JP2018502152A

JP2018502152A - ルテリオンを利用した癌細胞のテロメラーゼ抑制方法

Info

Publication number: JP2018502152A
Application number: JP2017554225A
Authority: JP
Inventors: ヨンアクォン; ウォンチョルチョイ; ソクフンチョイ; チャンフンチョイ
Original assignee: Luterion Co Ltd
Current assignee: Luterion Co Ltd
Priority date: 2015-01-05
Filing date: 2016-01-05
Publication date: 2018-01-25
Also published as: CN113633669A; CN107427592A; KR20160084322A; WO2016111530A1; HK1247104A1; EP3243528A4; US10406188B1; EP3243528A1; KR101766373B1

Abstract

本発明は、ルテリオンを利用した癌細胞のテロメラーゼ抑制方法に関し、より詳細にはルテリオンを含有する坑癌組成物；癌細胞のテロメラーゼ活性抑制用組成物；およびルテリオンを投与することを特徴とする癌組織、癌細胞または癌患者のテロメラーゼ活性抑制方法に関する。本発明によると、ルテリオンは癌細胞でテロメラーゼ活性を阻害して、正常細胞に影響なし、効果的に癌細胞の増殖だけを抑制させる効果がある。

Description

本発明は、ルテリオンを利用した癌細胞のテロメラーゼ抑制方法に関し、より詳細にはルテリオンを含有する坑癌組成物；癌細胞のテロメラーゼ活性抑制用組成物；およびルテリオンを投与することを特徴とする癌組織、癌細胞または癌患者のテロメラーゼ活性抑制方法に関する。

テロメラーゼは、染色体末端に対するテロメア反復配列の添加を触媒下はリボヌクレオタンパク質である（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１：１１３−１２９，１９９２）。テロメラーゼ活性は、造血間細胞（ｈｅｍａｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）のような特定細胞を除いた正常細胞では発見されない反面、多くの癌細胞では高いテロメラーゼ活性が観察される。テロメラーゼは、癌細胞の無限の増殖維持に関連していると考えられているので、テロメラーゼ活性の探知および定量は癌診断に大変重要である。さらには、テロメラーゼ活性の抑制剤は、正常細胞に対する副作用が殆どない抗癌剤として期待されている（ＣｏｕｎｔｅｒＣ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１１：１９２１−１９２９，１９８９；ＣｏｕｎｔｅｒＣ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２９００−２９０４，１９９４；ＣｈａｄｅｎｅａｕＣ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５５：２５３３−２５３６，１９９５；Ｈｉｙａｍａｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．，１：２４９−２５５，１９９５；ＳｈａｙＪ．Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：４２５−４３２，１９９５）。

ヒトテロメラーゼは、タンパク質およびＲＮＡをコードする遺伝子がクローニングされて（ＵＳ６，２６１，８３６）、テロメラーゼ抑制剤を探すための多くの研究が行われている。現在まで同定されたテロメラーゼ抑制剤は、小分子化合物およびオリゴヌクレオチドを含む。様々な文献は、テロメラーゼタンパク質成分をコードするｍＲＮＡ（これのヒト形態はヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはｈＴＥＲＴである）またはテロメラーゼ完全酵素のＲＮＡ成分（これのヒト形態はヒトテロメラーゼＲＮＡまたはｈＴＲとして知られている）に対して標的されたテロメラーゼを抑制するためのオリゴヌクレオチドなどがあり、ｈＴＥＲＴｍＲＮＡに標的されたオリゴヌクレオチドは、一般にｍＲＮＡに結合してｍＲＮＡの破壊を引き起こし、そのためｈＴＥＲＴタンパク質の生成を防ぐ伝統的なアンチセンス薬物として働くと考えられる（ＵＳ６，４４４，６５０）。ｈＴＲに標的された特定オリゴヌクレオチドは、テロメラーゼ完全酵素に存在するｈＴＲ分子に結合して、酵素機能を破壊する。ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎＴｅｌｏｍｅｒａｓｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）は、癌細胞の不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）能力を調節する最も重要な酵素の一つで、このテロメラーゼ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）は、無限に複製される生殖細胞、造血細胞および癌細胞で８０〜９０％のテロメラーゼ活性を有しているが、正常細胞は活性を有していない（Ｂｒｙａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１１：３１８−３２４，１９９９）。テロメラーゼのこのような特性を利用して細胞成長に関与するテロメラーゼの抑制剤を開発することによって癌細胞の増殖を抑制しようとする試みが近年盛んに行われている（Ｂｒｙａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔａｌ，ＥｍｂｏＪ．１４：４２４０−４２４８，１９９５；Ａｒｔａｎｄｉ，Ｓ．Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：８５２−８５５，２０００）。

