例1与实施例1的操作完全相同，但不包括加入1.5mol/L的冰醋酸调节pH至4.6，搅拌样品至呈现明显沉淀这一步骤。
实施例1和对比例1的检测结果如下：
一、对实施例1和对比例1获得的细胞外囊泡进行粒径、PDI和电位的测定
将实施例1和对比例1中保存于4℃的细胞外囊泡+PBS混合液取出，吸取0.5mL于离心管中，加入0.01mol/LPBS1mL进行稀释，然后转移至比色皿中并在粒度仪中测定粒径和PDI。结果如图2所示，图2(A)(B)分别为实施例1中细胞外囊泡，即使用醋酸等电沉淀法+差速离心法获得的细胞外囊泡的粒径和PDI值，粒径为132.9nm左右，PDI为0.129±0.014，表明该方法分离的细胞外囊泡纯度较高。图2(C)(D)分别为对比例1中细胞外囊泡，即使用差速离心法获得的细胞外囊泡的粒径和PDI值，粒径在184.2nm左右，PDI为0.271±0.017，表明该方法分离的细胞外囊泡纯度较低。
将实施例1和对比例1中保存于4℃的细胞外囊泡+PBS混合液取出，吸取0.5mL于离心管中，加入0.01mol/L PBS 1mL进行稀释，然后转移至电位池中并在粒度仪中测定电位值。结果如图3所示，左为实施例1中细胞外囊泡，即使用醋酸等电沉淀法+差速离心法获得的细胞外囊泡的电位值，电位为-16.325±1.276mV，表明该方法分离的细胞外囊泡纯度较高。右为对比例1中细胞外囊泡，即使用差速离心法获得的细胞外囊泡的电位值，电位为-13.168±0.563mV，表明该方法分离的细胞外囊泡纯度较低。二、对实施例1和对比例1获得的细胞外囊泡进行形态观察
将实施例1和对比例1中保存于4℃的细胞外囊泡+PBS混合液取出，吸取10μL并滴加在100目的铜网上，静置2分钟后用滤纸从液珠边缘吸走多余的液体。再向铜网上滴加10μL 0.5％-3％的磷钨酸染色液，染色1-2min，而后用滤纸吸去染液。在室温下干燥，然后通过透射电镜观察并拍照。结果如图4所示，图4(A)为实施例1中细胞外囊泡，即使用醋酸等电沉淀法+差速离心法获得的细胞外囊泡的电镜图；图4(B)为对比例1中细胞外囊泡，即使用差速离心法获得的细胞外囊泡的电镜图。从图片可以看出实施例1的电镜图背景更干净，获得的细胞外囊泡纯度更高。
三、对实施例1和对比例1获得的细胞外囊泡进行总蛋白浓度的测定
配制标准品浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，取20μL标准品于96孔板中，再加入200μL BCA工作液，37℃恒温培养箱中孵育30min后用酶标仪在562nm处测定吸光度值。绘制标准曲线。将实施例1和对比例1中保存于4℃的细胞外囊泡+PBS混合液取出，吸取20μL于96孔板中，再加入200μLBCA工作液，37℃恒温箱中孵育30min后用酶标仪在562nm处测定吸光度值。根据标准曲线计算步骤(8)所得复溶液中细胞外囊泡的蛋白浓度。结果如图5所示，图5(A)为标准品蛋白浓度标准曲线，y＝0.0201x+0.0911，R2＝0.9994。图5(B)分别为使用醋酸等电沉淀法+差速离心法获得的细胞外囊泡的蛋白浓度13.133±0.283mg/mL，以及使用差速离心法获得的细胞外囊泡的蛋白浓度15.514±0.920mg/mL。数据表明差速离心法获得的样品中混有更多的蛋白质杂质，细胞外囊泡纯度更低。
实施例2
一、皂苷孵育载药方法的优化
取蓝莓花色苷粗提物粉末溶于pH＝3的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，调整浓度至2mg/mL。然后通过0.22μm滤膜过滤备用。取1.8mL细胞外囊泡+PBS的混合液(1.2mg/mL细胞外囊泡蛋白)加入1mL花色苷溶液，充分混合后加入冰醋酸调节pH。向调节pH后的混合液加入浓度为20mg/mL皂苷溶液，室温孵育2h。在此过程中，由于表面活性剂的存在使细胞外囊泡双层膜出现孔隙，蓝莓花色苷通过孔隙进入细胞外囊泡内部，并在37℃下利用脂质膜的流动性完成恢复，从而实现花色苷的包载。将孵育后的混合液置于超滤管的内管中，在在4000rpm/min下离心45min以除去游离的花色苷，收集外管中液体待用。收集内管中液体，即为负载了花色苷的细胞外囊泡制剂。
为确定最佳的载药条件以使细胞外囊泡负载花色苷的量达到最高，分别优化了花色苷的添加量、皂苷的添加量以及混合体系的pH，并进行了三因素三水平的响应面实验，实验设计分组如下表所示：
表1
