CN117482923A - 金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球的制备方法，其包括以下步骤：1)将中空玻璃微球加入食人鱼溶液，搅拌，静置后去除下层的碎片，用超纯水洗涤，烘干，得到产物A；2)往产物A加入聚乙烯亚胺溶液，混合反应，静置分离，上层漂浮物用超纯水洗涤，真空干燥，得到产物B；3)往2‑氨基对苯二甲酸、苯甲酸和ZrCl4中加入N，N‑二甲基甲酰胺，超声溶解，加入产物B，搅拌反应，静置分离，取上层漂浮物，用N，N‑二甲基甲酰胺和乙醇洗涤，真空干燥，即得。本发明制备的金属有机框架密集包裹的中空微球可作为通用型捕获探针，用于靶标细胞外囊泡、磷酸蛋白质组、磷酸肽、核酸和细胞的捕获检测与分析，在液体活检中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程技术和分析领域。更具体地说，本发明涉及一种金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球及其制备与应用。
背景技术
细胞外囊泡(EV)是由细胞释放到周围生物流体中的微囊泡，它的脂质双分子层包裹着原始肿瘤的各种成分，如蛋白质、核酸、代谢物、小分子、细胞器等。因此，在病理微环境下分泌的EV能够携带特定疾病阶段或损伤所特有的细胞内分子特征，是一种非入侵性癌症诊断和治疗监测的重要循环生物标志物。然而，循环肿瘤EV通常丰度低、大小和分子组成不均一，并且过度表达的蛋白并不一定具有癌症特异性，这使得EV难以被有效地分离和检测。所以，制备一种快速捕获和检测EV的材料，以实现对EV的表型分析是非常必要的。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明的一个目的是提供一种金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球的制备方法，其制备得到的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球能够实现对EV的快速捕获，为EV表面蛋白标志物的多元SERS分析提供了前提条件。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球的制备方法，其包括以下步骤：
1)将中空玻璃微球加入食人鱼溶液，搅拌，静置后去除下层的碎片，用超纯水洗涤，烘干，得到表面活化的中空玻璃微球；
2)往表面活化的中空玻璃微球加入聚乙烯亚胺溶液，混合反应，静置分离，上层漂浮物用超纯水洗涤，真空干燥，得到聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球；
3)往2-氨基对苯二甲酸、苯甲酸和ZrCl4中加入N，N-二甲基甲酰胺，超声溶解，加入聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球，搅拌反应，反应结束后静置分离，取上层漂浮物，并用N，N-二甲基甲酰胺和乙醇洗涤，真空干燥，得到具有漂浮能力的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球。
优选的是，步骤2)中，表面活化的中空玻璃微球与聚乙烯亚胺的质量比为100:3-24，在室温下旋转混合反应，反应时间为0.5-12h。
优选的是，步骤3)中，2-氨基对苯二甲酸、苯甲酸、ZrCl4、N，N-二甲基甲酰胺、聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球的质量比为1-3:30-50:1-3:150-250:1-3，搅拌反应的为90-160℃，反应时间是6-24h。
一种金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球，由本发明提供的制备方法制得。
一种细胞外囊泡的捕获方法，包括以下步骤：
i)提取细胞外囊泡；
ii)取所述的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球于离心管中，加入PBS缓冲液分散微球，加入步骤i)提取的细胞外囊泡，室温下涡旋混合反应，反应结束后，静置使微球复合物完全漂浮至溶液表面，将下层溶液去除，并用PBS缓冲液洗涤，加入1％ BSA溶液封闭活性位点，5-10min后分离洗涤3-5次，得到捕获有细胞外囊泡的锆基金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球。
优选的是，从细胞培养液或者血浆中提取细胞外囊泡。
