JP2013535500A - 活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、気体バブリング処理を施して活性型フラボノイド化合物の含量を増加させたウルシ抽出物と、上記ウルシ抽出物の製造方法及びフスティンを含有する溶液に気体バブリング処理を施してフスティンをフィセチンに転化させる方法に関する。
本発明によるウルシ抽出物の製造方法は、既存の高含量のフスティン、低含量のフィセチンを含有していたウルシ抽出物を、高含量のフィセチンを含有するウルシ抽出物に転化することができる。したがって、本発明によるウルシ抽出物は、優れた生理活性によって天然抗がん剤、抗がん及びがん予防用食品、健康機能食品などで商業化することができ、またウルシの高付加価値で関連産業の発展を図ることができる。さらに、本発明によるフスティンをフィセチンに転化させる方法は、他の天然物にも適用して高い活性のフラボノイド含量を増加させて機能性を向上させる方法として利用することができて、天然物の高機能性化を導く基盤技術になることができる。

Description

本発明は、ウルシ抽出液に気体バブリング処理を施して活性型フラボノイド化合物の含量を増加させるウルシ抽出物の製造方法、上記方法によって製造されたウルシ抽出物及びフスティンを含有する溶液に気体バブリング処理を施してフスティンをフィセチンに転化させる方法に関する。

ウルシ（漆、Rhus verniciflua Stokes）とは、ウルシ科（Anacardiaceae family）に属する落葉小高木であって、中央アジアの高原地帯及びヒマラヤ地方が原産地として知られており、現在、全世界的に熱帯地方を中心に亜熱帯地方と温帯地方まで広く分布し、落葉性又は常緑性であって殆どが高木又は潅木性であるが、一部は蔓性で育たれる（Barkley Fred Alexander.，Ann. of the Missouri Bot. Garden., 24（3）, pp265-500, 1937）。

ウルシの樹液は漆液と呼ばれ、漢方では古くから漆液を乾燥した乾漆が、お血（extravasated blood）を無くし、且つ血液循環を促進させ、駆虫、腹痛、胃酸過多、鎮咳、肺結核、痛経（Dysmenorrhea）、便秘、糖尿、マラリア、消炎、関節炎、防腐、健胃、女人経脈不通などに効果があると知られており、最近は、抗がん効果についても報告されている（Namba, T., Colored Illusteations of Wakan Yaku. p215, Hoikusha Publishing Co., Ltd., Osaka, 1980）。また、民間医学では、ウルシが山参と比べるほど効果があるとし、消化剤、肝でのお血、心臓には清血剤として心臓病を治め、肺では結核菌を無くし、その他神経痛、関節炎、皮膚病などにも優れた薬になると知られている。

既に多くの研究を通じてウルシが多量の抗酸化物質を有していることが知られている。具体的に、ウルシエタノール抽出物における強い抗酸化活性効果と共に、ウルシ抽出物をシリカカラムを用いて分離精製した分画物が人体血液がん細胞の成長を阻害する能力があることが知られている。また、ウルシエタノール抽出物において抗微生物効果を持つ物質が分離され、ウルシ皮メタノール抽出物では肥満抑制効果を示すなどウルシ抽出物に関した多様な生理活性効果が知られている。

これまでウルシ属（Genus）から発見された化合物としてはフィセチン（Fisetin）、フスティン（Fustin）、アガチスフラボン（Agathisflavone）、エイコサンジオン酸（Eicosanedioic acid）、ユウロペチン（Europetein）、ブテイン （Butein）、コーリラギン（Corilagin）、３'４'−ジヒドロキシ（Dihydroxy）−フラボン（flavone）、ランタベツル酸（Lantabetulic acid）、ミリセチン（Myricetin）、シリンギン（syringtin）、セミアラト酸（Semialatic acid）、パラシトリン（Palasitrin）、スルフレチン（Sulfuretin）、３−ペンタデシル（pentadecyl）−１,２−ベンゼンジオール（benzenediol）、デメトキシカヌギン（demethoxy kanugin）、オバリテノン（Ovalitenone）、セミモロン酸（Semimornic acid）、２−(３,４−ジヒドロキシベンジル（Dihydroxybenzyl））−２,６−ジヒドロキシ（Dihydroxy）−３(２Ｈ)−ベンゾフラノン（benzofuranone）、メスアフェロンＡ（Mesuaferrone A）、レソケンペロール（Resokaempferol）、ロイフォリン（Rhoifolin）、ルスフラバノン（Rhusflavanone）、スッセダネアフラバノン（Succedaneaflavanone）、フィセチン；７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（Giucopyranoside）、ビラワノール（Bhilawanol）、タンニン（Tannin）、ハイドロラッコール（Hydrolaccol）、ステラシアニン（Stellacyanin）、ケルセチン（Quercetin）及びシナリン（cynarine） などがあり、そのうち、最も多い含量の成分はフスティンである。

これら成分は主にフラボノイド系物質であって、フィセチン及びフスティンのようなフラボノイドは血管や毛細管を保護する作用がある。のみならず、フィセチンとフスティンは抗酸化能及び抗炎、抗がん活性を有している非常に優れた生理活性物質である。しかし、ウルシ抽出物に多量含まれているフスティンは生理活性の側面でフィセチンに比べてその活性が大きく低下しているという短所がある。一方、フィセチンは、現在、抗がん剤として活用されるほど強い抗がん活性を有しているが、通常のウルシ抽出物はフスティンの量がほとんどを占めており、フスティンに比べてフィセチンは少量含有されているという問題点があった。

そこで、優れた生理活性を有するフィセチンを多量含有したウルシ抽出物を製造することができるとしたら、ウルシ抽出物は相対的に優れた抗がん活性及び生理活性を有するようになるところ、食品及び医薬産業においても非常に有用に使われることが望まれる。

