KR20070077154A - 칠피, 건칠, 칠목 유래 알러지를 유발하지 않는 추출물 및이를 함유하는 약리학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 옻나무에서 유래되는 칠목, 칠피, 건칠 3종의 한약재를 무게비로 1 : 0.1~0.3 : 0.1~0.2의 비로 혼합하고, 분쇄하여 분말화 하고, 여기에 5~20배수의 물을 가하고, 50~110℃에서 2~24시간 동안 추출하고, 여과하여 추출액을 얻고, 남은 추출박에 에탄올 95%(v/v)의 주정을 처음 옻나무의 무게의 5~10배수 가하여 60~80℃에서 2~10시간 동안 추출하여 얻어진 여액을 물추출 여액과 혼합하고, 1마이크론의 필터로 미세여과 하여 불용성분을 제거하고, 얻어지는 액을 농축하여 고형분의 농도가 20~50%(w/v)가 되도록 하고, 여기에 pH 8.0~9.5의 알칼리수를 가하여 고형분의 농도가 5~40%(w/v)가 되도록 하고, 25~110℃에서 공기 또는 산소를 공급하면서 0.1~10시간 동안 처리하여 준 다음 이를 냉각 후 농축하여 용매를 제거하고 건조하여 분말상으로 얻어지는 옻나무 추출물로서 그 성분의 조성이 푸스틴 5~20%(w/w), 피세틴 1~10%(w/w), 3,4-dihydroxybenzoic acid 0.1~10%(w/w), 폴리페놀의 함량이 15~45%(w/v) 인 것을 특징으로 하는 옻나무 추출물의 제조방법 및 진통, 항산화, 항암, 암예방효과를 가지는 조성물에 관한 것이다.

칠피, 칠목, 건칠, 진통제, 푸스틴, 피세틴, 폴리페놀

Description

칠피, 건칠, 칠목 유래 알러지를 유발하지 않는 추출물 및 이를 함유하는 약리학적 조성물{Preparation method of extract, do not causing allergy from bark, dried lacquer and heartwood of Rhus verniciflua and composition containing the same}

도1. 투여용량별 라이딩 회수 비교

도2. 포르말린 시험의 제1기 통증기간 비교

도3. 포르말린 시험의 제2기 통증기간 비교

도4. 비교물질의 투여용량별 라이딩 회수 비교

옻나무는 다량의 항산화물질을 보유하고 있다. 김인원 등은 Korean J. Food Sci. Technol. 31(3), 855-63(1999)에서 옻나무 수피 추출물에서 항산화 활성물질의 분리를 보고하였으며, 임계택 등은 Korean J. Food Sci. Technol. 29, 1248-54(1997)에서 옻나무 에탄올 추출물의 쥐 뇌세포 적용 결과 강한 항산화 활성을 보고하였으며, 정형진 등은 Korean J. plant.Res. 14(3), 220-8(2001)에서 옻나무류의 항산화력 및 분획방법을 보고하였으며, J.-C. Lee 등은 Food and Chemical Technology 42, 1383-88(2004)에서 옻나무 추출물을 실리카 컬럼을 이용하여 분리 정제한 분획이 인체 혈액암세포의 성장을 저해하는 능력이 있음을 보고하고 있으며, 이정채 등은 Food Sci.Biotechnol. 9(3), 139-45(2000)에서 옻나무 에탄올 추출물에서 항상화, 항미생물 효과를 가지는 분획하여 보고하였다. 최원식 등은 J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 45(3), 168-72(2002)에서 메탄올 추출물 분획에서 분리정제한 성분들의 항산화 효과를 보고하였으며 암세포에 대한 세포독성 실험 결과 활성이 높지 않다고 보고하였다. 임계택은 Agric. Chem. Biotechnol. 45(4), 173-9(2002)에서 옻나무 물추출물과 에탄올 추출물의 간세포의 세포사멸(apoptosis)을 예방하는 효과를 비교, 보고하였으며, 전원경 등은 생약학회지 3494), 339-43(2003)에서 옻나무 껍질을 메탄올로 추출하고 비만유도 쥐에 대한 비만 억제 효과를 보고하였다.

