CN101353646A

CN101353646A - 端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系及其建立方法

Info

Publication number: CN101353646A
Application number: CNA2008101019014A
Authority: CN
Inventors: 张海燕; 徐群渊; 王一松; 赵咏梅; 赵春礼
Original assignee: Beijing Institute of Neuroscience
Current assignee: Beijing Institute of Neuroscience
Priority date: 2008-03-13
Filing date: 2008-03-13
Publication date: 2009-01-28

Abstract

本发明涉及一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系及其建立方法和应用，该细胞系已于2008年2月21日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心》，其保藏号为CGMCC No.2372。本发明所述细胞系命名为hSN12W－TERT。所述细胞系表达人神经生长因子受体及绿色荧光蛋白，具有高端粒酶活性，正常人二倍体核型，体外连续传代培养36个月，目前已传至45代次，群体倍增达100－120次，具有接触抑制和密度抑制特性；所述细胞系分化形成的神经元具有电生理学特性；所述细胞系在骨形成蛋白2(BMP2)的诱导下可以分化成γ－氨基丁酸(GABA)能神经元。

Description

端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系及其建立方法

技术领域

本发明涉及一种细胞系及其建立方法和应用，具体涉及一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系及其建立方法和应用，它属于神经系统疾病基础研究以及临床应用领域。

背景技术

中枢神经系统疾病，如退行性变疾病帕金森病(PD)、老年痴呆(AD)以及急性损伤性疾病脑出血、脑梗塞等等，一般都很难治愈，对个人和家庭都是贻害无穷。这是因为组成神经系统的细胞-神经元在出生后就已经完成了分裂、增殖和分化，死亡以后就不能获得新生神经元的取代，脑组织一旦损伤，即造成永久功能丧失。

上世纪未生命科学领域中具有划时代意义的重大进展-神经干细胞的发现为治疗这类疾病展现出光明的前景。神经干细胞(NSC)是藏匿于神经系统某些部位中的一类具有自我更新能力，并且能分化为本系统各种细胞如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等的多潜能细胞。这种多分化潜能和自我更新潜能可以维持相当长时间，甚至终生，且能对疾病或损伤发生应答，即神经干细胞及其分化后的子细胞可补充与替代疾病或损伤的神经细胞。

神经前体细胞(NPCs)是指具有一定增殖能力，但其具有较明确的分化方向，可以沿着某一谱系进一步分化为成熟神经系统的细胞。这些细胞同样保持相对原始的状态，具有良好的可塑性，可以通过基因工程或细胞工程等当代高新技术将之进行人工改造，使其发育成为能够对神经损伤特别是中枢神经损伤进行替代治疗的工具。如果我们能够将它们分离出来，能够在体外长期培养它们、扩增它们，驾驭它们能够按照我们的意愿来分化，就能够将它们用做治疗神经系统损伤的替代细胞，中枢神经系统疾病的治疗就有希望。

尽管近年来国内外的研究表明，利用体外分离技术可以使研究者在培养皿中获得人神经前体细胞，这些细胞可在有丝分裂源，碱性成纤维因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)作用下分裂增殖产生一定量的子代细胞。但人神经前体细胞在体外的生存期较短，即使通过改良培养方式，在培养体系中加入白血病抑制因子(LIF)等也不能无限延长体外神经前体细胞的生存期。体外培养人神经前体细胞的数量及质量已成为制约神经前体细胞应用的最主要因素。如何获得可供研究的、大量的人神经前体细胞，已成为目前研究迫切需要解决的一个问题。

通过基因工程方法建立起永生化的人神经前体细胞系，就可在一定程度上解决在体外大量扩增前体细胞的难题。神经前体细胞系特性均一，易于冷冻保存，易于进行转基因操作，易于在良好的质量监控下提供不同机构广泛应用。人神经前体细胞的永生化研究最早由Sah等于1997年首次报道，他们利用四环素调控的v-myc基因表达系统，建立了来源于人体胚胎13周全脑组织、具有单潜能及双潜能的永生化人神经前体细胞系。随后，Flax与Villa分别报道了v-myc永生化的多潜能人体胚胎神经前体细胞系B4和HNSC.100。但由于myc基因的表达不仅与细胞增殖和分化有关，而且与细胞的癌变也密切相关，给病人移植就有相当的致瘤危险。

细胞衰老及永生化的端粒假说表明，端粒酶活性的维持是细胞保持增殖能力的条件之一。通过外源基因导入重建端粒酶活性可以使增殖能力有限的细胞达到永生化。端粒酶永生化的细胞具有正常人二倍体核型；存在接触抑制现象和锚着依赖性特征；不具有致瘤性和软琼脂克隆形成能力；DNA被紫外线或电离辐射损伤后，p53和p16INK4a，K-Ras的反应性诱导与正常细胞相同。因而利用人端粒酶催化亚单位基因(hTERT)重建神经前体细胞端粒酶活性，成为永生化人神经前体细胞的一个新的方向。Roy及Bai于2004年分别报道了利用端粒酶基因建立永生化胚胎脊髓及SVZ区的人神经前体细胞系。但最新的研究表明，发育期的神经前体细胞具有较明确的区域特异性，不同脑区不同发育阶段的细胞具有不同的转录因子表达，而转录因子直接调控前体细胞在体内外定向分化的方向。因此，提供人类中枢神经系统疾病基础以及临床治疗研究用的永生化人前脑神经前体细胞系就成为该技术领域急需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可供人类中枢神经系统疾病基础以及临床治疗研究用的永生化人前脑神经前体细胞系。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞hSN12W-TERT，已于2008年2月21日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心》，其保藏号为CGMCC No.2372。

本发明的另一目的是提供上述端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞的培养方法。

一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系，其建立步骤如下：

1、包装细胞的筛选及病毒上清的收获；

2、病毒感染原代培养人胚前脑神经前体细胞；

3、克隆法筛选hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞；

4、hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞的扩增培养，获得端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系。