テロメラーゼＲＮＡ成分、例えばペプチド核酸（Ｎｏｒｔｏｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１４：６１５−６１９，１９９６）とホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで定まったアンチセンス戦略によるテロメラーゼ活性の阻害が報告されている。テロメラーゼは、逆転写酵素であるため、ＡＺＴのような逆転写酵素、または他のヌクレオシドの阻害制を使用することも報告されている。

シスプラチンによる、可能には、テロマー反復配列の架橋結合によるテロメラーゼ阻害も公示されていて（Ｂｕｒｇｅｒｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３３：６３８−６４４，１９９７）、アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用してテロメラーゼ遺伝子の鋳型ＲＮＡであるｈＴＲの作用を防いでテロメラーゼの活性を防ぐ方法や（Ｐｉｔｔｓ，Ａ．Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：１１５４９−１１５５４，１９９８；Ｋｏｎｄｏ，Ｙ．ｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：２２０５−２２１１，２０００）、ハンマーヘッドリボザイム（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄｒｉｂｏｚｙｍｅ）を利用したテロメラーゼ鋳型ＲＮＡの抑制方法（Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｙ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５８：５４０６−５４１０，１９９８）、逆転写酵素の活性を防ぐ抑制剤（Ｓｔｒａｈｌ，Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６：５３−６５，１９９６）、正常なテロメラーゼ酵素活性を抑制するドミナントネガティブｈＴＥＲＴタンパク質の発現（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１３：２３８８−２３９９，１９９９；Ｈａｈｎ，Ｗ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５：１１６４−１１７０，１９９９）、そしてテロメア構造に作用してテロメラーゼの作用を抑制するＧ−クアドラプレックス（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）安定化に作用する小分子抑制剤（Ｐｅｒｒｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２：２６７９−２６８４，１９９９；Ｇｏｗａｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６０：９８１−９８８，２００ｌ；Ｇｏｗａｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６１：１１５４−１１６２，２００２；Ｉｚｂｉｃｋａ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５９：６３９−６４４，１９９９）等が知られている。

一方、本発明者等は、患者で既排出された体液内に存在する微細物質の特性を観察して、前記微細物質を「ルテリアル（Ｌｕｔｅｒｉａｌ）」と命名し、これに対する内容を２０１３年７月１２日付で特許出願をして（大韓民国出願番号第１０−２０１３−００８２０６０号）、前記ルテリアルを効果的に分離および培養する方法に対する内容を２０１４年１月１４日付で特許出願した（大韓民国出願番号第１０−２０１４−００４５２５号）。また、このようなルテリアルと類似の構造と可能を有する微細物質である「ルテリオン（Ｌｕｔｅｒｉｏｎ）」は、動植物に存在して、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを有するだけでなく、癌細胞の成長を防いで、細胞を健康な免疫体系で戻す役割をする。

従って、本発明者等はルテリオンを薬学または食品組成物に適用するために、植物に溶媒を添加して振盪させながら発生する気化ガスを収集した後、フィルタリングおよび遠心分離を介して前記気化ガスに含まれたルテリオンを効果的に分離および培養する方法に対する内容を２０１５年１月６日付で特許出願した（大韓民国出願番号第１０−２０１５−０００１１９５号）。

そこで、本発明者等は、新しいテロメラーゼ抑制物質を探そうと鋭意努力した結果、ルテリオンが癌細胞でテロメラーゼ活性を阻害して癌細胞の増殖を抑制させる効果を持つことを確認して、本発明を完成した。

本発明の目的は、本発明の目的は、テロメラーゼの活性抑制を介して癌細胞の増殖を抑制する坑癌組成物を提供するところにある。
本発明の他の目的は、癌組織、癌細胞または癌患者のテロメラーゼの活性抑制を介して癌の予防または治療方法を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、ルテリオンを有効成分として含有する癌の予防または治療用医薬組成物を提供する。