대한민국 특허출원 10-1997-0013163, 10-1997-0004193에서 우루시올 성분을 함유하는 항암제조성물을 보고하고 있으며, 또한 대한민국 특허 10-0257448-0000에서 옻나무 추출물을 실리카 컬럼으로 정제한 조성물로 푸스틴, 피세틴, 설푸레틴, 부테인을 함유하는 항암제 조성물을 제시하고 있으며, 대한민국 특허 10-0251526-0000에서 우루시올을 주요성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제시하고 있으며, 대한민국 특허 출원 10-2002-0018186에서는 옻나무의 에탄올 추출물을 저온정치하는 방법에 의한 항산화 효과 및 세포자살 방지효과를 가지는 추출물을 제시하고 있으며, 대한민국 특허출원 10-2002-0071464에서는 옻나무 추출물을 이용한 간질환 치료제를 제시하고 있다. 대한민국 특허 출원 10-2000-0004700에서는 광숙성 방법에 의한 약재의 항암효과를 제시하고 있으며 옻나무를 함유하는 추출물을 이용한 항암제의 사용예를 제시하고 있다. 이들 참고출원의 경우 옻나무의 물추출물로서 단순한 옻나무추출물의 함유량 만을 제시하고 있으며 원료조성의 차이를 언급하고 있지는 않다.

지금까지의 옻나무와 관련된 연구 및 특허에서는 알러지를 초래하는 우루시올 성분의 항암활성 및 알러지를 제거하는 방법, 추출물의 생리활성에 대한 것이 대부분이었다. 본 발명은 옻나무 유래 한약재의 추출물을 이용한 진통효과 및 항암효과를 가지는 조성물에 관한 것으로서 그 효능 및 조성에 있어 기존의 발명 또는 보고들과 현격한 차이가 있다. 옻나무를 이용한 대부분의 특허들은 그 추출물의 용도가 옻나무를 물을 포함한 용매로 추출하고, 이를 컬럼 등의 방법에 의하여 정제하고, 그 주요성분으로 우루시올, 푸스틴, 피세틴, 설푸레틴, 부테인, 카페익산, 몰식자산 등을 함유하는 것으로 제시하고 있다. 이는 본 발명의 추출물 조성물이 옻나무 유래 한약재 3종을 그 원료로 하여 추출한 추출물로서 알러지 유발물질을 제거하고, 3,4-didroxybenzoic acid를 함유하며 진통효과 및 항암효과를 가지는 것을 그 특징으로 한다는 점에 있어 그 효용 및 조성이 완전히 상이하다.

옻나무는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하는 낙엽활엽수목으로 수액은 옻 또는 건칠이라하여 공업용과 약용에 쓰이고, 특히 한방과 민간에서 주독, 해열, 구충, 학질, 복통, 통경, 변비 등에 약재로 쓰이고 옻닭과 같이 식품으로 이용되어 왔다(김태정(1996) 한국의 자원식물 II, 294, 서울대학교 출판부). 옻나무 추출물에 대한 생리활성에 대한 연구가 보고되었는데 항균작용, 플라보노이드 성분과 수액의 우루시올 성분에 대한 항산화 작용(한국식품과학회지. 31:855-63; 생약학회지 31:345-50)을 보고하고 있으며, 우루시올 성분의 암세포에 대한 세포독성 효과는 Arch. Pharm. Res. 22:638-41 (2000)에서 보고되었다.

옻나무는 예로부터 알러지를 초래하므로 다양한 생리활성이 있음에도 불구하고 그 사용에 제한을 받아왔다. 많은 사람들은 옻나무의 알러지를 유발하는 성분이 우루시올로 규명하였으며 이를 제거하기 위한 다양한 방법을 연구하여 왔다. 그 중에는 열처리를 하는 방법, 용매로 추출하고 저온 정치하는 방법, 산소를 이용하여 처리하는 방법 등이 있다. 천연물 유래 추출물에서 진통효과를 가지는 것은 다수가 보고되고 있으나 대부분이 단순한 추출물로서 인식될 뿐 그 조성물로 한정되어 특징지어지지 못하였으며, 그 중 많은 연구 보고가 있었던 물질로 당귀 유래 디커시놀이 보고되었으나, 옻나무 유래의 추출물 조성물로서는 한국 특허 공개 10-2005-0047339에서 유기용매를 이용하여 추출한 옻나무 추출물의 진통효과를 제시하고 있으나 그 제조방법에 있어 원료로 옻나무의 목질부를 사용하고, 유기용매로서 아세톤, 에탄올, 메탄올 등을 사용하고 컬럼크로마토그래피를 이용하여 제조하는 방법을 제시하고 있다는 점에서 본 발명과는 현격한 차이가 있다고 본다. 한국특허 제0519530호에서는 산소를 가한 상태에서 알러지유발물질을 제거하고 추출하는 방법을 제시하고 있으나, 이는 알러지 유발물질인 우루시올이 중합되어 고분자로 되면 물에 대하여 불용화되어 추출액 중에 함유되지 않는다는 것을 전제로 하고 있다.