一种优选技术方案，其特征在于：

所述步骤1的具体步骤如下：

(1)对数生长期PG13/JH1/hTERT包装细胞经0.25％胰蛋白酶消化后计数；

(2)用DMEM完全培养基将细胞稀释至浓度为100细胞/mL，取0.1mL细胞悬液接种于48孔板中，补加0.4mL完全培养液，37℃，5％CO₂条件下培养，每周半量换液，培养2-3周；

(3)相差显微镜观察定期观察48孔板中细胞生长状况，当细胞生长至60-80％汇合时，分别将细胞消化接种于6孔板中，继续培养；

(4)荧光显微镜定期观察各组细胞的荧光强度，培养1周后，挑选荧光较强的细胞扩增培养；

(5)收集培养液即病毒上清，用0.45μm低蛋白吸附膜过滤，分装1.5mL，-70℃保存；

所述步骤2的具体步骤如下：

(1)人胚(孕12周)前脑神经前体细胞分离计数后，按5×10⁵/mL的细胞密度接种于预先包被PLL的75cm²培养瓶中，加入10mL FBS-NSA培养基，37℃，5％CO₂培养12小时；将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基；

(2)原代分离的人神经前体细胞在GF-NSA培养基中生长72小时后进行病毒感染，弃培养液，加入高滴度的hTERT病毒上清6mL，GF-NSA完全培养基4mL，polybrene 8μg/mL(终浓度)，37℃，5％CO₂培养12小时，弃病毒上清，换成新鲜GF-NSA培养基，继续培养，细胞生长密度达到80-90％汇合后，传代；

(3)病毒感染步骤分别在第2、3代重复两次；

所述步骤3的具体步骤如下：

(1)病毒感染后的细胞消化后制成细胞悬液，计数，将细胞悬液稀释至2×10²/mL接种于包被PLL的75cm²培养瓶中，每瓶1mL细胞悬液，37℃，5％CO₂培养；

(2)定期观察细胞的生长，当出现明显的细胞克隆后，荧光显微镜观察各细胞克隆的荧光强度，并标记；

(3)克隆片定点消化表达荧光的细胞克隆，将细胞接种于24孔板中，然后依次通过6孔板，25cm²培养瓶进行扩增培养；

所述步骤4的具体步骤如下：

(1)筛选后的细胞，接种于包被PLL的培养中生长，培养基为GF-NSA培养基，37℃，5％CO₂培养，每3天换液一次，传代时间依细胞增殖的情况而定，每7-10天传代一次；

(2)传代方式：培养细胞生长至90％汇合期，弃培养基，用0.025％胰蛋白酶/0.002％EDTA消化细胞1-3分钟，弃消化液，加入FBS-NSA培养基，进行吹打，细胞重悬于FBS-NSA培养基中，按1∶2的比例将细胞接种于PLL包被的培养瓶中，37℃，培养2小时，然后将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基继续培养，利用免疫细胞化学，RT-PCR，以及电生理功能等方法对扩增的细胞进行特征测定，证明所获得的细胞是端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系hSN12W-TERT。

一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤1中所述包装细胞的建立过程如下：

(1)构建逆转录病毒载体，其步骤如下：

目的基因hTERT与报告基因(人低亲和神经生长因子(NGFR)的膜表面段基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因相融合而成)之间通过内部核糖体进入位点(IRES)调节结构相连；IRES可以控制两个基因由一个mRNA进行表达，即目的基因hTERT与报告基因同时表达，通过检测报告基因的表达水平而确定目的基因是否表达；将hTERT-IRES-tNGFR-EGFP基因插入经鼠干细胞逆转录病毒载体(murine stem cell virus，MSCV)中；测序鉴定其DNA序列的正确；

(2)质粒的获得

将上述载体DNA导入大肠杆菌DH5α中，扩增培养，收集细菌培养液，用质粒提取试剂盒对培养液进行上述提取，纯化，获得可供转染的DNA；

(3)包装细胞PG13/JH1的培养与质粒转染

将PG13/JH1细胞按1-3×10⁵/mL的细胞密度接种到30mm²平皿中；37℃，5％CO₂培养12-24小时使细胞达到60-80％汇合时进行转染；质粒转染前，用PBS液洗细胞3次，加1ml无血清培养基Opti-MEM，37℃孵育30分钟；用无菌去离子水稀释质粒DNA，将20μl质粒DNA加入90μl水中混匀；将15μl Lipofectamine^TM 2000缓慢加入稀释好的DNA中，边加边弹混匀并形成小泡；将质粒DNA与转染试剂的混合物加入细胞培养皿中，37℃，5％CO₂转染6小时；培养皿中补加1ml含20％FBS的DMEM完全培养液，继续培养；质粒转染20小时后，进行甘油休克；将37℃温育的休克液(含85％HBS和15％甘油溶液)滴加在转染细胞表面，室温放置2.5分钟；将休克液吸弃，用PBS液洗细胞1次；加入新鲜的DMEM完全培养基培养24小时后传代；

(4)包装细胞株PG13/JH1/hTERT的筛选

步骤(3)转染后的细胞经0.25％+0.02％EDTA消化后，将细胞悬液稀释至2×10²/mL，接种于75cm²培养瓶中，每瓶1mL细胞悬液，37℃，5％CO₂培养；定期观察细胞的生长，当出现明显的细胞克隆后，荧光显微镜观察各细胞克隆的荧光强度，并标记；克隆片定点消化表达荧光的细胞克隆，将细胞接种于24孔板中，然后依次通过6孔板，25cm²培养瓶进行扩增培养，获得PG13/JH1/hTERT克隆细胞株；

(5)逆转录病毒上清滴度的测定以及分泌高滴度病毒PG13/JH1/hTERT克隆细胞株的筛选

将步骤(4)获得的PG13/JH1/hTERT不同克隆细胞株细胞按5×10⁵/ml接种于75cm²的培养瓶中，培养24小时后换成新鲜培养基，继续培养36-40小时后，收集培养液，即为含病毒上清；将病毒上清用孔径为0.45μm的醋酸纤维素膜过滤；进行病毒滴度的测定；