本発明はまた、ルテリオンを有効成分として含有する癌の予防または改善用食品組成物を提供する。

本発明はまた、ルテリオンを有効成分として含有する癌細胞のテロメラーゼ活性抑制用組成物を提供する。

本発明はまた、ルテリオンを有効成分として含有する組成物を投与することを特徴とする癌の予防または治療方法を提供する。

本発明はまた、ルテリオンを有効成分として含有する組成物を投与することを特徴とする癌組織、癌細胞または癌患者のテロメラーゼ活性抑制方法を提供する。

本発明はまた、ルテリオンを有効成分として含有する組成物を投与することを特徴とする癌細胞の増殖抑制方法を提供する。

本発明はまた、ルテリオンを有効成分として含有する組成物を癌の予防または治療に用いる用途を提供する。

本発明はまた、ルテリオンを有効成分として含有する組成物を癌組織、癌細胞または癌患者のテロメラーゼ活性抑制に用いる用途を提供する。

本発明はまた、ルテリオンを有効成分として含有する坑癌組成物を製造する用途を提供する。

ルテリオンを共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣｏｎｆｏｃａｌＬａｓｅｒＳｃａｎｎｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｚｅｉｓｓ）で撮影した写真で、その大きさを共に示したものである。ルテリオンをミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）で染色した後、その発色有無を観察した写真を示したものである。ルテリオンをローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）で染色した後、その発色有無を観察した写真を示したものである。ルテリオンの蛍光／非蛍光写真を比較して示したものである（Ａ：ヤヌスグリーンＢ（ＪａｎｕｓＧｒｅｅｎＢ）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｂ：ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｃ：ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）ＲｅｄＰｏｓｉｔｉｖｅ；Ｄ：無染色）。ルテリオンがローダミン１２３、ミトトラッカーレッド、ヤヌスグリーンＢ（ＪａｎｕｓｇｒｅｅｎＢ）によって共通して染色した後、その発色有無を示したものである（Ａ：ヤヌスグリーンＢ（ＪａｎｕｓＧｒｅｅｎＢ）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｂ：ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｃ：ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）ＲｅｄＰｏｓｉｔｉｖｅ；Ｄ：無染色）。ルテリオンの蛍光染色部位の大きさを測定してルテリオンの大きさ（５０〜８００ｎｍ）を示したものである（Ａ：ヤヌスグリーンＢ（ＪａｎｕｓＧｒｅｅｎＢ）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｂ：ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｃ：ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）ＲｅｄＰｏｓｉｔｉｖｅ；Ｄ：無染色）。ルテリオンが二重膜構造を有することを確認したＴＥＭ電子顕微鏡写真である。ルテリオンが内部に核酸を含有することを確認した原子顕微鏡写真である。ルテリオンの内部にＲＮＡが含まれているか否かを分析したバイオアナライザー結果である（Ｌ：Ｃｏｎｔｒｏｌ；１：５０ｎｍ以下、２：５０〜１００ｎｍ、３：１００〜２００ｎｍ、４：２００〜４００ｎｍ）。テロメラーゼ活性測定に対する計画を示した模式図である。ルテリオン処理による正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）および癌細胞（肺癌、乳癌、大腸癌）におけるテロメラーゼ活性を示したものである。ルテリオン処理濃度に応じた正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）および様々な癌細胞（肺癌、乳癌、大腸癌、肝臓癌、白血病）の細胞生存能を示したものである。多様な由来のルテリオンを処理したすい臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１）における細胞増殖抑制を示したものである。多様な由来のルテリオンを処理したすい肺癌細胞株（Ａ５４９）における細胞増殖抑制を示したものである。多様な由来のルテリオンを処理したすい乳癌細胞株（ＢＴ−２０）における細胞増殖抑制を示したものである。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明で使用する用語「ルテリアル（ｌｕｔｅｒｉａｌ）」および「ルテリオン（ｌｕｔｅｒｉｏｎ）」とは、動物および植物を含むすべての生命体に存在する５０〜４００ｎｍ大きさのナノ生命体で、ウイルスと類似する程度からフュージョン時８００〜１２００ｎｍまでの大きさを有する反面、１２００ｎｍ以上で遺伝子異常および病理現象を発現する変異体に分類される微細物質を本発明者が命名したものである。ルテリアルおよびルテリオンは、ＤＮＡとＲＮＡを共に含み（図８〜図９）、運動性と付着性を有する点でエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）や微小小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）とは区別される。ルテリアルは、生態系で宿主体内に存在するナノ生命体を意味して、ヒトを含む動物の場合には、血液、唾液、リンパ管、精液、膣液、母乳（特に、初乳）、臍帯血、脳細胞、脊髄、骨髄に存在することができる。一方、ルテリオンは宿主が食べ物などとして使用できるナノ生命体を意味して、植物や食品に主に存在することができる。

ミトコンドリアは、ヤヌスグリーンＢ（ＪａｎｕｓｇｒｅｅｎＢ）および蛍光染色であるローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（ＡｃｒｉｄｉｎｅＯｒａｎｇｅ）、およびＤＡＰＩによって発色が確認されるが、前記ルテリオンおよびルテリアルもミトコンドリアと同じ染色剤によって発色が確認されて（図１〜図６）、ミトコンドリアと類似して二重膜を有する膜構造として内部クリステ（ｃｒｉｓｔａｅ）構造を完成しなかった状態の構造を有して（図７）、ミトコンドリアと同じレーザー波長範囲で観察される点で「類似ミトコンドリア」、「ミトコンドリア類似体」あるいは「ミトコンドリア前駆体（ｐｒｏｔｏ−ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」とも称してもよい。