pH 花色苷粗提物溶液添加量(μL) 皂苷溶液添加量(μL)
2.0 1000.0 75.0
2.0 650.0 50.0
2.0 650.0 100.0
2.0 300.0 75.0
3.0 650.0 75.0
3.0 1000.0 50.0
3.0 1000.0 100.0
3.0 300.0 100.0
3.0 300.0 50.0
4.0 650.0 100.0
4.0 650.0 50.0
4.0 300.0 75.0
4.0 1000.0 75.0
分别测定各组负载花色苷的细胞外囊泡制剂的载药量、蛋白回收率、粒径、PDI和电位。具体方法如下：
1、牛乳细胞外囊泡的花色苷载药量测定：
将各组皂苷孵育后的混合液置于超滤管的内管中，再在4000rpm/min下离心45min以除去游离的花色苷，取各组样品超滤管外管液体，加入pH＝4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至5mL，充分混匀后经0.22μm滤膜过滤。滤液装入进样瓶中，液相测定其中花色苷含量。
优选地，所述液相型号为ThermoFisher Ultimate 3000，柱子型号为Dikma-C18column(3.0mm*150mm,5μm)，柱温：40℃；检测波长：520nm；进样量：10μL，进样条件如下表所示：
表2
进一步地，使用上述液相方法测定C3G单体(10、20、40、80、100mg/mL)，绘制标准曲线得：
方程式y＝41.423x-47.61319，x单位：μg/mL，
相关系数(R)＝0.99964133
确定系数(R2)＝0.99928279
最大方差＝38.443207
将样品峰面积代入标准曲线计算出样品中花色苷的C3G当量，并计算出花色苷粗提物中花色苷的纯度。按如下公式计算载药量：
表3列出了不同载药条件(pH、花色苷添加量和皂苷添加量)牛乳细胞外囊泡负载花色苷制剂的载药量。
2、负载蓝莓花色苷牛乳细胞外囊泡制剂的蛋白回收率测定：
将各组皂苷孵育后的混合液置于超滤管的内管中，在在4000xg下离心45min以除去游离的花色苷，收集内管中液体，即为负载了花色苷的细胞外囊泡制剂。
取负载了花色苷的细胞外囊泡制剂800μL加入2mL乙腈溶液，充分混合后冰浴超声破碎40min。取超声后的混合液于9000rpm/min下离心20min，弃去上清液并向沉淀中加入120μL RIPA裂解液。涡旋震荡使沉淀溶解，使用BCA总蛋白测定试剂盒测定沉淀中的蛋白含量。
所述超声破碎功率为240W，RIPA裂解液购买于鼎国昌盛，BCA试剂盒购买于碧云天。
按如下公式计算蛋白回收率：
表3列出了不同载药条件(pH、花色苷添加量和皂苷添加量)牛乳细胞外囊泡负载花色苷制剂的蛋白回收率。
3、负载蓝莓花色苷牛乳细胞外囊泡制剂的粒径、PDI和电位测定：
取负载了花色苷的细胞外囊泡制剂500μL，再加入1mL PBS稀释后置于比色皿和电位池中，测定制剂的粒径、PDI和电位。表3列出了不同载药条件(pH、花色苷添加量和皂苷添加量)牛乳细胞外囊泡负载花色苷制剂的粒径、PDI和电位。
表3
二、牛乳细胞外囊泡对蓝莓花色苷负载
经响应面法计算得出皂苷孵育载药法的最佳处理条件如下表所示：
表4
pH 花色苷粗提物溶液添加量(μL) 皂苷溶液添加量(μL)
4.0 1000.0 61.4
取蓝莓花色苷粗提物粉末溶于pH＝3的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，调整浓度至2mg/mL。然后通过0.22μm滤膜过滤备用。取1.8mL细胞外囊泡+PBS的混合液(1.2mg/mL总蛋白)加入1mL花色苷溶液，充分混合后加入冰醋酸调节pH至4.0，然后加入与混合液体积比为45.6:1的皂苷溶液(20mg/mL)。在室温下充分混合并孵育2h。
将孵育后的混合液置于超滤管的内管中，在在4000rpm/min下离心45min以除去游离的花色苷，收集外管中液体待用。收集内管中液体，即为负载了花色苷的细胞外囊泡制剂。
对比例2
室温孵育法制备负载花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂：