したがって、本発明者らはウルシ抽出物中のフラボノイド化合物の含量を調節して、より卓越した生理活性を有するウルシ抽出物を製造する方法に関する研究を遂行してきた。

これにより、本発明者らは抗酸化活性及び抗がん活性を始め、多様な生理活性を有するフィセチンを多量に含有する新規なウルシ抽出物の製造方法を開発し、本発明を完成した。

よって、本発明の目的は、ウルシ抽出物に多量に含有されているフラボノイド化合物であるフスティンを活性型フラボノイドであるフィセチンに転化させることにより活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物を提供することである。

上記目的を達成するために、本発明は、抽出溶媒を用いてウルシを抽出する段階；及び気体バブリング処理を遂行する段階を含む活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物の製造方法を提供する。

本発明の一実施形態において、上記気体は酸素を含むことができる。

本発明の一実施形態において、上記気体バブリング処理は、ウルシの抽出と同時に遂行するか、ウルシの抽出を完了した後に遂行することができる。好ましくは、上記気体バブリング処理は、抽出槽の内部で抽出液に気体をバブリング処理するか、又は抽出槽の外部でバブリング気体と抽出液を接触させる方式であることができる。

本発明の一実施形態において、上記活性型フラボノイド化合物はフィセチンであることができる。

本発明の一実施形態において、上記ウルシ抽出液は水、酒精、メタノール（methanol）、エタノール（ethanol）、プロパノール（propanol）、イソプロパノール（isopropanol）、ブタノール（butanol）、アセトン（acetone）、エーテル（ether）、ベンゼン（benzene）、クロロホルム（chloroform）、エチルアセテート（ethyl acetate）、メチレンクロライド（methylene chloride）、ｎ−ヘキサン（hexane）、塩酸、酢酸、ギ酸、クエン酸及びシクロヘキサン（cyclohexane）、石油エーテル及びこれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも１つの抽出溶媒で抽出することができる。

本発明の一実施形態において、上記気体は空気であり、気体バブリング処理時間は ６〜２４時間であることができる。さらに好ましくは８〜１２時間であることができる。

本発明の一実施形態において、上記気体は高純度、好ましくは純度が９５％（ｖ/ｖ） 以上の酸素であり、さらに好ましくは純粋酸素であり、気体バブリング処理時間は５〜１２時間であることができる。さらに好ましくは７〜１０時間であることができる。

また、本発明は、ウルシ抽出液に気体バブリング処理を施して製造されたフィセチン：フスティンの含量が１：０〜２：１の範囲であることを特徴とするウルシ抽出物を提供する。これはフィセチン：フスティンの含量比値が２以上であることと同じ意味である。

また、本発明は、フスティンを含有する溶液に気体バブリング処理を施す段階を含むフスティンをフィセチンに転化させる方法を提供する。

本発明の一実施形態において、上記気体は空気であり、上記気体バブリング処理時間は６〜２４時間であることができる。さらに好ましくは８〜１２時間であることができる。

本発明の一実施形態において、上記気体は高純度、好ましくは純度が９５％（ｖ/ｖ） 以上の酸素であり、さらに好ましくは純粋酸素であり、上記気体バブリング処理時間は５〜１２時間であることができる。さらに好ましくは７〜１０時間であることができる。

また、本発明は、フィセチン：フスティンを１：０〜２：１の含量比で含むウルシ抽出物を提供する。

また、本発明は、上記ウルシ抽出物を有効成分として含有するがん予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

また、本発明は、上記ウルシ抽出物を有効成分として含有するがん予防又は改善用健康食品を提供する。

本発明によるウルシ抽出物の製造方法は、既存の高含量のフスティン、低含量のフィセチンを含有していたウルシ抽出物に気体バブリング処理を施してフスティンをフィセチンに転化させることにより、高含量のフィセチンを含有するウルシ抽出物を提供することができる。したがって、本発明によるフィセチンが多量含有されたウルシ抽出物は、優れた生理活性によって天然抗がん剤、抗がん及びがん予防用食品、健康機能食品などで商業化することができ、さらにウルシの高付加価値で関連産業の発展を図ることができる。また、本発明によるフスティンをフィセチンに転化させる方法は他の天然物にも適用して高い活性のフラボノイド含量を増加させる方法として利用することができて、天然物の高機能性化を導く基盤技術になることができる。

ウルシ抽出物に空気バブリング処理時、時間によるフスティンのフィセチンへの転化効果を示すグラフである。 ウルシ抽出物に高純度の酸素バブリング処理時、時間によるフスティンのフィセチンへの転化効果を示すグラフである。

本発明は抽出溶媒を用いてウルシを抽出する段階；及び気体バブリング処理を遂行する段階を含む活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物の製造方法を提供する。

ウルシ（Rhus verniciflua）はウルシ科に属する落葉高木を称し、亜熱帯又は熱帯に分布して全世界的に６０属４００種の木がこれに属する。ウルシ抽出物に含まれている活性型フラボノイド中の１つであるフィセチン（2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,7-dihydroxy-4H-chromen-4-one-hydrate,3,3',4',7'-tetrahydroxyflavone）は、その生理活性において、抗がん（Haddad AQ et. al., Nutr. Cancer, 2010, 62(5), 668-81）、抗痴呆（Zheng LT et. al., Int. Immunopharmacol., 2008, 8(3), 484-94）、記憶力改善（Maher P. et. al., PNAS, 2006, 103(44), 16568-73）、関節炎症状の改善（Lee JD et. al., Int. Immunopharmacol., 2009, 9(3), 268-76）、抗炎（Geraets L. et. al., Biochem. Biophys Res Commun. 2009, 382(3), 598-603）、血行改善（Park YH et. al., J. Ocul Pharmacol. Ther., 2004, 20(3), 189-200））などの非常に多様な分野で優れた効能を持っていると知られている。