ルテリオンは、植物の幹の部分に多量存在して、本発明者等は、植物由来ルテリオンを分離して、その特性を解明して特許を出願したことがある（大韓民国特許出願１０−２０１５−０００１１９５）。前記分離したルテリオンは次のような特性を有する：
（ａ）正常の場合、赤血球より小さい大きさ（５０〜２００ｎｍ）の原形ないし楕円形で、運動性がある；
（ｂ）核酸含有；
（ｃ）免疫化学蛍光染色時ミトコンドリアと類似の反応を示す；
（ｄ）フュージョン（ｆｕｓｉｏｎ）および／またはフィジョン（ｆｉｓｓｉｏｎ）生態様式を示す；
（ｅ）フュージョンがない場合には大きさが３００ｎｍまで成熟して、ＤＮＡ含有類似ミトコンドリアに成熟して、ＳＥＭまたはＴＥＭ電子顕微鏡写真上でミトコンドリアと類似する構造を示す；
（ｆ）フュージョンが発生する場合には数千ｎｍまで大きくなる；
（ｇ）癌患者由来の場合、正常由来より大きさ（長径５００ｎｍ以上）が大きく、形態が不均一な変異ルテリアル発生；および
（ｈ）エキソソームとは異なる光反応を示す。
追加的に、次の特性中一つ以上を有することを特徴とする：
（ｉ）自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す；
（ｊ）２００〜４００ｎｍ大きさでＡＴＰを産生する；
（ｋ）付着性がある；
（ｌ）二重膜構造；
（ｍ）特定条件で変異ルテリアルはｂｕｒｓｔｉｎｇされ、ｂｕｒｓｔｉｎｇ以後にはｓｔｅｍｎｅｓｓを有する；
（ｎ）ｐ５３遺伝子およびテロメア調節機能を有する；および
（ｏ）ＣＤ３９またはＣＤ７３の表面抗原を有する。

また、ルテリオンは、室温でも速く溶解したり消滅はせず、長期間保管してもフュージョン（ｆｕｓｉｏｎ）して突然変異化されない特性がある。

ルテリオンおよびルテリアルは、シグナリング、細胞分化、細胞死滅だけでなく細胞サイクルおよび細胞成長の調節とも関連があると予想されるが、本発明者はその中でもルテリアルが癌の診断に密接な関連があることを発見した（大韓民国特許出願１０−２０１３−００８２０６０号、ＷＯ２０１５００５５５３）。また、正常細胞ではルテリオン処理によってテロメラーゼ発現が増加してテロメアの長さが増加したこと（大韓民国特許出願１０−２０１５−００００７５２２号）を確認して、ルテリオンは正常細胞ではテロメラーゼ活性を増進させる抗老化活性を示すことを確認することができた。

本発明で「正常細胞」とは、癌細胞と共に増加したテロメラーゼ活性を有して、無限増殖をする表現型を有する細胞でなく正常な老化プロセスを有する細胞を意味する。

本発明の用語「テロメラーゼ」とは、テロメアの末端に対するテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）反復の添加を触媒するリボ核酸タンパク質を意味する。テロメアは、染色体の末端を覆う反復配列の長い拡張であり、染色体を安定させるものであると考えられる。人において、テロメアは、典型的に長さが７−１０ｋｂで、配列−ＴＴＡＧＧＧ−の多重反復を含む。テロメラーゼは多くの成人細胞で発現されず、テロメアの長さは、連続的な原形の複製を減少させる。細胞複製が特定回数以上になると、テロメアは次第に縮小されて、細胞が末端崩壊段階に入ることになり、これによって細胞は老化することになる。テロメラーゼは、体細胞で不活性であるが、癌細胞の９０％では活性であり、テロメラーゼ抑制剤は癌と戦うのに有用であり得る。

本発明の一実施例では、正常細胞ではルテリオン処理によってテロメラーゼ発現および活性が増加した一方、癌細胞株にルテリオンを処理した結果、テロメラーゼ発現および活性が減少したことを確認することができた。すなわち、ルテリオンは、癌細胞のテロメラーゼ活性のみを抑制させることを確認することができた。

従って、一観点において、本発明は、ルテリオンを有効成分として含有する癌細胞のテロメラーゼ活性抑制用組成物に関する。

また、本発明では、正常細胞にルテリオンを処理して細胞生存能に影響がないことを確認して、癌細胞株に多様な由来のルテリオンを処理した結果、癌細胞の増殖を抑制することを確認することができた。すなわち、ルテリオンは、正常細胞には影響を及ぼさないと共に癌細胞の増殖だけを抑制させることを確認することができた。
従って、第二観点において、本発明は、テリオンを有効成分として含有する癌の予防または治療用医薬組成物に関する。

本発明のルテリオンは、漆（Ｒｈｕｓｖｅｒｎｉｃｉｆｌｕａ）由来であることを特徴とするが、これに限定されない。例えば、下記の表１〜４に記載された薬用植物由来ルテリオンを使用することができる。ルテリオンはすべての植物および動物に存在するため、表１〜４に記載された薬用植物に制限されない。

また、本発明で使用されるルテリオンはその密度が１以下で、脂肪および脂質よりは高い密度を有してタンパク質よりは低い密度を示すので、水蒸気蒸留法によって植物から分離することができるが、これに限定されない。