优选的是，细胞外囊泡来源于正常细胞或者癌症细胞。
一种细胞外囊泡表面蛋白标志物的分析方法，包括以下步骤：
I)取拉曼报告分子、3,3’-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)与AuAg溶液在室温下混合孵育，离心去除游离分子，加入PBS溶液重新分散沉淀，然后加入抗体，室温孵育，孵育结束在低温下离心，去除游离抗体，加入含0.1％ BSA的PBS缓冲液重新分散沉淀，得到SERS纳米标签；
II)将权利要求5所述的捕获有细胞外囊泡的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球与SERS纳米标签混合孵育，静置使孵育复合物漂浮到液面，除去下层游离的SERS纳米标签，并用PBS缓冲液洗涤，将孵育复合物滴在硅片上，用便携式拉曼光谱仪采集拉曼光谱数据。
优选的是，细胞外囊泡的表面蛋白标志物包括表皮生长因子、四次跨膜蛋白、人类表皮因子受体2、上皮细胞黏附分子、甲胎蛋白、癌胚抗原、粘蛋白、程序性细胞死亡配体1、前列腺特异性抗原、血管内皮生长因子。
金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球作为捕获探针在靶标细胞外囊、磷酸蛋白质组、磷酸肽、核酸和细胞捕获中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明利用过渡金属元素(Zr)对EV具有高的亲和性，与具有自驱动、自分离、自富集的中空玻璃微球结合，制备出一种可快速捕获、分离和富集EV的材料。具体地，本发明通过锆基金属有机框架(Zr-MOF)上的Zr4+与EV表面的磷酸基团之间的配位作用，可以对EV进行快速捕获，随后利用中空玻璃微球自身的浮力，实现EV的分离和富集。相比于生物亲和性磁珠和微流控技术，Zr-MOF对EV具有更高的亲和性，并且不需要昂贵的抗体和外力，可缩短分离时间、降低成本和减少耗能。
第二、本发明在拉曼增强效果良好的各向异性金银合金纳米盒(AuAg)表面共同修饰不同拉曼报告分子和抗体，制备一系列能够特异性识别和检测靶标EV表面蛋白标志物的SERS纳米标签，实现靶标EV的超灵敏和多元分析，解决了EV多元分析的难题。
第三、本发明利用漂浮B@MOF快速捕获靶标EV，再通过SERS纳米标签表面的抗体对靶标EV表面蛋白的特异性识别，实现了EV的快速捕获和多元SERS分析。本发明是一种快速、灵敏、精简、节能和多元的EV检测方法，在临床分析、诊断、治疗方面具有巨大的应用潜力。
第四、本发明的漂浮B@MOF具有许多与磷脂基团配位作用的位点，对细胞来源和血浆来源EV都具有快速捕获和分离的能力。本发明的漂浮B@MOF制备步骤简单，原料便宜，稳定性好，可以利用自身的浮力实现无需外力分离靶标EV。
第五、本发明制备的漂浮B@MOF可作为一个通用型捕获探针，用于靶标细胞外囊泡、磷酸蛋白质组、磷酸肽、核酸和细胞的捕获检测，在液体活检中具有广泛的应用前景。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的漂浮B@MOF的制备流程图及其捕获EV的原理图；其中，a为制备流程图；b为捕获EV的原理图；
图2为本发明的B@PEI和漂浮B@MOF的TEM和SEM表征图；
图3为靶标EV的TEM表征图；
图4为本发明的漂浮B@MOF捕获不同细胞来源EV的荧光图；其中，BF为明场图，DF为暗场图；PBS为对照，即以等量PBS溶液替代EV溶液；HepG2为人肝癌细胞；L02为正常肝细胞；MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3为人乳腺癌细胞；A-431为人表皮癌细胞；A549为人肺癌细胞；HeLa为人宫颈癌细胞；RAW264.7为小鼠巨噬细胞；
图5为本发明的漂浮B@MOF捕获EV动力学的表征图；
图6为SERS纳米标签的制备流程图及其拉曼光谱图；
图7为本发明的漂浮B@MOF捕获L02和HepG2 EV后的多元拉曼共聚焦成像及其相对拉曼强度柱状图，比例尺：5μm；
图8为本发明的漂浮B@MOF捕获细胞来源EV后的表型分析图；
图9为本发明的漂浮B@MOF捕获血浆来源EV后的多元SERS分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
如图1-9所示，本发明提供了一种金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球的制备方法，其包括以下步骤：
1)将中空玻璃微球加入食人鱼溶液，搅拌，静置后去除下层的碎片，用超纯水洗涤，烘干，得到表面活化的中空玻璃微球；