将NIH3T3细胞接种在6孔培养板中，每孔细胞数为5×10⁴，加DMEM完全培养液2ml，37℃，5％CO₂培养24小时；每个克隆细胞株的病毒上清准备6个不同的稀释度病毒；分别取1ml不同稀释度的病毒上清加入培养NIH3T3的6孔培养板中，然后加入2μl浓度为4mg/ml的polybrene(商品名，一种聚卤化季铵盐，用于增加病毒进入细胞的效率。)；37℃感染2-3小时；中间不断摇动几次，以增加病毒的吸附；3小时后每孔中加入1ml含20％FBS的完全培养基，继续培养，24小时后用0.25％胰蛋白酶消化细胞，2×10²/mL接种于75cm2培养瓶中，培养2周，计数细胞克隆；病毒滴度(cfu)＝所形成的克隆数×上清的稀释倍数×传代的比例；

选取病毒滴度最高的PG13/JH1/hTERT细胞克隆株进行扩增培养用于感染神经前体细胞。

本发明的又一目的是提供一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系在用作人类中枢神经系统疾病研究和治疗相关疾病药物的药物中的应用。

有益效果：

本发明所述细胞系命名为hSN12W-TERT。所述细胞系来源于人胚胎12周腹侧端脑，通过逆转录病毒转染人端粒酶催化亚单位基因以及双报告基因，截断的人低亲和神经生长因子受体(truncated human nerve growth factorreceptor，tNGFR)、增强型的绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescentprotein，EGFP)，所述细胞系表达人神经生长因子受体及绿色荧光蛋白，具有高端粒酶活性，正常人二倍体核型(46，XY)，体外连续传代培养36个月，目前已传至45代次，群体倍增达100-120次，群体倍增时间约为4.5天，体外呈单层贴壁生长，具有接触抑制和密度抑制特性，裸鼠接种40周无肿瘤组织的形成；所述细胞系表达前脑转录因子(Mash1)和Dlx2；增殖条件下，hSN12W-TERT细胞系表达神经前体细胞标志蛋白，nestin(巢蛋白)，vimentin和Sox2；分化条件下，可以分化成具有神经元，神经胶质细胞以及少突胶质细胞；所述细胞系分化形成的神经元具有电生理学特性；所述细胞系在骨形成蛋白2(BMP2)的诱导下可以分化成γ-氨基丁酸(GABA)能神经元。

下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1是相差显微镜显示人神经前体细胞神经球生长形态。

图2是相差显微镜显示人神经前体细胞单层生长形态。

图3是相差显微镜显示不同代次单层生长的人神经前体细胞形态。

图4是体外培养人神经前体细胞的生长曲线。

图5是流式细胞仪分析人神经前体细胞的细胞周期及倍体。

图6是免疫荧光染色显示增殖条件下人胚前脑神经前体细胞的特性。

图7是免疫荧光染色显示人胚前脑神经前体细胞的分化特性。

图8是转染hTERT基因后表达EGFP的阳性细胞克隆。

图9是hSN12W-TERT细胞球体相差形态及荧光表达。

图10是不同培养条件下hTERT+人神经前体细胞表达NGFR的情况。

图11是ELISA测定人神经前体细胞端粒酶活性。

图12是不同培养代次的人hSN12W-TERT细胞EGFP和hTERT基因的表达。

图13是相差显微镜显示hSN12W-TERT细胞的生长方式。

图14是不同倍增次数条件下hSN12W-TERT细胞的生长曲线。

图15是BrdU和Ki67免疫荧光染色测定hSN12W-TERT细胞的增殖能力。

图16是吉姆萨染色显示hSN12W-TERT(PD＝20)细胞为正常人二倍体，46，XY。

图17是流式细胞仪分析不同倍增条件下hSN12W-TERT细胞周期分期及染色体倍体。

图18是hSN12W-TERT接种裸鼠40周后未发现肿瘤组织的形成(右图)，神经母细胞瘤SH-N-SH接种至裸鼠2周后即出现肿瘤块(左图箭头所指)。

图19是增殖条件下hSN12W-TERT细胞(PD＝9)中nestin(巢蛋白)蛋白的表达。

图20是RT-PCR和免疫荧光染色方法测定体外长期培养条件下hSN12W-TERT细胞的增殖特性。

图21是RA诱导7天后hSN12W-TERT细胞(PD＝20)中神经元标志物表达情况。

图22是不同因子作用hSN12W-TERT细胞7天后神经元标志物β-III-tubulin阳性细胞的比例统计。

图23是RA诱导14天后，hSN12W-TERT细胞(PD＝20)中神经元标志物MAP2a/b的表达情况。

图24是hSN12W-TERT细胞(PD＝20)诱导7天后神经胶质细胞标志物GFAP的表达。

图25是不同因子作用hSN12W-TERT细胞7天后神经胶质细胞标志物GFAP阳性细胞的比例。

图26是BMP2作用hSN12W-TERT细胞7天后钠，钾电流的分析图。

图27是BMP2诱导hSN12W-TERT细胞3天后，以Fluo-3作为游离钙离子指示剂，一个典型细胞在氯化钾除极前后细胞内荧光强度的变化(A)及时间-荧光强度曲线(B)。