지금까지 옻나무와 관련된 기술 및 용도로는 알러지를 제거하는 기술과 관련된 방법, 알러지 유발물질로 알려진 우루시올의 약리효능에 관한 약리적, 제조기술에 관한 방법, 알러지를 제거한 옻나무 추출물의 분리 및 정제, 약리효능에 관한 방법이 그 대부분이라고 할 수 있다.

본 발명은 옻나무 유래의 약리적 효능을 안전하고 효율적으로 이용하기 위하여 옻나무 유래 건칠, 칠피, 칠목의 혼합추출물에서 알러지를 유발하는 성분을 제거하고, 이를 식품으로 사용할 수 있는 용매로 추출하여 분말화 하여 제조된 조성물로서 경구투여에 의하여 암환자에게 투여시 극심한 고통을 해소해주는 진통제로서의 기능과 동시에 항암효과를 가진 본 발명의 조성의 옻나무 유래 추출물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

옻나무는 옻칠을 위한 칠액을 생산하며, 그 껍질은 칠피라고 하여 한약재로서 이용된다. 칠액은 이를 건조하여 건칠이라는 이름으로 역시 한약재로 사용된다. 동의보감, 광제비급 등 한의서에 따르면 칠피를 제거한 옻나무의 목질부는 칠목 또는 칠수라고 하여 부종, 옹저 등의 증상에 사용되는 것으로 알려져 있다. 칠목은 옻나무의 목질부에 해당하는 것으로 추출물의 함량이 극히 적고, 푸스틴, 피세틴과 같은 플라보노이드 성분을 함유하고 있으며 알러지 유발성분인 우루시올의 함량은 극히 적어 손쉽게 옻이 오르는 성분을 제거하여 옻닭 등에 이용된다. 옻나무의 껍질을 제거할 경우 대부분의 경우 옻이 오르는 성질을 제거할 수 있다. 그러나, 칠 피는 옻나무의 칠액을 생산하는 껍질부에 해당하는 것으로 칠액(건칠)에는 미치치 못하지만, 다수의 우루시올을 함유하고 있어 쉽게 옻이 오를 수 있다. 칠피에는 레진성분 및 소량의 플라보노이드 성분들이 함유되어 있다. 건칠은 옻나무에서 칠액으로 얻어진 것을 건조한 것으로, 칠액에는 알러지 유발성분인 우루시올을 다량 함유하고 있으며 그 복용에 있어서도 조심을 기해야 한다. 또한 건칠에는 다수의 폴리페놀 성분이 다량 함유되어 있으며 우루시올의 중합체로서의 레진들도 다량 함유되어 있다.