2)往表面活化的中空玻璃微球加入聚乙烯亚胺溶液，混合反应，静置分离，上层漂浮物用超纯水洗涤，真空干燥，得到聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球；
3)往2-氨基对苯二甲酸、苯甲酸和ZrCl4中加入N，N-二甲基甲酰胺，超声溶解，加入聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球，搅拌反应，反应结束后静置分离，取上层漂浮物，并用N，N-二甲基甲酰胺和乙醇洗涤，真空干燥，得到具有漂浮能力的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球。
在另一种技术方案中，步骤2)中，表面活化的中空玻璃微球与聚乙烯亚胺的质量比为100:3-24，在室温下旋转混合反应，反应时间为0.5-12h。
在另一种技术方案中，步骤3)中，2-氨基对苯二甲酸、苯甲酸、ZrCl4、N，N-二甲基甲酰胺、聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球的质量比为1-3:30-50:1-3:150-250:1-3，搅拌反应的为90-160℃，反应时间是6-24h。
一种金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球，由本发明提供的制备方法制得。
一种细胞外囊泡的捕获方法，包括以下步骤：
i)提取细胞外囊泡；
ii)取所述的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球于离心管中，加入PBS缓冲液分散微球，加入步骤i)提取的细胞外囊泡，室温下涡旋混合反应，反应结束后，静置使微球复合物完全漂浮至溶液表面，将下层溶液去除，并用PBS缓冲液洗涤，加入1％ BSA溶液封闭活性位点，5-10min后分离洗涤3-5次，得到捕获有细胞外囊泡的锆基金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球。
在另一种技术方案中，从细胞培养液或者血浆中提取细胞外囊泡。
在另一种技术方案中，细胞外囊泡来源于正常细胞或者癌症细胞。正常细胞包括正常肝细胞、正常乳腺上皮细胞、正常肺细胞、正常脑细胞、神经细胞、免疫细胞等。癌细胞可为肝癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈癌、食道癌或脑癌等的癌细胞。免疫细胞可为单核巨噬细胞、T细胞、B细胞等。
一种细胞外囊泡表面蛋白标志物的分析方法，包括以下步骤：
I)取拉曼报告分子、3,3’-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)与AuAg溶液在室温下混合孵育，离心去除游离分子，加入PBS溶液重新分散沉淀，然后加入抗体，室温孵育，孵育结束在低温下离心，去除游离抗体，加入含0.1％ BSA的PBS缓冲液重新分散沉淀，得到SERS纳米标签；
II)将权利要求5所述的捕获有细胞外囊泡的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球与SERS纳米标签混合孵育，静置使孵育复合物漂浮到液面，除去下层游离的SERS纳米标签，并用PBS缓冲液洗涤，将孵育复合物滴在硅片上，用便携式拉曼光谱仪采集拉曼光谱数据。
本技术方案中，拉曼报告分子可为4-巯基吡啶、4-硝基苯硫酚、4-乙炔基苯甲酸、4-巯基苯甲腈、4-巯基苯甲酸、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)或者其他拉曼报告分子；抗体可为EGFR、CD63、HER2、EpCAM或其他抗体。
在另一种技术方案中，细胞外囊泡的表面蛋白标志物包括表皮生长因子、四次跨膜蛋白、人类表皮因子受体2、上皮细胞黏附分子、甲胎蛋白、癌胚抗原、粘蛋白、程序性细胞死亡配体1、前列腺特异性抗原、血管内皮生长因子。
金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球作为捕获探针在靶标细胞外囊泡、磷酸蛋白质组、磷酸肽、核酸和细胞捕获中的应用。
本发明通过锆基金属有机框架(Zr-MOF)上的Zr4+与靶标细胞外囊泡、磷酸蛋白质组、磷酸肽、核酸和细胞表面的磷酸基团之间的配位作用，可以对靶标细胞外囊泡、磷酸蛋白质组、磷酸肽、核酸和细胞进行快速捕获，随后利用中空玻璃微球自身的浮力，实现靶标细胞外囊泡、磷酸蛋白质组、磷酸肽、核酸和细胞的分离和富集。
<试验一>金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球的制备试验