本発明で使用されるルテリオンは次のような水蒸気蒸留法によって植物から分離することができる。
（ａ）植物に溶媒を添加して、５０〜９０℃で空気または酸素を利用して間欠的にバブリングしながら振盪する段階；
（ｂ）前記振盪によって気化される水蒸気またはガスを捕集した後、冷却させて凝縮液を収得する段階；
（ｃ）０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して前記収得された凝縮液をフィルタリングする段階；
（ｄ）前記フィルタリングされた凝縮液を遠心分離する段階；および
（ｅ）前記遠心分離された上澄み液から植物由来ルテリオンを分離する段階；
本発明で使用されるルテリオンは、ルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射下に１８〜３０℃で培養して使用することができる。

本発明の一具体例で、哺乳動物癌細胞のテロメラーゼを阻害して、テロメラーゼ陽性細胞をして癌を治療する方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体または塩内に治療学的に有効な量のルテリオンを含む。

本発明の組成物は、他のテロメラーゼ関連状態または疾患、例えば乾癬のような異なる過増殖性または自己免疫疾患、リューマチ関節炎、免疫系抑制が求められる免疫系障害、毒蔦または毒オークに対する免疫系反応などの治療にも使用することができる。

また、癌治療に対する治療学的利点は、ＵＳ５，６５６，６３８；ＵＳ５，７６０，０６２；ＵＳ５，７６７，２７８；ＵＳ５，７７０，６１３およびＵＳ５，８６３，９３６に記載されたとおり、他のテロメラーゼの阻害制をはじめ、本発明のテロメラーゼ阻害制を他の抗癌剤と組み合わせることによって実現され得ることを理解できるはずである。このような組み合わせの選択は、限定はしないが、疾患の種類、患者の年齢および一般健康状態、疾患進行の攻撃性、治療しようとする病んだ細胞のＴＲＦ長さおよびテロメラーゼ活性、そして前記組み合わせ物を含む製剤に対する患者の耐性をはじめとする様々な因子に従う。例えば、癌進行が進展した状態に到達した場合、本発明のテロメラーゼ阻害化合物を癌の大きさを減少させるのに効果的な他の製剤と治療摂生（例えば、放射線療法、手術、化学療法および／またはホルモン治療）と組み合わせることを推薦することができる。また、場合によっては、本発明のテロメラーゼ阻害製剤を疾患の副作用を治療する一つ以上の製剤、例えば鎮痛剤、または患者自身の免疫反応（例えば、コロニー刺激因子）を刺激するのに効果的な製剤と組み合わせることを推薦することができる。
本発明のルテリオン組成物は、任意の適した手段によってヒトまたは動物対象に投与され得る。

本発明のルテリオン組成物は、ヒトまたは動物対象に経口または非経口投与方法で筋肉内、脳内、（静脈内含む）血管、皮下、鼻腔内、心臓内、脳室内、腹腔内または経皮投与されることができ、一般に注射によって投与されることができ、好ましくは血管注射（例えば、静脈）または筋肉注射の形態で投与されることができ、患者の特性により投与に必要な経路を調整することができる。

本発明の組成物は、非経口、筋肉内、脳内、（静脈内含む）血管、心臓内、脳室内、腹腔内、皮下、鼻腔内または経皮投与を含まず任意の適した手段用に剤形化されることができる。非経口投与のための組成物は、また、バッファー、希釈剤および他の適当な添加剤を含むことができ、滅菌水溶液を含んでもよい。

本発明の組成物は、ルテリオン以外に薬学的に許容可能な担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、保存剤およびその他薬学的に許容可能な担体などを含んでもよく、医薬組成物として剤形化されることができる。

「薬学的に許容される担体（賦形剤）」とは、患者に一つ以上の核酸を伝達するためのエージェントまたは他の薬学的に不活性化して、本発明の薬剤学的組成物に使用されることができる薬剤学的に許容される担体としては、これらに限定されず、イオン交換樹脂膜、アルミナ、ステアレート、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、様々リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムおよび亜鉛塩）、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基材、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン・ブロック共重合体、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂などが含まれる。

薬剤学的組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液として滅菌注射用製剤の形態であってもよい。これらの懸濁液は、適した分散剤または湿潤剤（例えば、ツイン８０）および懸濁化剤を用いて当分野で公知の技術によって剤形化されることができる。滅菌注射用製剤は、また、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であってもよい。許容可能に使用されることができビークルおよび溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液等がある。また、滅菌不揮発性油が通常溶媒または懸濁化媒質として使用される。このような目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含んで刺激性が少ないいかなる不揮発性油も使用することができる。オレイン酸およびこれのグリセリド誘導体のような脂肪酸が薬剤学的に許される天然オイル（例えば、オリーブ油または蓖麻子油）、特に、これらのポリオキシエチレポリオキシエチル化されたのと同様に注射製剤に有用である。