본 발명은 다음과 같이 구성된다. 첫째, 원료준비단계로서 본 발명에 사용된 원료는 그 조성에 있어 기존의 대부분의 특허에서 기재된 옻나무 또는 옻나무의 목질부와는 달리 칠목, 칠피, 건칠 3종의 한약재를 건조상태의 무게비로 1 : 0.05~0.3 : 0.05~0.2의 비로 혼합하는 것으로 구성된다. 건칠은 칠액을 건조한 것으로 건칠 대신 칠액을 사용할 수 있으며 그 경우 칠액 중의 수분함량이 30~70%(w/w) 정도이므로 이를 감안하여 과량을 첨가하면 된다. 둘째는 이들 원료를 혼합하고 건조하여 분말화 하고, 추출물을 만들기 위한 추출 용매로서 물을 원료 전체 1Kg에 대하여 5~20리터 가하고, 온도 범위를 50~110℃로 하여 2~24시간 동안 추출하고, 여과하여 물추출액을 얻고, 남은 추출박에 95%(v/v)의 에탄올을 처음 원료 1Kg에 대하여 5~10리터 가하고, 60~80℃에서 2~10시간 동안 추출하여 에탄올 추출액을 얻고, 이를 물추출액과 혼합하고, 1마이크론의 필터로 미세여과 하여 불용성분을 제거하고, 얻어지는 액을 농축하여 고형분의 농도가 20~50%(w/v)가 되도록 하는 단계이고, 넷째는 여기에 pH 8.0~9.5의 알칼리수를 가하여 고형분의 농도 가 5~40%(w/v)가 되도록 하고, 공기 또는 순수산소를 부피비로 시간당 1~100배 가하여 주면서 25~110℃에서 0.5~10시간 동안 혼합하면서 처리하여 알러지를 유발하는 우루시올을 중합시켜 알러지 유발특성을 제거하고, 이를 농축하고 건조하여 분말상으로 얻어지는 옻나무 추출물을 얻는 단계로 구성된다. 본 발명의 방법에 의하여 제조된 추출액은 그 성분의 조성이 푸스틴 5~20%(w/w), 피세틴 1~10%(w/w), 3,4-dihydroxybenzoic acid 0.1~10%(w/w), 폴리페놀의 함량이 15~45%(w/v) 인 것을 특징으로 하는 조성물로서 강력한 진통효과, 항암효과, 항산화 효과 및 암예방효과를 가지는 것을 그 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명하면,

첫째 단계인 원료조성단계는 사용된 원료는 그 조성에 있어 기존의 대부분의 특허에서 기재된 것과는 상이하다. 본 발명은 원료에 있어 칠목, 칠피, 건칠 3종의 한약재를 건조상태의 무게비로 1 : 0.05~0.3 : 0.05~0.2의 비로 혼합하는 것을 그 특징으로 한다. 칠목은 옻나무의 목질부를 말하는 것으로 플라보노이드 성분의 함량이 높으며, 칠피는 옻나무의 겉껍질을 말하는 것으로 소량의 플라보노이드 성분 및 폴리페놀류, 레진 등의 함량이 높으며, 건칠은 옻나무의 표면에 상처를 내고 여기에 흘러나오는 진액인 칠액을 건조한 것으로 옻이 오르게 하는 알러젠인 우루시올 및 옻나무의 수지성분을 다량 함유하고 있다. 따라서 건칠은 알러지 유발인자를 완전히 제거하지 못할 경우 추출물의 복용시 알러지를 유발할 가능성이 매우 높다고 할 수 있다. 칠피와 건칠은 한약재로서 어혈, 복통, 진해, 구충 등에 사용되며 우루시올을 함유하고 있는 관계로 옻이 오르지 않게 하는 처리를 하여야 사용할 수 있다. 원료의 구성에 있어 칠목의 건조무게 1에 대하여 건조칠피 0.05~0.3, 건칠 0.05~0.2로 사용한 것은 약리성분을 극대화하기 위한 조성으로 칠피 및 건칠의 함량비가 높아질수록 추출물 중의 플라보노이드 성분의 함량이 저하되며, 추출과정에서 알러지를 초래하는 우루시올의 함량이 높아 완벽하게 제거하는데 많은 시간이 소요될 수 있다. 따라서 우루시올을 완전하게 제거하고, 본 발명의 추출물의 구성을 가지는 약리성분을 적절하게 추출하기 위하여 원료의 비를 결정한 것이다. 다만, 본 발명의 제조방법에 의할 경우 건칠은 경우에 따라 건조하기 이전의 칠액을 사용할 수 있다. 이 경우 칠액의 수분함량이 통상 30~70%(w/w)이므로 이를 감안하여 그 양을 증가시켜야 한다. 원료는 목질부인 칠목과 칠피, 건칠을 각각 60℃이하에서 건조 후 분쇄하여 톱밥상으로 하여 그 크기를 2mm이하로 하고, 비율대로 혼합하여 준비한다. 건조에 있어 60℃이하로 한 것은 60℃이상의 고온으로 건조할 경우 원료에 함유된 각종 효소 등의 생리활성물질의 활성이 소실되기 때문이다. 건칠 대신 칠액을 사용할 경우 이를 분쇄한 칠피, 칠목과 혼합하여 건조하는 방법에 의하여 준비할 수 있다.