图28是BMP2促进hSN12W-TERT细胞表达GABA能神经元功能和发育相关的分子标志。

图29是BMP2促进hSN12W-TERT细胞分化成GABA能神经元。

图30是实施例2中构建逆转录病毒载体的步骤示意图。

具体实施方式

实施例1

人体胚胎前脑神经前体细胞的原代培养及特性鉴定

一、胚胎脑组织的原代分离

1、取流产胚胎(孕12周)，在严格无菌条件下取出全脑组织，置于含青链霉素的DMEM/F12培养基中4℃保存，细胞的分离培养在取材后4小时内完成。

2、将分离获得的脑组织浸泡于含青链霉素的PBS液中浸洗两次。

3、将浸洗后的脑组织置于含NSA基础培养基的平皿中，解剖镜下仔细去除脑被膜，然后用手术刀取出前脑纹状体置于NSA基础培养基中浸洗3次，每次浸洗5分钟。

4、浸洗后的脑组织放入含蛋白酶XXIII(3mg/ml)的离心管中消化，37℃，6分钟。

5、离心，1000rpm，5分钟，弃消化液，加入FBS-NSA培养基重悬细胞沉淀，用抛光的Pasteur吸管反复轻吹组织约40次。

6、将细胞混悬液离心，1000rpm，5分钟，弃上清，用FBS-NSA培养基重悬细胞沉淀。取0.1mL悬液进行胎盘兰染色，计数活细胞数。

二、人体胚胎前脑神经前体细胞的原代培养

1、本发明用两种方法进行原代分离神经前体细胞的培养。

(1)神经球培养。原代分离的细胞悬液按5×10⁶/ml的细胞密度接种于未包被的75cm²培养瓶中，加入10mL FBS-NSA培养基，37℃，5％CO₂培养9-12小时后，将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基培养，继续培养。

(2)单层贴壁培养。将原代分离的细胞悬液接种于经0.01％PLL包被的75cm²培养瓶中，细胞接种密度为5×10⁶/ml，加入10mL FBS-NSA培养基。37℃，5％CO₂，培养9-12小时后，将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基培养，继续培养。

2、上述两种培养条件下，细胞每隔4-5天半量换液一次。

如图1所示，是用相差显微镜的显示的本步骤所得神经前体细胞神经球生长形态。其中A为原代分离细胞在未包被PLL的培养表面形成典型的神经球；B为神经球传代后形成的单细胞及细胞小球。放大倍数，A，B×100。

如图2所示是相差显微镜显示单层贴壁培养的人神经前体细胞生长形态。A：原代培养初期，细胞在包被PLL的培养表面形成细胞集落样。B：在包被PLL的培养表面生长至汇合期的细胞形态。

三、人胚前脑神经前体细胞的传代培养

1、根据细胞生长的情况，选择合适的时间进行细胞传代。

2、神经球生长至球体直径约为300-400μm大小时，进行传代。传代时用抛光好的Pasteur吸管反复吹打神经球，吹打后的细胞悬液及小神经球，重悬于GF-NSA培养基中。细胞悬液经短暂离心后将碎片弃去，余下的细胞重新用GF-NSA悬浮，接种于未包被的培养瓶中培养。

3、单层贴壁细胞生长至80-90％汇合时进行传代。传代时用0.025％胰蛋白酶/0.002％EDTA消化细胞约1-3分钟，弃消化液。加入FBS-NSA培养基进行吹打后，将细胞接种于PLL包被的培养瓶中，在FBS-NSA培养基中培养2小时后，将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基继续培养。

如图3所示是相差显微镜显示体外培养不同代次后，单层生长的人神经前体细胞形态A：第1代，8 DIV(days in vitro，体外培养天数)。B：第5代，8 DIV。C：第11代，14 DIV。放大倍数A，B，C×200。

四、人(体)胚(胎)前脑神经前体细胞的特性鉴定

1、细胞生长曲线测定

每一代次的细胞传代前，经消化、计数细胞总数，以横坐标为培养天数，纵坐标为细胞数，绘制细胞的生长曲线。如图4所示，此图说明细胞生长增殖能力。

2、分析人神经前体细胞的细胞周期及倍体

取对数生长期细胞一瓶，用0.025％胰蛋白酶/0.002％EDTA消化细胞后，离心，1000rpm，5分钟。PBS洗3次。将细胞重悬于1ml PBS中，逐滴加入-20℃预冷的95％乙醇3ml，混匀，4℃过夜。离心，1000rpm，5分钟。弃固定液，用含1％BSA的PBS洗3次。将细胞悬于0.2ml PBS中，加入100μl RNA酶A，37℃作用30分钟作用完毕后迅速放入冰浴中，加入100μl PI进行染色。如图5所示，此图说明细胞生长情况下细胞周期各时期所占的百分数，以及DNA含量。体外培养的人神经前体细胞DNA含量与正常二倍体细胞含量相同。hNSCs代表体外培养的人神经前体细胞。对照组为正常成年人外周血淋巴细胞。

3、分析人神经前体细胞的增殖条件下的细胞特性

如图6所示，体外培养的人神经前体细胞所形成的神经球呈BrdU染色(A)，BrdU(5-溴脱氧尿苷)阳性细胞主要分布在神经球的表面。BrdU阳性说明，细胞在分裂时将BrdU掺入其中。BrdU掺入实验标记细胞群体中处于DNA合成期(S期)的细胞比例。体外培养的神经球呈神经前体细胞特异性蛋白nestin染色阳性(B)。单层培养细胞第8代时，细胞呈nestin(巢蛋白)染色阳性(C)，(D)为(C)相同视野的细胞核DAPI(4’，6-二氨基-2-苯基吲哚)复染。BrdU阳性的细胞占40％阳性(E)，(F)为(E)相同视野的细胞核DAPI复染。

3、分析人神经前体细胞的的分化特性

如图7所示，单层培养的第8代细胞在含1％FBS的培养基中培养14天后可分化为神经元(β-III-tubulin(A)，NF68KD蛋白(B)染色阳性)，神经胶质细胞(GFAP蛋白染色(C))，少突胶质细胞(Ga1 C染色阳性(D))。

实施例2

端粒酶永生化人胚(胎)前脑神经前体细胞的建立及特性鉴定

一、端粒酶永生化人胚前脑神经前体细胞的建立

1.含人端粒酶催化亚单位基因的包装细胞PG13/JH1/hTERT的建立

(1)构建逆转录病毒载体，其步骤如图30所示。

目的基因hTERT与报告基因(人低亲和神经生长因子(low-affinity humannerve growth factor receptor，NGFR)的膜表面段基因与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因相融合而成)之间通过内部核糖体进入位点(Internal ribozyme entry site，IRES)调节结构相连；IRES可以控制两个基因由一个mRNA进行表达，即目的基因hTERT与报告基因同时表达，通过检测报告基因的表达水平而确定目的基因是否表达；将hTERT-IRES-tNGFR-EGFP基因插入经鼠干细胞逆转录病毒载体(murine stemcell virus，MSCV)中；测序鉴定其DNA序列的正确；