本発明の組成物は、治療学的に有効な量で投与される。投与経路および必要な摂生投与量は、特に、治療患者の状態、年齢、体重の深刻性に応じて種々にパラメータにより決定することができる。最適な投与量は、個別構造の相対的効能により変わることがあり、一般に推定された試験管内および生体内動物モデルで効果的であることが発見ＥＣ５０ｓに基づく。一般に、投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇで、患者の年齢、体重および患者の状態、疾病の重症度と頻度および投与経路、構造の異なる投与量は、投与、筋肉内注射または組織（静脈注射または皮下）注射の有無に応じて調節して投与することができる。

本発明の組成物は、また、経口投与のための栄養補助食品または機能食品として剤形化されてもよい。機能食品剤形または経口薬学的組成物に適した賦形剤は、例えば、マンニトール、ラクトース、グルコース、スクロース、セルロース、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウムおよび／または炭酸マグネシウムのような薬学的等級の担体を含む。経口液体剤形の使用のために、組成物は、例えば、水性食塩水、水性テクストロース、グリセロールまたはエタノール、好ましくは水または通常の食塩水のような水性担体中の水和に適した固体または液体の形態で供給される溶液、懸濁液、エマルジョンまたはシロップとして製造されてもよい。好ましくは、本発明の組成物は、また、湿潤剤、乳化剤またはバッファーのような少量の非毒性補助物質を含有してもよい。本発明のルテリオンは、機能食品剤形に統合されてもよく、薬用植物抽出物を含んでもよい。

従って、第三観点において、本発明は、ルテリオンを有効成分として含有する癌の予防または改善用食品組成物に関する。
また、第四観点において、本発明は、ルテリオンを有効成分として含有する組成物を投与することを特徴とする癌の予防または治療方法に関する。
第五観点において、本発明は、ルテリオンを有効成分として含有する組成物を投与することを特徴とする癌組織、癌細胞または癌患者のテロメラーゼ活性抑制方法に関する。
第六観点において、本発明は、ルテリオンを有効成分として含有する組成物を投与することを特徴とする癌細胞の増殖抑制方法に関する。
第七観点において、本発明は、ルテリオンを有効成分として含有する組成物を癌の予防または治療に用いる用途に関する。
第八観点において、本発明は、ルテリオンを有効成分として含有する組成物を癌組織、癌細胞または癌患者のテロメラーゼ活性抑制に用いる用途に関する。
第九観点において、本発明は、ルテリオンを有効成分として含有する坑癌組成物を製造する用途に関する。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：ルテリオンの分離
薬用植物である漆（Ｒｈｕｓｖｅｒｎｉｃｉｆｌｕａｓｔｏｋｅｓ）１００ｇを２０−３０倍の大きさ、すなわち２−３リットル容器の大きさに合わせて切断して容器に入れて、植物の５〜８倍である５００〜８００ｇ（好ましくは植物の６倍、すなわち６００ｇ）の蒸溜水を容器に投入した後、８０℃以下で全湯を行った。約８時間程度全湯をするが、約３時間毎に２０〜３０分間酸素でバブルリングを加えて植物のルテリオンがかたまらないようにした。前記バブリング後抽出時スチームされる気化した水蒸気をフラスコに収集した。前記収集した水蒸気を冷却して凝縮させて収得した凝縮液にＩＲ光線（波長：３〜１０００ｕｍ内外、好ましくは２００〜６００ｕｍ）を１−２時間照射してルテリオンが変異されないようにした。その後、０．８μｍ以上の径の空隙を備えるフィルターを利用して前記凝縮液をフィルタリングして、フィルターを通過した凝縮液だけ１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間繰り返し遠心分離した。前記遠心分離を介して収得した上澄み液にはＩＲ光線を照射して運動性を有して集まるルテリオン粒子をピペットを利用して分離して、前記分離したルテリオンを５０ｎｍ径の空隙を備えるフィルターを通過させてフィルタリングされなかった部分だけＰＢＳで洗浄して漆由来ルテリオンを収得した。前記過程によって長径５０−８００ｎｍのルテリオンを収得することができ、これは暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡によって観察確認が可能であった。前記収得したルテリオンは大きさに応じて５０−２００ｎｍ（発生期）／２００−４００ｎｍ（成熟期）／４００−６００ｎｍ（分裂期）／６００−８００ｎｍ（過分裂期）に区分した。
同様の方法で表１〜４に記載された薬用植物からルテリオンを収得した。

実施例２：ルテリオン処理による癌細胞のテロメラーゼ活性
正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）および癌細胞（ＮＣｌ−Ｈ１９７５、ＭＤＡ−ＭＡ−４６８、ＷｉＤｒ）１×１０^６細胞／ｍｌをそれぞれ６０ｍｍプレートに接種した後、約１２時間後に実施例１で分離されたルテリオンを５０μｇ／ｍｌの濃度で処理して培養した。細胞培養は、ＰＳＦ（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）抗生剤がない条件で、１％ＦＢＳＤＭＥＭ培地を使用して３７℃、５％ＣＯ_２培養器で行った。細胞接種４８時間後に収穫してテロメラーゼ活性を測定した。