둘째 단계인 물추출 단계는 수용성 추출물을 추출하는 단계로서 물을 원료조성단계에서 분쇄하여 분말화한 원료 전체 무게의 5~20배수로 가하여, 추출액을 얻는 단계로 구성된다. 원료의 입자 크기는 분쇄하는 시스템에 따라 달라지지만 2mm 이하의 경우 그 추출 수율에 있어 최대화 할 수 있었으며 입자의 크기에 따라 추출물의 조성이 달라지지는 않는다. 물은 원료무게의 5~20배수를 가하여 주며, 5배수 이하로 할 경우 원료의 부피가 큰 관계로 충분히 물에 잠기지 못하게 되며 20배수 이상으로 할 경우 과다한 용매의 투입으로 경제성이 저하되게 된다.

추출물을 가온하여 온도를 60~110℃에서 2~24시간 동안 추출하여 물추출액을 얻는다. 온도를 60~110℃로 한 것은 플라보노이드를 포함한 다양한 약리성분의 추출효과를 높이기 위한 것으로 물에 대한 용해도가 낮은 성분을 고온에서 추출하므로 해서 추출효과를 증대시킬 수 있다. 추출시간은 2~24시간으로 24시간 이상 추출하는 것은 더 이상의 추출수율 향상이 없었으며, 2시간 이하로 추출하는 것은 추출수율이 현저하게 저하되는 결과를 초래한다.

셋째 단계는 에탄올 추출단계로서 물추출액을 얻고, 남은 추출박에 95%(v/v)의 에탄올을 처음 원료의 무게의 5~10배수 가하고, 60~80℃에서 2~10시간 동안 추출하여 에탄올 추출액을 얻는다. 에탄올 추출공정은 1차 물추출 단계에서 물이 나무를 팽윤시키게 되므로 2차로 에탄올 추출공정을 적용하므로써 원료의 내부에까지 에탄올이 용이하게 침투하여 추출수율을 증가시킬 수 있게 한다. 반면, 에탄올의 경우 소수성이 있어 건조상태 원료에서 단독으로 사용시 나무와 같은 친수성 성분의 추출용매로서 목질부의 깊은 부분에 있는 성분의 추출이 지연되거나 현저하게 저하되는 결과를 가져온다. 따라서 본 발명에서는 우선적으로 물로서 추출하여 물추출물을 얻고, 원료를 팽윤시킨 다음, 여기에 에탄올을 가하여 원료 내부에 있는 미세한 성분조차 추출하여 얻을 수 있는 방법을 찾았다. 물추출 후 남은 추출박에는 이미 물 함량이 50% 이상이므로 여기에 95%(v/v) 이상의 에탄올을 가하여 주면 에탄올의 농도가 적절하게 희석되면서 추출수율을 향상시킬 수 있으며, 소수성 물질의 추출도 증가시키게 된다. 추출조건은 60~80℃에서 2~10시간으로 추출 수율을 최대화 할 수 있는 조건을 정하였으며, 온도를 낮추거나 추출시간을 2시간 이내로 하는 경우 추출수율이 저하되게 된다. 추출온도를 80℃ 이상으로 지나치게 고온으로 할 경우 사용한 에탄올의 비점이 78℃이므로 과다한 압력상승을 초래하여 위험성이 급격하게 증가한다.