为验证本发明所述制备方法较传统方法可获得更高的花色苷负载量，采用室温孵育法制备负载花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂，具体方法如下：取1.8mL实施例1中获得的牛乳细胞外囊泡+PBS混合液(1.2mg/mL总蛋白)与1mL花色苷粗提物溶液混合，充分混匀加入冰醋酸调节pH至4.0，在室温下孵育2h。将孵育后的混合液置于超滤管的内管中，再在4000rpm/min下离心45min以除去游离的花色苷，收集外管中液体待用。收集内管中液体，即为负载了花色苷的细胞外囊泡制剂。
对比例3
电穿孔法制备负载花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂：
为进一步验证本发明所述制备方法较传统方法可获得更高的花色苷负载量，采用电穿孔法制备负载花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂，具体方法如下：取1.8mL实施例1中获得的牛乳细胞外囊泡+PBS混合液(1.2mg/mL总蛋白)与1mL花色苷粗提物溶液混合，充分混匀加入冰醋酸调节pH至4.0。将调节pH后的混合液装入3mm电击杯中，在Gene Pulser Xcell电穿孔装置中进行电穿孔操作。电穿孔条件为：电容：350μF；电压：350V；电穿孔次数：6次。将电穿孔后的混合液置于超滤管的内管中，在在4000xg下离心45min以除去游离的花色苷，收集外管中液体待用。收集内管中液体，即为负载了花色苷的细胞外囊泡制剂。
实施例2、对比例2和对比例3的检测结果如下：
一、对实施例2、对比例2和对比例3获得的制剂进行粒径、PDI和电位的测定：
按照实施例2中一、(3)的步骤测定。结果如图6所示，6(A)三种制备方法制备制剂的粒径数量分布，可看出对比例2室温孵育法制备制剂的粒径更接近未处理的牛乳细胞外囊泡的粒径大小，皂苷法和电穿孔法制剂的粒径相对更大。6(B)和(C)分别为三种制剂的PDI和电位值，孵育法和皂苷法制剂的PDI值最低同时电位值较高，表示制剂稳定性较好。而电穿孔法稳定性较差。从结果可知，孵育法和皂苷法制剂的大小均一且稳定。
二、对实施例2、对比例2和对比例3获得的制剂进行花色苷载药量的测定：
按照实施例2中1(1)的步骤测定并计算载药量。结果如图7所示，与实施例2所述皂苷孵育载药法相比，室温孵育和电穿孔法的细胞外囊泡的花色苷载药量显著较低。
实施例3
牛乳细胞外囊泡对蓝莓花色苷负载：
取蓝莓花色苷粗提物粉末溶于pH＝3的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，调整浓度至2mg/mL。然后通过0.22μm滤膜过滤备用。取1.8mL细胞外囊泡+PBS的混合液(1.2mg/mL细胞外囊泡蛋白)加入1mL花色苷溶液，充分混合后加入冰醋酸调节pH至2.81。将调节pH后的混合液放入超声细胞破碎仪进行超声处理，超声条件为：Ampl：20％；Engry：2kJ：Pulse：4s开/2s关；反复6个周期。在此过程中，由于超声机械力使细胞外囊泡双层膜出现孔隙，蓝莓花色苷通过孔隙进入细胞外囊泡内部，并在37℃下利用脂质膜的流动性完成恢复，从而实现花色苷的包载。
将孵育后的混合液置于超滤管的内管中，在在4000rpm/min下离心45min以除去游离的花色苷，收集外管中液体待用。收集内管中液体，即为负载了花色苷的细胞外囊泡制剂。
对比例4
冻融循环法制备负载花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂：
为进一步验证本发明所述制备方法较传统方法可获得更高的花色苷负载量，采用冻融循环法制备负载花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂，具体方法如下：
取1.8mL实施例1中获得的牛乳细胞外囊泡+PBS混合液(1.2mg/mL总蛋白)与1mL花色苷粗提物溶液混合，充分混匀加入冰醋酸调节pH至2.81。将调节pH后的混合液装入离心管中，放入-80℃超低温冰箱中冷冻40min，再取出放入37℃恒温箱中融化恢复，反复4个循环。将冻融循环后的混合液置于超滤管的内管中，再在4000rpm/min下离心45min以除去游离的花色苷，收集外管中液体待用。收集内管中液体，即为负载了花色苷的细胞外囊泡制剂。
实施例3、对比例2和对比例4的检测结果如下：
一、对实施例3、对比例2和对比例4获得的制剂进行外模拟消化稳定性的测定