金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球的制备方法包括以下步骤：
1)将中空玻璃微球加入食人鱼溶液(H2O2/H2SO4＝1:3)，搅拌1h，转速1000rpm，静置后使用分液漏斗分离去除下层的碎片，用超纯水洗涤，80℃烘干，得到表面活化的中空玻璃微球；
2)往1g表面活化的中空玻璃微球加入30mL 2mg/mL的聚乙烯亚胺(PEI)水溶液，在室温下旋转混合反应2h，转速为10rpm，静置分离，上层漂浮物用超纯水洗涤，37℃下真空干燥，得到聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球(B@PEI)；
3)往110mg 2-氨基对苯二甲酸、1.9g苯甲酸和120mg ZrCl4中加入10mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，超声使固体物质完全溶解，加入100mg聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球，120℃搅拌反应24h搅拌转速为1000rpm，反应结束后静置分离，取上层漂浮物，并用N，N-二甲基甲酰胺和乙醇洗涤，真空干燥，得到具有漂浮能力的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球(漂浮B@MOF)。
如图2所示，中空玻璃微球表面包裹了不规则的PEI，这提供了丰富的金属螯合位点，有利于Zr-MOF的生长，最终使得气泡表面形成高密度的Zr-MOF，证明了漂浮B@MOF的成功制备。
<试验二>细胞来源EV的提取试验
细胞密度生长达到80％后，将完全培养基改为无血清培养基，并在培养箱中继续孵育；48h后，收集上层细胞培养基，然后在4℃下离心(3000g,15min)，除去完整细胞和细胞碎片；随后上清液用0.45μm膜过滤，并将滤液转移至15mL超滤管中，在4℃下离心(5000g，15min)浓缩培养基；将浓缩的培养基收集在离心管中，并加入ExoQuick-TCTM试剂(浓缩培养基与ExoQuick-TCTM试剂的体积比为5:1)，混合均匀后在4℃下静置孵育过夜；最后，混合液在4℃下离心(1500g，30min)，除去上清液，收集的EV沉淀用PBS缓冲液分散并保存在-80℃冰箱备用。
采用TEM对EV的形貌进行表征，如图3所示，可观察到典型的蝶状结构，说明成功提取细胞来源EV。
<试验三>漂浮B@MOF捕获细胞来源EV试验
称取0.3mg漂浮B@MOF加入1.5mL的离心管中，加入90μL PBS缓冲液分散，然后再加入10μL不同来源的EV溶液(108particles/mL)，室温下涡旋混合；反应结束后，静置使捕获有EV的微球(B@MOF@EV复合物)完全漂浮至溶液表面，将下层溶液吸出，并用PBS缓冲液洗涤B@MOF@EV复合物3次，加入100μL BSA(1％)封闭活性位点，5min后分离洗涤3次，利用DiI溶液对EV进行染色，20min后分离洗涤3次，对B@MOF@EV复合物进行荧光成像。
结果如图4所示，漂浮B@MOF表面具有明显的荧光，证明了不同细胞来源的EV被B@MOF成功捕获。
<试验四>漂浮B@MOF捕获细胞来源EV速度与稳定性试验
称取0.3mg漂浮B@MOF加入1.5mL的离心管中，加入90μL PBS缓冲液分散，然后再加入从肝癌细胞(HepG2)提取的EV溶液(108particles/mL)10μL，室温下分别涡旋混合0、5、10、20、30、60、90min反应，反应结束后，静置使B@MOF@EV复合物完全漂浮至溶液表面，将下层溶液吸出，并用PBS缓冲液洗涤B@MOF@EV复合物3次，加入100μL BSA(1％)封闭活性位点，5min后分离洗涤3次。随后加入DiI溶液对HepG2EV进行染色，20min后分离洗涤3次。最后对复合物进行荧光成像。
如图5所示，孵育5min后，B@MOF@EV复合物表面具有明显的荧光并且达到稳定，说明EV可以被漂浮B@MOF快速捕获。
<试验五>SERS纳米标签的制备试验
根据图6所示流程，制备多个SERS纳米标签。