에탄올 추출액을 물추출액과 혼합하고, 1마이크론의 필터로 미세여과 하여 불용성분을 제거하고, 얻어지는 추출액을 진공하에서 농축하여 고형분의 농도가 20~50%(w/v)가 되도록 하는 것으로 구성된다. 이렇게 얻어진 농축액에는 칠피, 칠목, 건칠(또는 칠액)에 함유되어 있던 알러지 유발물질인 우루시올이 일부는 추출과정에서 자연적으로 제거되었으나, 대부분은 잔류하게 되므로 다량으로 함유되어 있게된다. 이를 다음의 공정에 의하여 완벽하게 해결한다. 일반적으로 지금까지의 대부분의 기존 특허에서는 추출과정에서 알러지 제거공정을 도입하여 제거하는 것이 주된 방법이었으나, 본 발명에서는 추출액을 농축한 후 알러지 유발물질을 중합시켜 그 특성을 제거할 뿐 추출물에 그대로 함유되게 한다는 측면에서 여타의 발명과 현저한 차이가 있다.

넷째 단계는 추출액 농축액에 pH 8.0~9.5의 알칼리수를 가하여 고형분의 농도가 5~40%(w/v)가 되도록 하고, 공기 또는 순수산소를 추출액의 부피비로 시간당 1~100배 가하여 주면서, 25~110℃에서 0.5~10시간 동안 저어주면서 처리하여 알러지를 유발시키는 물질인 우루시올을 중합시켜 고분자화 함으로써 농축액 중의 우루시올의 함량을 0으로 하고, 우루시올이 중합된 중합체는 농축액 속에 잔류하여 폴리페놀 성분으로 존재하게 된다. 농축액의 희석에 사용하는 알칼리수는 pH 8.0~9.5 사이의 것으로서 그 제조방법은 전기분해를 이용하여 제조한 전기분해수 또는 알칼리제로서 가성소다, 수산화 칼슘, 수산화 마그네슘, 소석회 등을 사용할 수 있으며 가장 좋게는 가성소다를 사용하여 알칼리화 한다. 여기서 알칼리수를 사용하는 이유는 얻어지는 추출물의 생리활성을 높이기 위한 방법이며 이 처리과정에서 항산화력, 항암력, 진통력 등이 증가되게 된다. 그 이유는 본 발명의 추출물에 주요성분으로 함유된 플라보노이드류의 성분들은 대부분 알칼리에 잘 용해되는 특성을 지니고 있는 반면, 추출과정에서 추출된 여러가지 성분들 중에는 우루시올을 포함하여 산성을 띄고 있는 성분이 많아 이들 성분의 중화 및 가용성을 높여 줄 수 있기 때문이다. 또한 중합된 우루시올은 그 자체로서 이미 알러지유발특성을 잃어 버렸으나, 농축액에 잔류하므로 최종적인 조성물에 함유되게 되어 섭취할 경우 항산화력의 증가, 항암력의 증가 효과를 얻을 수 있다. 그 이유는 우루시올이 페놀성 구조를 그 기본으로 하고 있어 우루시올의 중합체는 폴리페놀 성분으로서 간주될 수 있기 때문이다. 한국특허 제0519530호에서는 산소를 가한 상태에서 알러지유발물질을 제거하고 추출하는 방법을 제시하고 있으나, 이는 알러지 유발물질인 우루시올이 중합되어 고분자로 되면 물에 대하여 불용화되어 추출액 중에 함유되지 않는다는 것을 전제로 하고 있다. 이것이 본 발명과 차별화되는 부분이다. 실제 한국특허 제 0519530호의 경우와 폴레페놀 성분의 함량 차이를 조사한 결과 7%의 차이를 보였다. 본 발명의 추출물이 폴리페놀 함량에 있어 더 뛰어난 결과를 보였다.

처리가 끝난 농축액은 이를 농축하고 건조하여 용매를 제거하므로써 분말상으로 얻어지는 옻나무 추출물을 얻는 단계로 구성되는 바, 건조 후에도 균질화된 추출물 분말을 얻을 수 있게 한다.