(2)质粒的获得

(3)包装细胞PG13/JH1的培养与质粒转染

将PG13/JH1细胞按1-3×10⁵/mL的细胞密度接种到30mm²平皿中；37℃，5％CO₂培养12-24小时使细胞达到60-80％汇合时进行转染；质粒转染前，用PBS液洗细胞3次，加1ml无血清培养基Opti-MEM，37℃孵育30分钟；用无菌去离子水稀释质粒DNA，将20ul质粒DNA加入90μl水中混匀；将15μlLipofectamine^TM 2000缓慢加入稀释好的DNA中，边加边弹混匀并形成小泡；将质粒DNA与转染试剂的混合物加入细胞培养皿中，37℃，5％CO₂转染6小时；培养皿中补加1ml含20％FBS的DMEM完全培养液，继续培养；质粒转染20小时后，进行甘油休克；将37℃温育的休克液(含85％HBS和15％甘油溶液)滴加在转染细胞表面，室温放置2.5分钟；将休克液吸弃，用PBS液洗细胞1次；加入新鲜的DMEM完全培养基培养24小时后传代。

(4)包装细胞株PG13/JH1/hTERT的筛选

将NIH3T3细胞接种在6孔培养板中，每孔细胞数为5×10⁴，加DMEM完全培养液2ml，37℃，5％CO₂培养24小时；每个克隆细胞株的病毒上清准备6个不同的稀释度病毒；分别取1ml不同稀释度的病毒上清加入培养NIH3T3的6孔培养板中，然后加入2ul 4mg/ml Polybrene；37℃感染2-3小时；中间不断摇动几次，以增加病毒的吸附；3小时后每孔中加入1ml含20％FBS的完全培养基，继续培养，24小时后用0.25％胰蛋白酶消化细胞，2×10²/mL接种于75cm2培养瓶中，培养2周，计数细胞克隆；病毒滴度(cfu)＝所形成的克隆数×上清的稀释倍数×传代的比例；

选取病毒滴度最高的PG13/JH1/hTERT细胞克隆株进行扩增培养用于下面步骤2。

2、包装细胞的筛选及病毒上清的收获

(1)对数生长期PG13/JH1/hTERT包装细胞经0.25％胰蛋白酶消化后计数。

(2)用DMEM完全培养基将细胞稀释至浓度为100细胞/mL。取0.1mL细胞悬液接种于48孔板中，每孔约10个细胞，然后补加0.4mL完全培养液。37℃ 5％CO₂培养，每周半量换液，培养2-3周。

(3)相差显微镜观察定期观察48孔板中细胞生长状况。当细胞生长至60-80％汇合时，分别将细胞消化接种于6孔板中；继续培养；

(4)荧光显微镜定期观察各组细胞的荧光强度。培养1周后，挑选荧光较强的细胞扩增培养。

(5)收集培养液即病毒上清，用0.45μm低蛋白吸附膜过滤，分装1.5mL，-70℃保存。

3、病毒感染原代培养人胚前脑神经前体细胞

(1)人胚(孕12周)前脑神经前体细胞分离计数后，按5×10⁵/mL的细胞密度接种于预先包被PLL的75cm²培养瓶中，加入10mL FBS-NSA培养基，37℃，5％CO₂培养12小时。将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基。

(2)原代分离的人神经前体细胞在GF-NSA培养基中生长72小时后进行病毒感染。弃培养液，加入高滴度的hTERT病毒上清6mL，GF-NSA完全培养基4mL，polybrene(商品名，一种聚卤化季铵盐，用于增加病毒进入细胞的效率。)8μg/mL(终浓度)，37℃，5％CO₂培养12小时。弃病毒上清，换成新鲜GF-NSA培养基，继续培养。细胞生长密度达到80-90％汇合后，传代。

(3)病毒感染步骤分别在第2、3代重复两次。

4、克隆法筛选hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞

(1)病毒感染后的细胞消化后制成细胞悬液，计数。将细胞悬液稀释至2×10²/mL接种于包被PLL的75cm²培养瓶中，每瓶1mL细胞悬液，37℃，5％CO₂培养。

(2)定期观察细胞的生长，当出现明显的细胞克隆后，荧光显微镜观察各细胞克隆的荧光强度，并标记。

(3)克隆片定点消化表达荧光的细胞克隆，将细胞接种于24孔板中，然后依次通过6孔板，25cm²培养瓶进行扩增培养。

如图8所示转染hTERT基因后表达EGFP的阳性细胞克隆。

5、hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞的扩增培养

(1)筛选后的细胞，接种于包被PLL的培养中生长，培养基为GF-NSA培养基，37℃，5％CO₂培养。每3天换液一次，传代时间依细胞增殖的情况而定，每7-10天传代一次。

(2)传代方式：培养细胞生长至90％汇合期，弃培养基，用0.025％胰蛋白酶/0.002％EDTA消化细胞1-3分钟，弃消化液，加入FBS-NSA培养基，进行吹打。细胞重悬于FBS-NSA培养基中，按1∶2的比例将细胞接种于PLL包被的培养瓶中，37℃，培养2小时，然后将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基继续培养。

(3)传代培养时将一部分细胞接种于未包被PLL的培养瓶中，观察转基因后的细胞是否可以形成神经球。

如图9所示转染hTERT基因后人神经前体细胞仍可以形成神经球。(A)为相差显微镜照片。(B)为荧光显微镜照片。放大倍数×100

在长期培养过程中，为了能够保存细胞，需要对细胞进行冷冻。冷冻保存细胞的方式：细胞冻存液中加入50％的FBS，冻存时程序选择为：室温→4℃(1小时)→低温冰箱(-70℃ 15分钟)→液氮(-196℃)。