ウルシは、樹齢が古いほど薬理成分として知られているフラボノイド成分の含量が増加する。一般的に１０年生以上になってはじめて抽出物基準で抽出物中に１５〜２０％（ｗ/ｗ）程度のフラボノイドを含有することになる。そのうち、１３〜１７％（ｗ/ｗ）が式１で表されるフスティン（2,3-Dihydrofisetin）であり、１〜３％（ｗ/ｗ）が式２で表されるフィセチンであり、それ以外にスルフレチン、ブテインなどが微量含有されている。

このように、ウルシ抽出物に多量含まれた成分であるフスティンは、フィセチンと同様に抗酸化及び抗がん活性などを有してはいるが、有用な生理活性がフィセチンに比べて大きく低下していることが知られている。本発明者らが確認したフスティンとフィセチンの抗酸化活性の比較実験からもこれが裏付けられる（表１参照）。すなわち、本発明の一実施形態によれば、フスティンとフィセチンの抗酸化活性の比較実験結果、フィセチンの抗酸化活性がフスティンに比べて４倍以上優れることが確認できた。

よって、フスティンは卓越した抗がん及び抗酸化活性を示す活性型フラボノイドであるフィセチンに比べて相対的に低い生理活性効果を示すことから、本発明ではフスティンを「非活性フラボノイド」と称する。

本発明は、ウルシ抽出物に多量含まれたフスティンを生理活性に優れた活性フラボノイドであるフィセチンに転化させることによりウルシ抽出物を製造する方法を提供し、本発明の方法で製造されたウルシ抽出物には活性型フラボノイド化合物が多量含有されているという特徴がある。

本発明によるウルシ抽出物の製造方法はウルシ抽出液に気体バブリング処理を施す段階を含む。

上記ウルシはウルシ科に属する木を意味するのであって、本発明において使用することができるウルシの種類は、ヤマウルシ、漆樹（Rhus verniciflua Stokes）、ヌルデ、シタウルシ、ハゼノキ、ヤマハゼのうち少なくとも１種を使用することができるが、これに限定されるものではなく、好ましくは漆樹を使用することができる。

本発明ではウルシ抽出液を抽出するための適切な溶媒として水又は有機溶媒を使用することができ、好ましくは水、酒精、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、エーテル、ベンゼン、クロロホルム、エチルアセテート、メチレンクロライド 、ｎ−ヘキサン、塩酸、酢酸、ギ酸、クエン酸、シクロヘキサン、石油エーテルなどの各種溶媒を単独で、あるいは混合して使用することができる。さらに好ましくは水、酒精、メタノールを使用することができ、最も好ましくは水を使用することができる。

本発明のウルシ抽出液は通常の抽出物の製造方法によって製造されたものであることができる。具体的には熱水抽出法、冷浸抽出法又は温浸抽出法などによって製造されることができ、通常の抽出器機、超音波粉砕抽出機又は分画機を用いることができる。また上記溶媒で抽出した抽出物は、次いで濾過するか、濃縮又は乾燥過程を遂行して溶媒をとり除くことができ、濾過、濃縮及び乾燥を全て遂行することができる。具体的に、上記濾過は濾過用フィルターを用いて減圧又は加圧濾過することができ、上記濃縮は真空下で減圧濃縮することができる。また、上記から得た抽出物は濃縮及び乾燥を通じて水分を完全に除去させることができ、上記水分を完全に除去させたウルシ抽出物は粉末状で使用するか、上記粉末を蒸溜水又は通常の溶媒に溶かして使用することができる。したがって、本発明のウルシ抽出物の抽出及び転化工程によって得られた活性型フラボノイド化合物を高割合で含有するウルシ抽出物は濾過、濃縮、乾燥の過程を経て抽出液又は抽出物粉末で製品化することが可能である。

また、上記バブリング処理段階で使われる気体としては、反応を妨げない限り酸素を含む気体を使用することができ、好ましくは空気又は高純度の酸素、さらに好ましくは純粋酸素を使用することができるが、これに限定されるものではない。

以下、本発明による活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物の製造方法をより詳しく調べてみる。

ウルシに抽出用溶媒として水、酒精、有機溶媒又はその希釈液を加えて、加温し、抽出する。抽出過程で抽出液又は濃縮液に気体、好ましくは酸素を含有した気体をバブリング（Bubbling）する。この過程は、既にウルシから抽出されて抽出液に多量含まれているフスティン、すなわち非活性フラボノイド化合物を活性型フラボノイドであるフィセチンに転化させる工程であって、上記気体バブリング段階は抽出と同時に、又は一定時間の抽出が進行された後に、又は抽出が完了した抽出液を濃縮して濃縮液を作った後に進行することができる。

バブリング気体としては酸素を含む気体を使用することができ、好ましくは空気又は高純度の酸素、さらに好ましくは純粋酸素を使用することができるが、酸素の純度が高くなるほど処理時間を縮めても等しい効果が得られる長所がある。バブリング気体に含まれている酸素の純度は、空気の場合は２０％（ｖ/ｖ）である。酸素の純度が９５％(ｖ/ｖ）以上の高純度の酸素を供給する方式によれば、酸素の純度が高くなるほどフスティンのフィセチンへの転化所要時間が短縮され、酸素の純度が低くなるほど転化時間が長くなり、完全な転化まで多くの時間が必要となる。

バブリング処理時間が１時間以下で短い場合は、フスティンのフィセチンへの転化がほとんどないか、極めて微々たるものであって、一定時間組成の変化がないＬａｇ−ｔｉｍｅが存在するところ、適当な気体バブリング処理時間が要求されるが、過度な酸素のバブリングはフスティンがフィセチンに転化された後、また分解されてしまうため、適切な時間の選定が必ず必要である。

これまで本発明の方法と類似の方法を用いてアレルギー誘発物質の除去に適用したことは、大韓民国特許第１０−０９１８３２６号に言及されているが、フスティンを高活性のフィセチンに転化する技術に対する記録はない。アレルギー誘発物質の除去は酸素の供給と同時に進行されて短時間に完了する一方、フスティンがフィセチンに転化されることはアレルギー誘発物質の除去が終了する時点から徐々に進行される。したがって、本発明のフスティンをフィセチンに転化することは、その処理条件が従来の文献で言及されたか、発明されたことのない新しい技術的思想であると言える。