将3种负载了蓝莓花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂与模拟胃液(SGF)以1:1(v:v)的比例混合，调节pH至3.0，置于37℃恒温振荡器中孵育2h。然后取出混合液，再与模拟肠液(SIF)以1:1(v:v)的比例混合，调节pH至7.0，置于37℃恒温振荡器中孵育2h。分别在模拟胃、肠消化后取样，通过pH示差法用酶标仪测定样品中花色苷的保留率。
所述SGF组成为：6.9mmol/L KCl、0.9mmol/L KH2PO4、25mmol/LNaHCO3、47.2mmol/LNaCl、0.1mmol/L MgCl2(H2O)6、0.5mmol/L(NH4)2CO3、0.15mmol/L CaCl2(H2O)2。所述SIF组成为：6.8mmol/L KCl、0.8mmol/L KH2PO4、85mmol/L NaHCO3、38.4mmol/LNaCl、0.33mmol/LMgCl2(H2O)6、0.6mmol/L CaCl2(H2O)2。
如图8所示，EA表示负载了花色苷的细胞外囊泡制剂，A表示为游离的花色苷。结果显示，各组制剂都能在模拟消化液的环境下保护花色苷(与游离花色苷组相比)。超声法和冻融循环法相对于室温孵育法制备的制剂在胃液消化后具有较高的花色苷保留率，但是在经过肠液的消化后，只有超声法制备的制剂花色苷保留效果最好。
二、对实施例3、对比例2和对比例4获得的制剂进行人工肠黏液层穿透能力的测定
制备人工粘液层，然后将其放置在明胶块上，再将3种负载了蓝莓花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂铺在黏液层上方。在室温下培养24h，拍照记录花色苷在明胶中的渗透深度。从明胶块上吸出制剂，超纯水洗涤明胶下层6次，以完全去除粘液，然后加热至60℃，使固体明胶融化。6000rpm/min离心20min，使用pH示差法测定上清液中花色苷的含量。
对样品中花色苷的保留率进行比较。如图9所示，分别为超声法、室温孵育法和冻融循环法制备的EA以及A在明胶中的渗透图。通过对渗透深度的测定可知，超声法制备的制剂具有最好的黏液层渗透效果。
三、测定实施例3、对比例2和对比例4获得的制剂对RAW 264.7细胞中活性氧(ROS)累积的影响：
建立丙烯酰胺损伤的细胞模型：40mmol/L丙烯酰胺损伤RAW264.7细胞3h。
在丙烯酰胺损伤后，去除药物，加入20μg/mL的3种蓝莓花色苷牛乳细胞外囊泡制剂，孵育24h。然后去除所有培养液，PBS冲洗细胞3遍，再加入DCFH-DA染色液(终浓度为10μmol/L)，37℃下孵育20min。孵育结束后去除DCFH-DA染色液，用胰酶消化细胞并离心收集，PBS重悬细胞沉淀后用流式细胞仪测定荧光信号。
对样品中花色苷的保留率进行比较。如图10所示，(A)为各组样品荧光强度分布数量，(B)为各组样品荧光强度的定量分析。结果显示，丙烯酰胺可以诱导RAW264.7细胞发生ROS累积，超声法、室温孵育法和冻融循环法制备的制剂均可以不同程度的降低ROS的水平，但超声法显著好于其他两种制备方法获得的制剂。
四、测定实施例3、对比例2和对比例4获得的制剂对RAW 264.7细胞中过氧化氢酶(CAT)活力的影响：
将消化后的细胞悬液接种至24孔板中，使每孔细胞数目为5000左右。将24孔板放置于细胞培养箱中培养24h使细胞贴壁。贴壁后，向每孔中加入3种制剂，使孔内制剂中包封花色苷的浓度分别为0.5mg/mL、0.75mg/mL和1mg/mL。同时对照孔加入相同浓度的游离花色苷。加入制剂后放入细胞培养箱中孵育24h。24h后取出24孔板，吸出孔内培养基，向孔内加入80μLRIPA细胞裂解液。充分裂解孔底细胞后收集细胞与裂解液混合液。
使用BCA试剂盒(碧云天)测定上述混合液中裂解细胞的总蛋白浓度。使用CAT试剂盒(南京建成)测定上述混合液中裂解细胞内的CAT活力，具体方法如下：
取5μL混合液样品，加入100μL试剂一(提前37℃预热)，再加入10μL试剂二(提前37℃预热)，混匀并在37℃恒温箱中准确反应60s。反应后取出，加入100μL试剂三和4μL试剂四。充分反应后吸取200μL于96孔板中，在405nm下测定吸光度值。空白组将5μL混合液样品换成水，其余操作不变。按下式计算细胞中CAT的活力：)
细胞中CAT活力(u/mgprot)＝(空白组OD值-样品OD值)*235.65/(60*取样量)/BCA值(mgprot/mL)