细胞冻存液：GF-NSA培养基：4mL；FBS：5mL；DMSO：1mL。

经过上述过程，获得稳定的克隆细胞株，被命名为hSN12W-TERT。经过连续2年的培养，目前hSN12W-TERT细胞已经传代55代(群体倍增达180多次)，并且没有出现任何衰老特征。细胞生物学界普遍接受的观点是细胞群体倍增超过100次即为达到了永生化，因此本发明建立的hSN12W-TERT细胞已经是永生化的细胞。该细胞已于2008年2月21日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心》，其保藏号为CGMCC No.2372。

二、hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞的特性鉴定

1、hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞表达外源基因的情况

如图10所示，hTERT⁺人神经前体细胞在增殖条件(GF-NSA培养基，(A))以及全反式维甲酸(All-trans-retinoic acid，RA)(1μM)诱导14天(B)的情况下均表达外源标志基因NGFR。NGFR阳性部位出现在细胞表面。

如图11所示为利用

ELISA方法测定hTERT+细胞端粒酶活性的结果。未转染永生化基因的第2代人神经前体细胞(HSNp2)及经过RA诱导分化后的hTERT⁺细胞(HNSTert p18 RA诱导14天)均呈较低的端粒酶活性。而第18代次hTERT⁺细胞(HNSTert p18)的端粒酶活性明显升高，接近于阳性细胞人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞。所有样本均热灭活后端粒酶活性均明显降低，这符合端粒酶的特性。

如图12所示为利用RT-PCR测定不同培养代次的人hSN12W-TERT神经前体细胞均表达外源基因EGFP和hTERT。GAPDH是人3-磷酸甘油醛脱氢酶为内对照。1，代表未永生化的第2代人神经前体细胞；2-4代表第11，18和24代的hSN12W-TERT.

2、hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞的生长情况

如图13所示为相差显微镜显示hSN12W-TERT细胞的生长方式。A是以单层贴壁方式生长的hSN12W-TERT，体外培养4天。B为hSN12W-TERT细胞在培养20天后可形成神经球。

如图14表示体外PD为7，30条件下，hSN12W-TERT细胞的生长状况。两条曲线的趋势基本相同，说明体外连续培养并不改变细胞的增殖能力。

图15则通过BrdU(c)和Ki67(e)(BrdU阳性，说明细胞在分裂时将BrdU掺入其中。BrdU掺入实验标记细胞群体中处于DNA合成期(S期)的细胞比例。Ki67抗体可以检测处于细胞周期中的细胞，反映细胞群体中具有增殖能力的细胞数)免疫荧光染色进一步说明细胞的增殖能力。图15(d)、(f)中的影像分别是图(c)(e)相同视野的细胞核DAPI复染。

群体倍增(PD)次数及时间的测定。对数生长期细胞经消化、计数后，按2×10⁵/瓶接种于25cm²的培养瓶中，37℃，5％CO₂培养。每4天换液一次。当细胞生长至对数生长期时，将培养瓶中的细胞消化计数。按下列公式计算出hSN12W-TERT细胞的倍增时间为4.5天。

PD值＝(N_t/N₀)-1，T＝t lg2/lg(N_t/N₀)

T：群体倍增时间；t：接种至测定的间隔时间；N₀：接种时的细胞数；N_t：测定时的细胞数。

3、hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞保持正常染色体核型

(1)吉姆萨染色显带技术显示细胞染色体

取对数生长期细胞hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞一瓶。弃旧培养基，加入含0.2μg/mL秋水仙素的新鲜培养基37℃，5％CO₂培养8小时。弃培养液，用0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA(1∶1混合)消化细胞，吹打，制备单细胞悬液。离心，1500rpm，5分钟，弃上清。将细胞悬浮于低渗KCl(0.075M)溶液中，37℃水浴，孵育15分钟。离心，1500rpm，5分钟，弃上清，留少许低渗液。加新鲜配置的固定液2mL，混匀，室温固定20分钟。离心，1500rpm，5分钟，弃上清。加新鲜固定液，固定15分钟。离心，弃上清。将细胞悬浮在少许固定液中。用滴管滴加悬液于干净的4℃预冷的载玻片上，空气干燥。吉姆萨染色。油镜观察，照相。

如图16显示hSN12W-TERT(PD＝20)细胞为正常人二倍体，46条染色体，XY(男性核型)。说明转染端粒酶基因并未改变前体细胞的染色体数量。

(2)流式细胞仪分析测定细胞周期及染色体倍体

如图17显示培养早期以及中期hSN12W-TERT细胞周期分期及染色体倍体均未发生明显变化。(图中G0-G1代表DNA合成前期、S期代表DNA合成期、G2代表DNA合成后期、M代表细胞有丝分裂期。两组细胞各期的百分比比较无统计学差异。)

(3)裸鼠接种测定hTERT⁺神经前体细胞的致瘤性

分别收集对数生长期第9代hTERT⁺人胚神经前体细胞(PD＝13)以及阳性对照细胞SK-N-SH。离心，PBS洗3次，细胞计数。用PBS将细胞浓度稀释成1×10⁷/mL。4-6周龄雌性Babe/c裸鼠，随机分成三组，每组3只。每只裸鼠右侧腋部皮下接种0.2mL细胞悬液(含细胞数为2×10⁶)。阴性对照接种PBS，标记。每周观察一次，记录各组动物肿瘤块的形成。(见图18。)图中右图显示，hSN12W-TERT接种裸鼠40周后未发现肿瘤组织的形成，左图显示，神经母细胞瘤SH-N-SH接种至裸鼠2周后即出现肿瘤块(左图箭头所指)。