バブリング処理気体が空気の場合は、本発明による活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物を製造するために、空気バブリング処理を６〜２４時間持続することが好ましく、８〜１２時間持続することがさらに好ましい。

また、バブリング処理気体が高純度の酸素の場合は、本発明による活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物を製造するために、バブリング処理を５〜１２時間持続することが好ましく、７〜１０時間持続することがさらに好ましい。

酸素をバブリングする量と時間は、一般的に気体の体積流量（Volumetric flow rate、l/min）を基準とし、さらに好ましくは単位体積流量（VVM、l/min/Volume）であって、体積流量を溶液の容積で分けた値とする。供給時間は１〜４０時間で気体供給流量によって差があるが、一般的に１２時間が経過する場合、ほとんどのフスティンがフィセチンに転化されるので、それ以上の供給はあまり意味がない。勿論、気体の供給速度が極めて低い場合はフィセチンへの完全な転化のために２０時間以上の時間がかかることがある。よって、フスティンのフィセチンへの転化率は供給する気体の流量又は気体供給時間の変化で調節可能である。

したがって、本発明では上記の気体バブリング処理段階によって活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物を提供することができ、ウルシ抽出液に存在していた既存フスティン含量の４５〜１００％がフィセチンに転化されたウルシ抽出物を提供することができる。すなわち、本発明によるウルシ抽出方法を通じて既存のウルシ抽出物の必須構成成分であったフスティンは実質的に全てフィセチンに転化されることができるところ、本発明によるウルシ抽出物では実質的にフスティンが存在しないことがある。

これにより、本発明はフィセチン：フスティンを１：０〜２：１の含量比で含むウルシ抽出物を提供することができる。

ウルシ抽出液にバブリングする気体の条件は圧力又は純度を基準とし、圧力の場合、大気圧状態でブロワーなどを通じて抽出機の下部で持続的にバブリングするか、高圧のガスを供給してバブリングする方法が可能であり、これは抽出機の内圧によって影響を受けない。すなわち、抽出機又は濃縮機の内圧を相対気圧として０〜１０気圧の範囲で維持しても効果には変化がなく、圧力が高くなるほど酸素の溶解度が増加することになるので、これによって処理時間の短縮が可能であるが、高圧を維持するための設備費用の急激な増加で経済性及び安全性が著しく低下する。

本発明によるウルシ抽出物の製造方法において気体バブリングは、通常的に抽出槽の下部で気体を供給する場合に言及される方式であるが、抽出槽の内部に適切な管を設置して、これを通じて気体を供給する方式で施行することができ、抽出槽の外部で抽出液がバブリング気体と接触できる機会を別途に提供する方法によっても提供することができる。ここには、通常の液体、気体接触システムが該当されることができるが、抽出槽の上部又は別途の空間で気体と抽出液が接触できるより広い面積を提供することを含む。したがって、本発明による気体バブリング処理段階は、ウルシ抽出液を抽出した抽出槽の内部で気体を抽出液にバブリングする方法、抽出槽の外部でバブリング気体と抽出液を接触させる方法、気体と抽出液を同じ方向又は逆方向に同時に流す方法、又は抽出液と気体を混合する機械としてインラインミキサーのような装置を使用して施行することができる。

本発明の製造方法によるウルシ抽出物は追加的な分画過程を通じてフィセチンを高含有する分画物に再構成することができる。すなわち、有機溶媒としてアセトン、エチルアセテート、ｎ−ブタノール、クロロホルムなどを使用して溶液分画する場合、フィセチンの含量が５〜２５％（ｗ/ｗ）である抽出物からフィセチンの含量を ３０〜４５％(ｗ/ｗ）に向上させた分画物を製造することができる。また、これを再結晶する過程でフィセチンの純度を９０％（ｗ/ｗ）以上に高めた精製物を得ることもできる。しかし、本発明のウルシ抽出物の製造方法が適用されない場合は、有機溶媒を用いて分画を行ってもフスティンの干渉によって分画/再結晶を通じた高純度のフィセチンが得られ難い。よって、本発明の転化法に従って分画/再結晶を行う場合、高純度のフィセチンを多量に得られる方法を提供する。

一般的にウルシ抽出物の製造方法はウルシに水、酒精又は希釈酒精を加えて、加温し、抽出した後、これを濃縮/乾燥して得られる。このような場合、ウルシ抽出物の中でフラボノイドの組成はフスティン１０〜３０％（ｗ/ｗ）、フィセチン１〜４％（ｗ/ｗ）、及びその他フラボノイドの含量が０.１〜２％（ｗ/ｗ）で構成される。フラボノイドの場合、ウルシの樹齢が古いほどその含量が増加する。ウルシ中のフスティンとフィセチンの割合は大抵一定した範囲で維持され、樹齢によってその全体含量は増加する。この場合、フィセチン：フスティンの含量比は最小１：２.５から最大１：３０まで該当され、一般的に１：５〜１：１５の含量比を有する。

このようにフィセチン：フスティンの含量比は一般的に１：２.５〜３０の範囲であるが、本発明に係るウルシ抽出物の製造方法によるウルシ抽出物の場合は、フィセチン：フスティンの含量比を１：０.２以下に低く調節することができる。一般的にフィセチン：フスティンの含量比は１：１の場合から活性の差が大きく生じ、５：１以上になることが好ましい。これはフィセチンがフスティンより５倍多いことを意味するものであって、既存のウルシ抽出物に比べてフィセチンの含量が格段に増加したことを示す。この場合、抗酸化、免疫増強などの生理活性があると知られているポリフェノール化合物の含量も４０〜７０％（ｗ/ｗ）で非常に高い値を維持している。