取1μL拉曼报告分子(4-巯基吡啶(MPY)、4-硝基苯硫酚(NTP)、4-乙炔基苯甲酸(EBA)、4-巯基苯甲腈(MBN)，10mM)和1μL 3,3’-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP，10mM)分别与100μL AuAg溶液在室温下混合孵育5h，使AuAg表面组装上分子层，离心(8000rpm，5min)除去游离的分子，并加入100μL PBS(0.1mM)重新分散沉淀，然后分别加入1μL抗体(anti-EGFR、ant-CD63、anti-HER2和anti-EpCAM，500μg/mL)，室温孵育2h，随后在4℃下离心(8000rpm,5min)除去游离的抗体，加100μL PBS缓冲液(含0.1％ BSA)重新分散沉淀，最后将制备的SERS纳米标签(MPY-EGFR、NTP-CD63、EBA-HER2和MBN-EpCAM)保存在4℃冰箱以备后续实验。
采用便携式拉曼光谱仪采集四种SERS纳米标签的拉曼光谱。结果如图6所示，可观察到每个SERS纳米标签的特征拉曼峰(MPY-EGFR：1005cm-1，NTP-CD63：1350cm-1，EBA-HER2：2026cm-1，MBN-EpCAM：2230cm-1)，并且不重叠，从而可以实现多元SERS分析。
<试验六>漂浮B@MOF用于EV多元SERS分析可行性的表征试验
为了验证多元分析的可行性，捕获EV的漂浮B@MOF(B@MOF@EV复合物)分别与MPY-EGFR、NTP-CD63、EBA-HER2、MBN-EpCAM孵育45min，然后静置使复合物漂浮到液面，除去下层游离的SERS纳米标签，并用PBS缓冲液洗涤三次，最后将复合物滴在硅片上，并用共聚焦拉曼光谱仪对单个气泡进行成像或者用便携式拉曼光谱仪采集拉曼光谱。
如图7所示，空白组(PBS)(指用PBS代替EV)、L02 EV(正常肝细胞来源)组和HepG2EV(人肝癌细胞来源)中，单个气泡的拉曼成像和相对拉曼强度具有显著性差异，证明了漂浮B@MOF用于EV多元SERS分析的可行性。
<试验七>漂浮B@MOF用于不同细胞来源EV的表型分析试验
根据图8a所示，不同细胞来源的EV被漂浮B@MOF捕获后，SERS纳米标签表面抗体可以识别EV表面蛋白标志物，然后进行SERS分析。
为了验证漂浮B@MOF可用于不同细胞来源EV的表型分析，漂浮B@MOF捕获不同细胞来源EV(人肝癌细胞(HepG2)、人正常肝细胞(L02)、人乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3)、人表皮癌细胞(A-431)、人肺癌细胞(A549)、人宫颈癌细胞(HeLa))后分别与MPY-EGFR、NTP-CD63、EBA-HER2、MBN-EpCAM孵育45min。
然后静置使复合物漂浮到液面，除去下层游离的SERS纳米标签，并用PBS缓冲液洗涤三次，最后将复合物滴在硅片上，并用便携式拉曼光谱仪采集拉曼光谱。
如图8b、8c所示，CD63在不同细胞来源EV中都有高表达，而其他表面蛋白标志物的表达则具有差异性。例如，EGFR在A-431细胞来源EV中高表达，HER2在SK-BR-3细胞来源EV中高表达，EpCAM在HepG2、MCF-7和A-431细胞来源EV中高表达。因此，漂浮B@MOF可以用于不同细胞来源EV的表型分析。
<试验八>漂浮B@MOF用于不同疾病血浆来源EV的多元SERS分析试验
为了验证漂浮B@MOF可用于健康人(HD，人数n＝10)和不同疾病(肝癌(LiC，人数n＝10)、乳腺癌(BC，人数n＝10)、肺癌(LuC，人数n＝10))血浆来源EV的多元SERS分析，漂浮B@MOF捕获血浆来源EV后分别与MPY-EGFR、NTP-CD63、EBA-HER2、MBN-EpCAM孵育45min。然后静置使复合物漂浮到液面，除去下层游离的SERS纳米标签，并用PBS缓冲液洗涤三次。最后将复合物滴在硅片上，并用便携式拉曼光谱仪采集拉曼光谱。
如图9a、9b所示，EGFR、CD63、HER2和EpCAM的表达水平在40个临床样本中具有异质性，但是癌症患者血浆来源EV表面蛋白表达水平大多数高于健康人血浆来源EV表面蛋白表达水平。图9c受试者工作曲线(ROC)分析也证明了癌症患者血浆来源EV表面的蛋白显著性(p<0.01)高于健康人血浆来源EV表面的蛋白。此外，通过比较四种蛋白标志物的曲线下面积(AUC，图9d-f)，发现四种蛋白标志物在区分癌症患者和健康人方面具有很高的准确性(AUC>0.85)。因此，这些结果说明漂浮B@MOF可以用于不同疾病血浆来源EV的多元SERS分析，并且能够实现癌症的准确诊断。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (10)
1.金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将中空玻璃微球加入食人鱼溶液，搅拌，静置后去除下层的碎片，用超纯水洗涤，烘干，得到表面活化的中空玻璃微球；