4、hTERT⁺细胞保持神经前体细胞的特性

(1)hSN12W-TERT神经前体细胞表达神经前体细胞的特异性基因

如图19，20所示，体外长期培养条件下hSN12W-TERT细胞(PD＝9)保持神经前体细胞增殖特性。图19所示(A图增殖条件下hSN12W-TERT细胞中表达神经前体细胞标志蛋白nestin(巢蛋白)的表达。B图为A图同视野细胞核DAPI染色。)图20A显示RT-PCR方法测定不同培养代次细胞内神经前体细胞标记物nestin(巢蛋白)和Sox2(GAPDH见第12页)表达的结果(分子量标准，1，代表未永生化的第2代人神经前体细胞；2-5代表第11，18，24，40代的hSN12W-TERT说明hSN12W-TERT细胞在体外连续增殖条件下仍保持前体细胞的特性)；B：免疫细胞化学示hSN12W-TERT细胞(第40代)vimentin(波丝蛋白)(a)表达。(b)为图(a)相同视野细胞核DAPI复染，(d)为图(a)与(b)的叠加。

(2)hSN12W-TERT神经前体细胞具有分化潜能

如图21所示，hSN12W-TERT在RA作用7天后，神经元标志物β-III-tubulin(A)免疫细胞化学染色结果。(B)为图(A)同视野细胞核DAPI复染(说明A图阳性细胞的比率，其它同)。图22所示，hSN12W-TERT在RA，BMP2，BDNF，GDNF的诱导下，均可分化成神经元。其中以RA，BMP2的作用较为明显。图23显示，在RA作用14天后，hSN12W-TERT细胞(PD＝20)中表示成熟神经元的MAP2a/b蛋白表达明显增高(A)。(B)为图(A)同视野细胞核DAPI复染。

图24所示，hSN12W-TERT在RA作用7天后，神经神经胶质细胞标志GFAP(A)免疫细胞化学染色结果。(B)为图(A)同视野细胞核DAPI复染。图25所示，hSN12W-TERT在RA，BMP2，BDNF，GDNF的诱导下，一部分细胞分化为表达神经胶质细胞标志GFAP的细胞。不同因子诱导组，GFAP阳性细胞的比例有一定差异。

(3)hSN12W-TERT神经前体细胞分化后形成的神经元具有电生理特性

a.钠钾电流

BMP2诱导hSN12W-TERT细胞7天后，利用全细胞膜片钳技术记录细胞的电生理活动。BMP2诱导组共成功封接记录了8个细胞，5个细胞记录到内向钠电流。钠电流的峰值为244±68pA(n＝5)。当应用保持电位为-70mV，去极化电位为-70mV-+100mV、步阶脉冲为10mV、刺激脉宽为50ms的方波钳制方案进行刺激时，可记录到内向钠电流(图26a)。根据实验数据制作电流-电压(I-V)关系曲线(图26b)可知该电流在复极至-40mV时被激活，0mV时达到峰值。在使用电极内液2，保持电位为-70mV，施与细胞去极化电位-100mV-+100mV，钳制时间为100ms的斜坡刺激，记录了6个细胞，记录到外向电流。钾电流的平均峰值为2810±840pA(n＝6，均数±标准差)。外向电流有两种不同类型，其中一种是快速激活、快速失活(图26c)；另外一种是快速激活、缓慢失活(图26d)。未分化细胞未能检测到内向电流(n＝5)。在某些细胞上可以记录到外向钾电流，但电流幅度较小。

b.钙成像

以Fluo-3作为细胞内游离钙的指示剂检测BMP2诱导hSN12W-TERT细胞3天，KCl(60mM)去极化前后细胞内游离钙离子浓度的变化后显示，负载Fluo-3后，静息状态下细胞胞浆内有较弱的绿色荧光在加入的KCl后1秒之内，绿色荧光的强度迅速增强至最强(图27a)，约60％的细胞胞浆内绿色荧光强度增加三倍或三倍以上(图27b)；在5分钟内，荧光强度又迅速恢复至静息状态(图27b)。

c.hSN12W-TERT分化为GABA能神经元

图28RT-PCR结果显示，在BMP2诱导细胞分化的3(B3)、5(B5)、7(B7)天过程中，与GABA能神经元发育相关的因子Mash1表达逐渐上调，Dlx2从第5天开始表达并逐渐增加；GABA能神经元的标记物GAD67(谷氨酸脱羧酶，即GABA合成的限速酶)表达上调，vGAT(囊泡型GABA转运体，将合成的GABA转运至囊泡运输)在BMP2作用第5天开始持续表达，GAT-1(GABA转运体，将GABA至重吸收GABA能神经元和胶质细胞)表达逐渐上调。

图29的免疫细胞化学结果显示，BMP2作用细胞7天后，GABA阳性细胞占细胞总数的61.2％(图29，e)，染色阳性部位在细胞的胞浆和突起(图29，b，c)；β-III-tubulin与GABA双标染色表明，97.6％的细胞同时表达这两种蛋白(图29，d)。

本发明中提到的几种培养液的配方如下：

所用NSA基础培养基的组成如下：DME M/F12：15.6g；葡萄糖：6.0g；BSA1.0g；NaHCO₃ 1.0g。

上述成分溶于1L高压灭菌的去离子水中，用0.22μm滤膜过滤后分装，4℃保存。

所述FBS-NSA培养基为：NSA基础培养基：88mL；青霉素/链霉素：1mL；L-谷氨酰胺(200mM)：1mL；胎牛血清(FBS)：10mL。

所述GF-NSA培养基为：NSA基础培养基：96.3mL；青霉素/链霉素(100万单位/mL)：1mL；N₂：1mL；胰岛素(10mg/mL)：0.2mL；L-谷氨酰胺(200mM)：1mL；EGF(0.1μg/μL)：20μL；bFGF(0.1μg/μL)：20μL；FBS：0.5ml。

所述步骤(3)中用GF-NSA培养基继续培养48小时后更换为下述诱导分化培养基：NSA基础培养基：96.8mL；青霉素/链霉素(100万单位/mL)：1mL；N₂：1mL；胰岛素(10mg/mL)：0.2mL；L-谷氨酰胺(200mM)：1mL。

诱导分化时分别加入BMP2(1ng/ml)、BDNF(10ng/ml)、GDNF(10ng/ml)、RA(1μm)。

本发明中提到的几种引物如下：

Claims

1、一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系，已于2008年2月21日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心》，其保藏号为CGMCCNo.2372。