对样品中花色苷的保留率进行比较。如图11所示，超声法、室温孵育法和冻融循环法制备的制剂均可以提高RAW264.7细胞中的CAT活力，但超声法显著好于其他两种制备方法。
五、测定实施例3、对比例2和对比例4获得的制剂对RAW 264.7细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响：
使用SOD试剂盒(南京建成)测定步骤四中获得的混合液中裂解细胞内的SOD活力，具体方法如下：
取5μL混合液样品，加入100μL试剂一应用液、10μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四应用液。混匀后在37℃中水浴40min，再加入200μL显色剂。混匀后吸取200μL于96孔板中，在550nm下测定吸光度值。空白组将5μL混合液样品换成水，其余操作不变。按下式计算细胞中SOD的活力：
细胞中总SOD活力(u/mgprot)＝(空白组OD值-样品OD值)/空白组OD值/50％*反应液总体积(mL)/取样量(mL)/BCA值(mgprot/mg)
对样品中花色苷的保留率进行比较。如图12所示，超声法、室温孵育法和冻融循环法制备的制剂均可以提高RAW264.7细胞中的SOD活力，但超声法显著好于其他两种制备方法。

Claims (9)

1.一种生牛乳中细胞外囊泡的分离方法，其特征在于：维持生牛乳温度为4℃，将生牛乳进行至少两次离心分离，均收集中间层液A；将中间层液A的pH调节至4.6搅拌至沉淀完全，收集上清液B，将上清液B离心以沉淀酪蛋白，收集上清液C，过滤，得到滤液D；将滤液D进行超速离心，收集离心管底部果冻状沉淀上的一层疏松颗粒；将疏松颗粒在PBS中复溶，并继续进行超速离心，收集底部颗粒状沉淀即为细胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将生牛乳3000-4000rpm/min、4℃下离心30min，收集中间层液；将中间层液在5000-7000rpm/min、4℃下离心30min，收集中间层液A；将中间层液A的pH调节至4.6，搅拌至沉淀完全，收集上清液B。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将调节pH后的上清液B在8000-10000rpm/min，4℃下离心30min以沉淀酪蛋白，收集上清液C。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将上清液C依次通过0.45μm和0.22μm的滤膜进行过滤，得到滤液D；滤液D在100000-110000xg，4℃下超速离心1h，收集离心管底部果冻状沉淀上的一层疏松颗粒；将疏松颗粒在PBS中复溶，在130000-140000xg，4℃下超速离心1.5h，收集底部颗粒状沉淀即为细胞外囊泡。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：再次将利用PBS复溶所得细胞外囊泡，并于4℃中储存。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：使用1.5mol/L的冰醋酸将调节pH至4.6。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PBS的浓度为0.01mol/L，并在使用前通过0.22μm滤膜进行过滤。
8.一种高负载蓝莓花色苷的牛乳细胞外囊泡制剂的制备方法，其特征在于：将权利要求1所得细胞外囊泡用PBS稀释，使细胞外囊泡蛋白浓度达到1.2mg/mL，稀释后取1.8mL加入1.0mL的2mg/mL蓝莓花色苷粗提物溶液，得混合溶液。再将所得混合溶液pH调至4.0后再加入皂苷溶液，室温孵育2h后离心分离，得负载花色苷的细胞外囊泡制剂。
9.一种高生物活性的负载花色苷细胞外囊泡制剂的制备方法，其特征在于：将权利要求1所得细胞外囊泡用PBS稀释，使细胞外囊泡蛋白浓度达到1.2mg/mL，稀释后取1.8mL加入1.0mL的2mg/mL蓝莓花色苷粗提物溶液，得混合溶液。再将所得混合溶液pH调至2.81后放入超声细胞破碎仪进行超声处理，超声条件为：Ampl：20％；Engry：2kJ：Pulse：4s开/2s关；反复6个周期。超声后37℃孵育2h，然后离心分离，得负载花色苷的细胞外囊泡制剂。
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