高純度の酸素を供給してフスティンをフィセチンに実質的に完全に転化させる場合、フィセチン：フスティンの含量比は１：０.００１の水準に維持することもできる。これはほとんど全てのフスティンがフィセチンに転化されることを意味し、得られたフィセチンを高含有するウルシ抽出物はより高い生理活性を有するウルシ抽出物になる。

したがって、本発明による活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物は、既存のウルシ抽出物に比べて卓越した生理活性、すなわち抗がん、抗痴呆、記憶力改善、関節炎改善、抗炎、抗酸化、血液循環改善などの効能を持つようになる。

本発明の一実施形態においても、普通のウルシ抽出物に比べて本発明による製造方法を通じて製造されたウルシ抽出物の抗がん活性及び抗酸化活性が非常に優れることが確認できた（実施例３及び実施例４参照）。特に、本発明によるウルシ抽出物の抗がん活性と関連して、本発明の一実施形態で、一般的なウルシ抽出物と本発明によるウルシ抽出物を投与したラットにおけるがん細胞の成長阻害効果を比較した結果、本発明によるフィセチンを多量含有したウルシ抽出物を投与したラットの場合が一般的なウルシ抽出物を投与したラットに比べて、腫瘍の重量と容積が著しく小さいことが確認できた（表３参照）。これは、優れた抗がん活性を有すると知られているフィセチンが多量に含有された本発明によるウルシ抽出物の卓越した抗がん活性を裏付ける結果であると言える。

このようにして、本発明はフィセチン：フスティンを１：０〜２：1の含量比で含むウルシ抽出物を有効成分として含有する抗がん用組成物を提供することができ、上記本発明の組成物はがん予防及び治療のための薬学的組成物として使用することができる。また、本発明による抗がん用組成物は組成物の総重量に対してウルシ抽出物を０.１〜１００重量％で含むことができる。

本発明の組成物が予防又は治療することができるがんの種類には、肝がん、胃がん、大腸がん、肺がん、乳がん、直腸がん、血液がん及びすい臓がんなどがあるが、これに限定されるものではない。

本発明による抗がん用組成物は、薬学的に有効な量のウルシ抽出物を単独で含むか、少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体（キャリア）、賦形剤又は希釈剤を含むことができる。上記において「薬学的に有効な量」とは、がんの症状を予防、改善及び治療するのに十分な量のことを意味する。

本発明によるウルシ抽出物の薬学的に有効な量は０.５〜１００ｍｇ/ｄａｙ/体重ｋｇであり、好ましくは０.５〜５ｍｇ/ｄａｙ/体重ｋｇである。しかし、上記薬学的に有効な量は、がんの症状の程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間などによって適切に変化されることができる。

また、上記において「薬学的に許容しうる」という表現は、生理学的に許容されてヒトに投与されたとき、通常的に胃腸障害、めまいのような異常反応又はこれと類似した反応を起こさないことを意味する。上記担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。また、充填剤、抗凝固剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含むことができる。

また、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後に活性成分の迅速、持続又は遅延放出を提供できるように、当業界における公知方法を使用して剤形化することができる。剤形は粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質又は硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形であることができる。

本発明による抗がん用組成物は経口、経皮、皮下、静脈又は筋肉を含む多くの経路を通じて投与されることができ、活性成分の投与量は投与経路、患者の年齢、性別、体重及び患者の重症度など、多くの因子によって適宜選択することができる。また、本発明の抗がん用組成物はがんの症状を予防、改善又は治療する効果を持つ公知の化合物と並行して投与することができる。これにより、本発明は上記ウルシ抽出物を有効成分として含有するがんの症状の予防及び/又は治療用薬剤を提供することができる。

さらに、本発明による抗がん用組成物は優れた抗がん及び抗酸化作用を通じてがんの症状を緩和させる効果を提供するだけでなく、がんの症状の予防及び改善を目的とする食品に添加することができるので、本発明の組成物はがんの症状の予防及び改善のための食品用組成物としても使用することができる。よって、本発明の組成物はがんの症状の予防及び改善に効果がある食品、例えば、食品の主原料、副原料、食品添加剤、機能性食品又は飲み物で容易に活用することができる。

本発明において、上記「食品」とは、栄養素を１つ又はそれ以上含有している天然物又は加工品を意味し、好ましくはある程度の加工工程を経て直接食べられる状態になったものを意味する。通常の意味として、食品、食品添加剤、機能性食品及び飲み物を全て含む。

本発明による抗がん用組成物を添加することができる食品としては、例えば、各種の食品類、飲み物、ガム、お茶、ビタミン複合剤、機能性食品などが挙げられる。さらに、本発明において使われる食品としては、特殊栄養食品（例えば、調剤乳類、乳幼児食など）、食肉加工品、魚肉製品、豆腐類、ムク類（starch gel）、麺類（例えば、ラーメン類、ヌードル類など）、パン類、健康補助食品、調味食品（例えば、醤油、みそ、コチュジャン（red pepper paste）、混合醤など）、ソース類、お菓子類（例えば、スナック類）、キャンディ類、チョコレート類、ガム類、アイスクリーム類、乳加工品（例えば、発酵乳、チーズなど）、その他加工食品、キムチ、づけ食品（各種のキムチ類、漬物など）、飲み物（例えば、果実飲料、野菜飲料類、豆乳類、醗酵飲料類など）、天然調味料（例えば、ラーメンスープなど）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。上記食品、飲み物又は食品添加剤は通常の製造方法で製造することができる。

また、上記「機能性食品」とは、食品に物理的、生化学的、生物工学的手法などを用いて該当食品の機能を特定目的に作用、発現するように付加価置を与えた食品群や、食品組成が持つ生体防御リズム調節、疾病防止と回復などに関する体内調節機能を生体に対して十分に発現するように設計加工した食品を意味し、具体的には健康機能性食品であることができる。上記機能性食品には食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含むことができ、機能性食品の製造に通常的に使われる適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。