2、如权利要求1所述的端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系，其建立步骤如下：

(1)、包装细胞的筛选及病毒上清的收获；

(2)、病毒感染原代培养人胚前脑神经前体细胞；

(3)、克隆法筛选hTERT+人胚前脑神经前体细胞；

(4)、hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞的扩增培养，利用免疫细胞化学，RT-PCR，以及电生理功能等方法对扩增的细胞进行特征测定，证明所获得的细胞是获得端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系。

3、根据权利要求2所述的端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系的建立方法，其特征在于：

所述步骤(1)的具体步骤如下：

(a)对数生长期PG13/JH1/hTERT包装细胞经0.25％胰蛋白酶消化后计数；

(b)用DMEM完全培养基将细胞稀释至浓度为100细胞/mL；取0.1mL细胞悬液接种于48孔板中，补加0.4mL完全培养液；37℃，5％CO₂条件下培养，每周半量换液，培养2-3周；

(c)相差显微镜观察定期观察48孔板中细胞生长状况；当细胞生长至60-80％汇合时，分别将细胞消化接种于6孔板中；继续培养；

(d)荧光显微镜定期观察各组细胞的荧光强度；培养1周后，挑选荧光较强的细胞扩增培养；

(e)收集培养液即病毒上清，用0.45μm低蛋白吸附膜过滤，分装1.5mL，-70℃保存；

所述步骤(2)的具体步骤如下：

(a)孕12周的人类胚胎前脑神经前体细胞分离计数后，按5×10⁵/mL的细胞密度接种于预先包被PLL的75cm²培养瓶中，加入10mL FBS-NSA培养基，37℃，5％CO₂培养12小时；将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基；

(b)原代分离的人神经前体细胞在GF-NSA培养基中生长72小时后进行病毒感染；弃培养液，加入高滴度的hTERT病毒上清6mL，GF-NSA完全培养基4mL，加入polybrene使其终浓度为8μg/mL，37℃，5％CO₂培养12小时；弃病毒上清，换成新鲜GF-NSA培养基，继续培养；细胞生长密度达到80-90％汇合后，传代；

(c)病毒感染步骤分别在第2、3代重复两次；

所述步骤(3)的具体步骤如下：

(a)病毒感染后的细胞消化后制成细胞悬液，计数；将细胞悬液稀释至2×10³/mL接种于包被PLL的75cm²培养瓶中，每瓶1mL细胞悬液，37℃，5％CO₂培养；

(b)定期观察细胞的生长，当出现明显的细胞克隆后，荧光显微镜观察各细胞克隆的荧光强度，并标记；

(c)克隆片定点消化表达荧光的细胞克隆，将细胞接种于24孔板中，然后依次通过6孔板，25cm²培养瓶进行扩增培养；

所述步骤(4)的具体步骤如下：

(a)筛选后的细胞，接种于包被PLL的培养中生长，培养基为GF-NSA培养基，37℃，5％CO₂培养；每3天换液一次，每7-10天传代一次；

(b)传代方式：培养细胞生长至90％汇合期，弃培养基，用0.025％胰蛋白酶/0.002％EDTA消化细胞1-3分钟，弃消化液，加入FBS-NSA培养基，进行吹打；细胞重悬于FBS-NSA培养基中，按1∶2的比例将细胞接种于PLL包被的培养瓶中，37℃，培养2小时，然后将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基继续培养，获得端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系hSN12W-TERT。

4、根据权利要求3所述的端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系的建立方法，其特征在于：所述步骤(a)中所述对数生长期PG13/JH1/hTERT包装细胞的建立过程如下：

(1)构建逆转录病毒载体，其步骤如下：

目的基因hTERT与报告基因之间通过内部核糖体进入位点IRES调节结构相连；将hTERT-IRES-tNGFR-EGFP基因插入经鼠干细胞逆转录病毒载体MSCV中；

(2)质粒的获得

(3)包装细胞PG13/JH1的培养与质粒转染

将PG13/JH1细胞按1-3×10⁵/mL的细胞密度接种到30mm²平皿中；37℃，5％CO₂培养12-24小时使细胞达到60-80％汇合时进行转染；质粒转染前，用PBS液洗细胞3次，加1ml无血清培养基Opti-MEM，37℃孵育30分钟；用无菌去离子水稀释质粒DNA，将20μl质粒DNA加入90μl水中混匀；将15μl Lipofectamine^TM2000缓慢加入稀释好的DNA中，边加边弹混匀并形成小泡；将质粒DNA与转染试剂的混合物加入细胞培养皿中，37℃，5％CO₂转染6小时；培养皿中补加1ml含20％FBS的DMEM完全培养液，继续培养；质粒转染20小时后，进行甘油休克；将37℃温育的含85％HBS和15％甘油溶液的休克液滴加在转染细胞表面，室温放置2.5分钟；将休克液吸弃，用PBS液洗细胞1次；加入新鲜的DMEM完全培养基培养24小时后传代；

(4)包装细胞株PG13/JH1/hTERT的筛选

将NIH3T3细胞接种在6孔培养板中，每孔细胞数为5×10⁴，加DMEM完全培养液2ml，37℃，5％CO₂培养24小时；每个克隆细胞株的病毒上清准备6个不同的稀释度病毒；分别取1ml不同稀释度的病毒上清加入培养NIH3T3的6孔培养板中，然后加入2μl浓度为4mg/ml的polybrene；37℃感染2-3小时；中间不断摇动几次，以增加病毒的吸附；3小时后每孔中加入1ml含20％FBS的完全培养基，继续培养，24小时后用0.25％胰蛋白酶消化细胞，2×10²/mL接种于75cm²培养瓶中，培养2周，计数细胞克隆；选取病毒滴度最高的PG13/JH1/hTERT细胞克隆株进行扩增培养。

5、一种权利要求1所述的端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系在用作人类中枢神经系统疾病研究和治疗相关疾病药物的药物中的应用。