ＴＲＡＰｅｚｅ（登録商標）ＴｅｌｏｍｅｒａｓｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を利用したＴＲＡＰ分析でテロメラーゼ活性を分析した結果、ルテリオン処理によって癌細胞（ＮＣｌ−Ｈ１９７５、ＭＤＡ−ＭＡ−４６８、ＷｉＤｒ）のテロメラーゼ発現および活性が減少することを確認することができた（図１１Ｂ）。

また、正常細胞であるＦｉｂｒｏｂｌａｓｔを対象に、同様の実験と分析を行った結果、ヒト正常細胞では対照群（ルテリオン未処理群）に比べてテロメラーゼ発現および活性が増加することを確認することができた（図１１Ａ）。

実施例３：ルテリオン処理による癌細胞増殖抑制
種々のヒト癌細胞株（肺癌（ＮＣＩ−Ｈ１９７５）、大腸癌（ＷｉＤｒ）、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−４８６）、肝臓癌（ＨＣＣ３８）、白血病（ＡＧＨ−７７））および正常細胞株（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）でルテリオンの癌細胞に対する細胞毒性を測定するためにＭＴＴ分析を実施した。

５×１０^４細胞／ｍｌの細胞浮遊物を９６−ウェル（ｗｅｌｌ）底が平らなマイクロタイター板の各ウェル（ｗｅｌｌ）に１００ｕｌずつ接種して２４時間培養させた後、様々な濃度のルテリオン含んでいる培地に取り替えた後、さらに４８時間培養させた。その後各ウェルに培地で１０倍希釈された非水溶性の黄色のＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）溶液１００ｕｌを添加する。細胞内のホルマザン結晶が生成されるように温度３７℃および５％二酸化炭素濃度のインキュベーターに保管した。約４時間後余分の培地を除去した後、細胞内形成された非水溶性のホルマザンを溶解させるために、各ウェルにＤＭＳＯを２００ｕｌずつ添加した後、マイクロプレートリーダーを利用して５９５ｎｍで吸光度を分析した。

ルテリオンを処理しなかった対照群の吸光度を１００％として、各濃度に対する癌細胞の生存率を測定した結果、濃度依存的に癌細胞の生存率を減少させた反面、正常細胞では細胞毒性がなかった（図１２）。

さらに、前記癌細胞株の他にＡｓＰＣ−１すい臓癌細胞株、Ａ５４９肺癌細胞株、ＢＴ−２０乳癌細胞株で多様な由来のルテリオンの癌細胞増殖抑制効果を確認した。細胞生存率測定は前記ＭＴＴ分析法と同様に行って、実施例１の方法で分離した多様な由来のルテリオンは癌細胞に対して細胞増殖抑制効果を示した（図１３〜図１５）。

従って、本発明のルテリオンを有効成分として含む組成物は癌細胞の増殖を抑制して癌を予防または治療することができることが分かった。

本発明によるルテリオンを含む組成物は癌細胞でテロメラーゼ活性を阻害して、正常細胞では影響がないかまたはテロメラーゼ活性を増進させて、効果的に癌細胞の増殖だけを抑制させる抗癌効果がある。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims

ルテリオンを有効成分として含有する癌の予防または治療用医薬組成物。
ルテリオンを有効成分として含有する癌細胞のテロメラーゼ活性抑制用組成物。
前記ルテリオンは、羌活（Ostericum koreanum Maximowicz）、独活（Aralia continentalis Kitagawa）、ケイガイ（Schizonepeta tenuifolia Briquet）、ボウフウ（Saposhnikovia divaricata Schischkin）、生地黄（Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel）、茯苓（Poria cocos Wolf）、前胡（Angelica decursiva Franchet et Savatier）、車前子（オオバコ）（Plantago asiatica Linne）、クコ（枸杞子）（Lycium chinense Miller）、ミシマサイコ（Bupleurum falcatum Linne）、沢瀉（Alisma orientale Juzepzuk）、木通（Akebia quinata Decaisne）、玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsley）、カロコン（Trichosanthes kirilowii Maximowicz）、猪苓（Polyporus umbellatus Fries）、黄連（Coptis japonica Makino）、苦参（Coptis japonica Makino）、黄柏（Phellodendron amurense Ruprecht）、知母（Anemarrhena asphodeloides Bunge）、熟地黄（Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel）、山茱萸（Cornus officinalis Siebold et Zuccarini）、牡丹皮（Paeonia suffruticosa Andrews）、トックリイチゴ（Rubus coreanus Miquel）、忍冬藤（Lonicera japonica Thunberg）、薄荷（Mentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud ex Holmes）、梔子（Gardenia jasminoides Ellis）、連翹（Forsythia viridissima Lindley）、牛蒡子（Arctium lappa Linne）、猿梨（Actinidia arguta PLANCH）、彌猴桃（Actinidia arguta Fructus）、木瓜（Chaenomelis Fructus）、ブドウ根（Vitis vinifera Radix）、ロコン（Phragmitis Rhizoma）、梅桃（Prunus tomentosa Thunb）、五加皮（Acanthopanax sessiliflorum SEEM）、松花粉（Pinus densiflora S. et Z）、杵頭糠半匙（rice bran on a mallet head）、アブラマツ（Pinus tabulaeformis）、蕎麦米（Semen Fagopyri）、漆（Rhus verniciflua）、センキュウ（Cnidium officinale Makino）、当帰（Angelica Gigas Nakai）、陳皮（Citri Unshius Pericarpium）、赤何首烏（Polygonum multiflorum Thunberg）、白首烏（Cynanchum wilfordii Hemsley）、朝鮮人参（Panax ginseng C. A. Meyer）、白朮（Atractylodes japonica Koidzumi）、蒼朮（Atractylodes lancea De Candlle）、乾姜（生姜）（Zingiber officinale Roscoe）、肉桂（桂皮）（Cinnamomum cassia Presl）、青皮（ウンシュウミカン）（Citrus unshiu Markovich）、カワミドリ（Agastache rugosa O. Kuntze）、紫蘇葉（Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo）、棗（Zizyphus jujuba Miller var. inermis Rehder）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fischer）、附子（Aconitum carmichaeli Debeaux）、香附子（Cyperus rotundus Linne）、黄耆（Astragalus membranaceus Bunge）、白芍藥（Paeonia lactiflora Pallas）、小茴香（Foeniculum vulgare Miller）、高良姜（Alpinia officinarum Hance）、大腹皮（Areca catechu Linne）、半夏（Pinellia ternata Breitenbach）、南星（Arisaema amurense Maximowicz var. serratum Nakai）、益智（Alpinia oxyphylla Miquel）、枳実（カラタチ）（Poncirus trifoliata Rafinesque）、厚朴（Magnolia ovobata Thunberg）、木香（Aucklandia lappa Decne）、呉茱萸（Evodiae rutaecarpa Bentham）、破古紙（Psoralea corylifolia Linn）、葱白（Allium fistulosum Linn）、砂仁（Amomum villosum Loureiro）、山査子（Crataegus pinnatifida Bunge）、麻黄（Ephedra sinica Staph）、甘菊（chrysanthemum indicum Linne）、桔梗（Platycodon grandiflorum）、杏仁（杏子）（Prunus armeniaca var. ansu Max.）、ビャクシ（Angelica dahurica BENTH. et HOOK）、麦門冬（Liriope muscari BALL）、天門冬（Asparagus cochinchinensis Merr）、山薬（山芋）（Dioscorea japonica THUNB）、酸棗仁（Zizyphus jujube）、龍眼肉（Dimocarpus longan Lour）、糸姫萩（Polygala tenuifolia）、石菖蒲（Acorus graminens SOLAND）、五味子（Schizandra chinensis BAALL）、乾栗（Castanea crenata S.et Z.）、ハトムギ（Coix lachryma-jobi var. ma-yuen）、大根（Raphanus sativus L）、葛根（クズ）（Pueraria thunbergiana）、黄苓（Scutellaria baicalensis GEORG）、藁本（Angelica tenuissima NAKAI）、鹿茸（Cervi Parvum Cornu）、大黄（Rheum palmatum）、升麻（Cimicifuga heracleifolia KOM）、柏子仁（Biota orientalis ENDL）、桑白皮（桑）（Morus alba L）、フキタンポポ（Tussilago farfara）、白果（Gingko biloba L）、麝香草（Thymus vularis）およびトウサイカチ（Gleditsia japonica Miquel var. koraiensis Nakai）で構成された群から選択される薬用植物から由来したことを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
前記薬用植物は、漆（Rhus verniciflua）であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
ルテリオンを有効成分として含有する癌の予防または改善用食品または食品添加剤。
ルテリオンを有効成分として含有する組成物を投与することを特徴とする癌の予防または治療方法。
ルテリオンを有効成分として含有する組成物を投与する工程を含む癌組織、癌細胞または癌患者のテロメラーゼ活性抑制方法。
ルテリオンを有効成分として含有する組成物を投与することを特徴とする癌細胞の増殖抑制方法。
ルテリオンを有効成分として含有する組成物を投与する工程を含む癌の予防または治療に用いる用途。
ルテリオンを有効成分として含有する組成物を癌組織、癌細胞または癌患者のテロメラーゼ活性抑制に用いる用途。
ルテリオンを有効成分として含有する坑癌組成物を製造する用途。