また、上記「飲み物」とは、喉の渇きを癒すために、又は味を楽しむために飲むものを総称し、機能性飲料を含む。上記飲み物は必須成分として上記がんの症状の予防及び改善用組成物を定められた割合で含むこと以外、他の成分には特に制限はなく、通常の飲み物と共に様々な香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。

さらに、上述したもの以外に、本発明の組成物を含有する食品は様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含むことができ、上記成分は独立的に、又は組み合わせて使用することができる。

本発明の抗がん組成物を含有する食品において、上記本発明による組成物の量は全体食品重量の０.００１重量％〜１００重量％で含まれることができ、好ましくは０.１重量％〜４０重量％で含まれることができ、飲み物の場合、１００ｍlを基準で０.００１ｇ〜５ｇ、好ましくは０.０１ｇ〜２ｇの割合で含まれることができるが、健康及び衛生を目的とするか、健康調節を目的とする長期間摂取の場合には上記範囲の以下であることができる。有効成分は安全性面で何ら問題がないため、上記範囲の以上の量で使われることができ、上記範囲に限定されるものではない。

よって、本発明は、本発明によるウルシ抽出物を有効成分として含有するがん疾患の予防又は改善のための健康機能性食品を提供することができ、上記食品の形態は粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲み物の形であることができるが、これに限定されるものではない。

一方、本発明による活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物の製造方法は、前述のように生理活性の効果が相対的に低い非活性フラボノイド化合物を生理活性の効果に優れた活性型フラボノイド化合物に転化させることにその特徴がある。このとき、上記非活性フラボノイド化合物はフスティンであることができ、活性型フラボノイド化合物はフィセチンであることができる。したがって、本発明はフスティンをフィセチンに転化させる方法を提供することができる。

上記のフスティンをフィセチンに転化させる方法はフスティンを含有する溶液に気体バブリング処理を施す段階を含む方法であり、上記気体バブリング処理の段階は抽出槽の内部で気体を抽出液にバブリングする方法又は抽出槽の外部でバブリング気体と抽出液を接触させる方法で遂行することができる。上記フスティンを含有する溶液は天然物から抽出した抽出物であることができ、フスティンとフィセチンを共に含有している溶液又は抽出物、あるいはフスティンのみを含有している溶液又は抽出物であることができる。

また、上記バブリング処理の気体が空気の場合は、本発明によるフスティンをフィセチンに転化させる方法を通じて高含量のフィセチンを含有した溶液を製造するためには、バブリング処理を６〜２４時間持続することが好ましく、さらに好ましくは８〜１２時間持続することができる。

一方、上記バブリング処理の気体が高純度の酸素の場合は、本発明によるフスティンをフィセチンに転化させる方法を通じて高含量のフィセチンを含有した溶液を製造するためには、バブリング処理を５〜１２時間持続することが好ましく、さらに好ましくは７〜１０時間持続することができる。

よって、本発明は、フスティンが多量含有された抽出物又は溶液を、生理活性機能に優れた活性型フラボノイド化合物であるフィセチンが多量含有された抽出物又は溶液に転化することができる。

以下、本発明を実施例に基づいて詳しく説明する。

但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。

＜実施例１＞気体バブリングによるウルシ抽出物の製造
ウルシ抽出物に含まれたフスティンとフィセチンの含量はＨＰＬＣを用いて分析し、標準品はシグマアルドリッチ社から購入した。ＨＰＬＣ分析条件はＤｅｔｅｃｔｏｒで２５４ｎｍのＵＶを使用し、移動相は、酢酸：メタノール：アセトニトリル＝７０：２０：１０の５％混合溶液を使用した。流量は１ｍl/ｍｉｎで総１０μlを注ぎ込んだ。カラムはＣ_１８（２５０ｍｍｘ４.６ｍｍ, ＹＭＣ Ｐａｃｋ）を使用した。ポリフェノールの分析はＦｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ’ｓフェノール試薬を用いてタンニン酸を標準物質にして分析した。発色後７２５ｎｍで吸光度を測定して標準物質を用いた外部検量線法で計算した。

＜１−１＞空気バブリングによるウルシ抽出物の製造
漆樹１０ｋｇに水１００lを加えて、９５℃で６時間抽出した。抽出する間４時間が経過して抽出液にフラボノイド成分がかなり多く含まれたとき、空気（酸素の割合２０％（ｖ/ｖ））を１.５l/分の速度で抽出機の下部でバブリングさせた。バブリング時間は総１２時間とし、１時間ごとに試料を採取して成分の分析を行った。

その結果、時間が経つにつれてフスティンの含量が著しく減少し、フィセチンの含量は増加した（図１）。１１.５時間が経ったときは実質的にフスティンの１００％が全てフィセチンに転化された。上記ウルシ抽出液は、濾過し、真空濃縮後に粉末化して茶色の乾燥粉末０.５６ｋｇを得たが、最終産物である抽出物粉末の中でフスティンの含量は０.０１％（ｗ/ｗ）であり、フィセチンの含量は１６.７％（ｗ/ｗ）であり、ポリフェノールの含量は５６.４％（ｗ/ｗ）であった。すなわち、本発明者らは本発明によるウルシ抽出物の製造方法を通じて、活性の低いフスティンが活性型フラボノイドであるフィセチンに全て転化された抽出物を得ることができた。

＜１−２＞高純度の酸素バブリングによるウルシ抽出物の製造
上記実施例＜１−１＞と同様に漆樹１０ｋｇに水１００ｌを加えて、９５℃でウルシ抽出物を抽出した。４時間の上記抽出過程を通じて抽出液にフラボノイド成分がかなり多く含まれたとき、高純度の酸素（純度９５％（ｖ/ｖ）以上）を酸素ボンベを用いて１.２ l/分の速度で抽出機の下部でバブリングさせた。バブリング時間は総１２時間とし、１時間ごとに試料を採取して成分の分析を行った。