2)往表面活化的中空玻璃微球加入聚乙烯亚胺溶液，混合反应，静置分离，上层漂浮物用超纯水洗涤，真空干燥，得到聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球；
3)往2-氨基对苯二甲酸、苯甲酸和ZrCl4中加入N，N-二甲基甲酰胺，超声溶解，加入聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球，搅拌反应，反应结束后静置分离，取上层漂浮物，并用N，N-二甲基甲酰胺和乙醇洗涤，真空干燥，得到具有漂浮能力的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球。
2.根据权利要求1所述的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球的制备方法，其特征在于，步骤2)中，表面活化的中空玻璃微球与聚乙烯亚胺的质量比为100:3-24，在室温下旋转混合反应，反应时间为0.5-12h。
3.根据权利要求1所述的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球的制备方法，其特征在于，步骤3)中，2-氨基对苯二甲酸、苯甲酸、ZrCl4、N，N-二甲基甲酰胺、聚乙烯亚胺包裹的中空玻璃微球的质量比为1-3:30-50:1-3:150-250:1-3，搅拌反应的为90-160℃，反应时间是6-24h。
4.金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球，其特征在于，由权利要求1的制备方法制得。
5.细胞外囊泡的捕获方法，其特征在于，包括以下步骤：
i)提取细胞外囊泡；
ii)取权利要求1所述的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球于离心管中，加入PBS缓冲液分散微球，加入步骤i)提取的细胞外囊泡，室温下涡旋混合反应，反应结束后，静置使微球复合物完全漂浮至溶液表面，将下层溶液去除，并用PBS缓冲液洗涤，加入BSA溶液封闭活性位点，5-10min后分离洗涤3-5次，得到捕获有细胞外囊泡的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球。
6.根据权利要求5所述的细胞外囊泡的捕获方法，其特征在于，从细胞培养液或者血浆中提取细胞外囊泡。
7.根据权利要求5所述的细胞外囊泡的捕获方法，其特征在于，细胞外囊泡来源于正常细胞或者癌症细胞。
8.细胞外囊泡表面蛋白标志物的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
I)取拉曼报告分子、3,3’-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)与AuAg溶液在室温下混合孵育，离心去除游离分子，加入PBS溶液重新分散沉淀，然后加入抗体，室温孵育，孵育结束在低温下离心，去除游离抗体，加入含0.1％BSA的PBS缓冲液重新分散沉淀，得到SERS纳米标签；
II)将权利要求5所述的捕获有细胞外囊泡的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球与SERS纳米标签混合孵育，静置使孵育复合物漂浮到液面，除去下层游离的SERS纳米标签，并用PBS缓冲液洗涤，将孵育复合物滴在硅片上，用便携式拉曼光谱仪采集拉曼光谱数据。
9.根据权利要求8所述的细胞外囊泡表面蛋白标志物的分析方法，其特征在于，细胞外囊泡表面蛋白标志物包括表皮生长因子、四次跨膜蛋白、人类表皮因子受体2、上皮细胞黏附分子、甲胎蛋白、癌胚抗原、粘蛋白、程序性细胞死亡配体1、前列腺特异性抗原、血管内皮生长因子。
10.如权利要求4所述的金属有机框架密集包裹的中空玻璃微球作为捕获探针在靶标细胞外囊泡、磷酸蛋白质组、磷酸肽、核酸和细胞捕获中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN118667263A (zh) * | 2024-07-29 | 2024-09-20 | 浙江杭欧实业股份有限公司 | 一种抗电磁屏蔽的mpp波纹电缆导管及其制备方法 |
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2023
- 2023-11-07 CN CN202311469652.5A patent/CN117482923A/zh active Pending
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