その結果、時間が経つにつれてフスティンの含量が著しく減少し、フスティンの含量が減少することによってフィセチンの含量が増加した（図２）。処理時間が８.８ 時間に至ったとき実質的にフスティン化合物の全部（１００％）がフィセチンに転化された。転化される速度は空気を使用した場合に比べて素早く、完璧に進行された。また、バブリング時間が必要以上に長くなる場合は、フスティンが転化されて生成されたフィセチンの含量が多少減少する傾向を示したので、適切な処理時間の重要性が分かった。上記抽出液は、濾過し、真空濃縮した後に粉末化して茶色の乾燥粉末０.５５ｋｇを得た。最終産物である抽出物粉末中のフスティンの含量は０.００％（ｗ/ｗ）であり、フィセチンの含量は１２.９％（ｗ/ｗ）であり、ポリフェノールの含量は５８.２％であった。

＜比較例１＞一般的なウルシ抽出物の製造
漆樹１０ｋｇに水１００lを加えて、９５℃で６時間加熱しながら抽出した。抽出した抽出物は、濾過し、真空濃縮した後に粉末化して茶色の乾燥粉末で０.５７ｋｇを得た。上記最終抽出物粉末中のフスティンの濃度は１７.３％（ｗ/ｗ）であり、フィセチンの濃度は１.６３％（ｗ/ｗ）であった。かかる一般的なウルシ抽出物の製造過程を経たウルシ抽出物に含まれたフィセチン：フスティンの含量比は１：１０.６であり、ポリフェノールの含量は５３.１％であった。すなわち、バブリング処理をしない普通の抽出方法によって抽出したウルシ抽出物の場合は、フスティンがフィセチンの含量の１０倍以上に多く含有されていた。

＜実施例２＞多様な溶媒を使用したウルシ抽出物の製造
様々な抽出溶媒を使用して本発明によるウルシ抽出物を製造した。これのために、抽出溶媒には精製水、５０％酒精、８０％酒精、８０％メタノール、１００％酒精を使用し、それぞれの抽出溶媒を使用した抽出過程中、時間によるフスティンのフィセチンへの転化率を調査して９０％の転化が行われる時間を相互比べた。ウルシ抽出物は、上記実施例と同様に漆樹１０ｋｇに１０倍数の抽出溶媒を加えて、９５℃で抽出し、０.３ＶＶＭ（volume/volume/min）で高純度の酸素を抽出機の下部でバブリングしながら１時間ごとに抽出物をサンプリングしてフィセチンへの転化率を調査した。その結果を下記の表２に示した。

上記の表２に示すように、本発明によるウルシ抽出物の製造方法で製造した抽出物は、使用された溶媒の種類を問わず、気体バブリング処理によって抽出物中のフスティンがフィセチンに転化されることが確認できた。但し、溶媒中の水の含量が少なくなるほど処理時間は長くなる傾向を示した。したがって、上記の結果から、本発明者らは抽出条件において溶媒の種類によってフィセチンへの転化率を高めるために処理時間を調節しなければならないことを見出した。

＜実施例３＞本発明によるウルシ抽出物の抗がん活性分析
本発明によるウルシ抽出物の抗がん活性を分析するために、まず上記比較例１で製造した一般的なウルシ抽出方法によるウルシ抽出物と、実施例 ＜１−１＞で製造した本発明のウルシ抽出物及び実施例６の「Ａ」試料の抗がん活性を相互比べた。

抗がん活性の分析は、ラットに、本発明によるウルシ抽出物を経口投与しながらがん細胞の成長阻害効果を比べる方式で行った。ヒトの非小細胞肺癌株（non−small cell lung cancer cell line）であるＡ５４９を５×１０^５細胞ずつヌードラット（Immunodeficient mice（male）, CanN. Cg-Foxn1nu/CrljBgi）の皮下に注射し、対照群（control group）、比較例１の群及び実施例 ＜１−１＞の群に区分して各群に７匹のヌードラットを割り当てた。対照群のヌードラットには何れの抽出物も投与せず、比較例１の群には比較例１から抽出した一般的な普通のウルシ抽出物を、実施例 ＜１−１＞の群には実施例 ＜１−１＞から抽出した本発明によるウルシ抽出物を投与した。３００ｍｇ/ｋｇの用量で２４日間経口投与し、投与期間中に１週に２回ずつＣａｌｉｐｅｒで腫瘍の長軸と短軸を測定して、次のような算式（Ａ＝長軸長さ、Ｂ＝短軸長さ）で腫瘍の容積を計算し、２７日目には腫瘍を除いて重量を測定した。
Ｖ（腫瘍の大きさ、mean tumor volume、mm²）＝ＡＢ^２／２

その結果、表３に示すように、既存の抽出物を投与した動物モデル群と比べたとき、実施例 ＜１−１＞群のラットの腫瘍の重量と容積が著しく小さいことが示された。これにより、本発明によるウルシ抽出物は、優れた腫瘍増殖の抑剤効果があることが確認できた。

＜実施例４＞本発明によるウルシ抽出物の抗酸化活性の分析
本発明によるウルシ抽出物の抗酸化活性を分析するために、まず上記比較例１で製造した一般的なウルシ抽出方法によるウルシ抽出物と、実施例 ＜１−１＞で製造した本発明のウルシ抽出物の抗酸化活性を相互比べた。

抗酸化活性の測定はＤＰＰＨ法を用いて電子供与能を測定する方法で行った。ＤＰＰＨは１,１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌの略字であって、ラジカルを持っているので抗酸化活性を測定する指標として広く利用されている。実験過程は次のとおりである：（１）エタノールに溶解した０.１ｍＭ ＤＰＰＨ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ−９１３２）２ｍlをエタノールに溶解した試料２ｍlに施す。（２）１０分間混合した後、３０分間暗い所で放置する。（３）５２０ｎｍで吸光度を測定する。（４）抗酸化度（電子供与能、ＥＤＡ）を計算する。陽性対照群にはビタミンＥ（Ｆｌｕｋａ、９５４２０）を使用し、算式は次のとおりである。

ここで、Ｃａｂｓは陰性対照群（試料の代わりにエタノールのみを添加した場合）の吸光度、Ｓａｂｓは試料の吸光度である。

その結果、表４に示すように、本発明によるフィセチンが強化されたウルシ抽出物が、既存のウルシ抽出物に比べて４倍以上優れた抗酸化活性を示した。これは既存のウルシ抽出物に多量含有されていたフスティンが活性型フラボノイドであるフィセチンに転化されることによって抗酸化活性も大きく向上したことを示す。

＜実施例５＞濃縮液を用いたフィセチン高含有のウルシ抽出物粉末の製造
上記実施例 ＜１−１＞と同様に、１０ｋｇのウルシに１０倍数の水を添加して２回抽出し、濃縮して濃縮液で２０lを作った。次いで酸素気体を０.４ＶＶＭで１２時間バブリングした後、製造されたウルシ抽出物を濃縮してフスティンの含量が１.２％（ｗ/ｗ）、フィセチンの含量が１５.８％（ｗ/ｗ）であるウルシ抽出物粉末 ４７０ｇを得た。このとき、フィセチン：フスティンの含量比は１：０.０７６であった。

＜実施例６＞フィセチン高含有の溶媒分画の製造
上記実施例 ＜１−１＞ 及び比較例１で得られた各抽出物１００ｇを、水５,０００ｍlに溶解し、次いでエチルアセテートを７,５００ｍlを加えてミキサーを用いて １０分間激しく混合し、常温で放置して層隔離させた。上層のエチルアセテート層を収去し、溶媒を除いて成分の分析を行った結果、実施例 ＜１−１＞の試料の場合（「Ａ」という）はフィセチンの含量が４２.５％（ｗ/ｗ）であり、比較例１の試料の場合（「Ｂ」という）はフィセチンの含量が７.５％（ｗ/ｗ）であった。

＜実施例７＞フィセチン結晶の製造
上記実施例６から得られた固形分１０ｇをエタノール５０ｍlに溶解させた後、これを５００ｍlの冷たい水（冷蔵）に一度に注ぐ。このとき、フィセチンの黄色結晶が微細に一時に生成された。これを３,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して回収した。得られた結晶を乾燥させた後にＨＰＬＣで純度を分析した結果、水分含量 ２.８％（ｗ/ｗ）、フィセチンの純度９６.５％（ｗ/ｗ）であった。

以上のように、本発明についてその好ましい実施形態に基づいて調べてみた。本発明が属する技術分野における通常の知識を持つ者であれば、本発明が、本発明の本質的特性から脱しない範囲で、変形された形態で具現できることを理解することができる。従って、開示された実施形態は限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は前述の説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての相違点は本発明に含まれるものであると解釈されなければならない。

Claims (20)

1. 抽出溶媒を用いてウルシを抽出する段階; 及び
   気体バブリング処理を遂行する段階を含む活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物の製造方法。
2. 前記抽出物中のフィセチン：フスティンの含量比が１：０〜２：１であることを特徴とする請求項１に記載のウルシ抽出物の製造方法。
3. 前記気体バブリング処理は、ウルシの抽出と同時に遂行、ウルシの抽出が完了した後に遂行、及びウルシ抽出物を濃縮した濃縮液で遂行からなる群から選ばれた少なくとも１つによって遂行されることを特徴とする請求項１に記載のウルシ抽出物の製造方法。
4. 前記気体は酸素を含む気体である請求項１に記載の方法。
5. 前記気体は空気であり、気体バブリング処理時間は６〜２４時間であることを特徴とする請求項１に記載のウルシ抽出物の製造方法。
6. 前記気体は９５％（ｖ/ｖ）以上の高純度の酸素であり、気体バブリング処理時間は５〜１２時間であることを特徴とする請求項１に記載のウルシ抽出物の製造方法。
7. 前記気体バブリング処理は、抽出槽の内部で気体を抽出液に直接バブリングする方法、抽出槽の外部で抽出液を気体と混合しながら接触させる方法、及び気体で満たされた容器に抽出液を通過させながら接触させる方法からなる群から選ばれた少なくとも１つの方法によって遂行されることを特徴とする請求項１に記載のウルシ抽出物の製造方法。
8. 前記活性型フラボノイドはフィセチンであることを特徴とする請求項１に記載のウルシ抽出物の製造方法。
9. 請求項１の製造方法によって製造され、活性型フラボノイド化合物の含量が増加されたウルシ抽出物。
10. 前記活性型フラボノイド化合物はフィセチンである請求項９に記載のウルシ抽出物。
11. 前記抽出物中のフィセチン：フスティンの含量比が１：０〜２：１である請求項１０に記載のウルシ抽出物。
12. 請求項９乃至請求項１１のいずれか１項のウルシ抽出物を有効成分として含有する抗がん用組成物。
13. 請求項９乃至請求項１１のいずれか１項のウルシ抽出物を有効成分として含有するがん予防又は改善用健康機能性食品。
14. 請求項９乃至請求項１１のいずれか１項のウルシ抽出物に有機溶媒を加えて、分画する方法によって得られることを特徴とするフィセチンの含量を増加させたウルシ抽出物の分画物。
15. 前記有機溶媒はアセトン、エチルアセテート、ｎ−ブタノール、クロロホルム及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項１４に記載の分画物。
16. 分画物中のフィセチンの含量が３０〜４５％（ｗ/ｗ）の範囲である請求項１５に記載の分画物。
17. フスティンを含有する溶液に気体バブリング処理を施して前記フスティンをフィセチンに転化させる方法。
18. 前記気体は酸素を含む気体である請求項１７に記載の方法。
19. 請求項１４乃至請求項１８のいずれか１項の分画物を有効成分として含有する抗がん用組成物。
20. 請求項１４乃至請求項１８のいずれか１項の分画物を有効成分として含有するがん予防又は改善用健康機能性食品。

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