본 발명에 의하여 얻어진 추출물은 그 조성으로서 플라보노이드인 푸스틴이 5~26%(w/w), 피세틴 1~10%(w/w)이며, 3,4-dihydroxybenzoic acid 0.1~10%(w/w), 폴리페놀의 함량이 15~45%(w/v) 인 것을 특징으로 하는 통증을 억제하는 효능 및 항암효능, 항산화 효능, 암예방효능 을 가지는 조성물을 제공한다. 푸스틴, 피세틴은 플라보노이드의 한가지로서 피세틴은 다수의 식물체에서 보고되고 있으나, 푸스틴은 특이적으로 옻나무에 다량 함유되어 있다. 폴리페놀은 최근 면역증강 효과 등이 보고되고 있는 물질로 그 성분명에 나타난 것처럼 그 단일성분을 규정할 수 없으며, 식물체의 종류에 따라, 부위에 따라 매우 다양한 분자구조를 가지는 것이 그 특징이다. 따라서 본 발명에서는 그 분석법으로서 대한민국 식품공정에 기재된 폴리페놀 정량법으로서 탄닌을 기준물질로 정량하였다. 3,4-dihydroxybenzoic acid는 페놀산의 일종으로 항암작용, 항혈전 작용을 가지는 것으로 알려져 있으며 다수의 식물체에서 그 발견이 보고되고 있다. 과량 투여시 유전자에 변이를 초래하는 것으로도 알려져 있다. 따라서 본 발명의 추출물에는 그 함량이 0.1~10%(w/w)의 범위로 한정되어 있다.

따라서, 본 발명은 또한 (i) 유효성분으로서 약리학적 유효량의 상기 추출물 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것으로 구성된 진통용, 항암용, 암예방용 약제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 추출물은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약제 조 성물로서 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 상세히 설명하고자 한다. 다만, 하기의 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 추출물의 제조

10년생 옻나무 목질부(칠목) 2Kg, 옻나무 겉껍질(칠피) 300g, 건칠 100g을 각각 50℃ 오븐에서 건조시키고, 이를 칠목 : 칠피 : 건칠 을 무게비로 1 : 0.15 : 0.1의 비로 혼합하고, 분쇄기를 이용하여 분쇄하여 원료 1.2Kg을 얻었다. 이 중 1Kg에 물을 10L 가하고, 가온하여 95℃에서 5시간 동안 추출하여 물추출액을 8.8L 얻고, 남은 추출박에 다시 농도 95%(v/v)의 에탄올을 8L 가하고, 75℃에서 5시간 동안 추출하여 에탄올 추출액을 7.9L 얻었다. 이를 물추출액과 혼합하여 1마이크론 필터로 여과하고, 얻어진 추출액을 농축하였다. 농축액의 부피가 200ml이 되었을 때 고형분 함량을 굴절률계로 측정한 결과 31Bx였다. 여기에 1노르말 농도의 가성소다를 이용하여 pH를 8.5로 맞춘 알칼리수를 100ml 가하고, 88℃에서 공기를 3L/hr의 속도로 버블링(bubbling)하면서 5시간동안 잘 저어주면서 처리하고, 농축하고, 건조하여 담갈색의 건조분말로서 58g을 얻었다.

분석예 1. 주요성분의 분석

옻나무 추출물의 기능성 성분을 분석하기 위하여 10%(w/v)로 물에 용해하고 이를 1마이크로메타의 여과지로 미세여과하고 여기에 부피비로 1:1로 클로로포름을 가하고 격렬하게 섞은 층분리 시켜 하부의 클로로포름 층을 얻고, 다시 물층에 에틸아세테이트를 가하여 격렬하게 섞은 다음 층분리 시켜 상부의 에틸아세테이트를 분리하여 에틸아세테이트 분획을 얻었다. 에틸아세테이트 분획물을 농축하여 고형분 함량 10%(w/v)가 되도록 메탄올에 용해시킨 다음 이를 70-230mesh의 실리카가 충전된 실리카 컬럼에 투입하고, 클로로포름:메탄올:물=70:21:9의 비로 만들어진 이동상의 하층을 분리하여 이동상으로 전개시켜 5개의 분획을 얻고, 이 중 2개의 분획을 다시 역상실리카(C18)가 충전된 컬럼에 투입하고 메탄올:물=65:35의 이동상으로 전개하여 5개의 분획을 얻었다. 이중에서 푸스틴, 피세틴을 분리, 정제하였으며 이를 Sigma에서 표준물질을 구입하여 HPLC로 분석, 확인하였다. 3,4-dihydroxybenzoic acid는 기체크로마토그래피를 이용하여 분석하였고, 폴리페놀은 페놀법을 이용하여 정량하였다. 그 결과 실시예 1에서 얻어진 추출물의 조성은 푸스틴은 16.4%(w/w), 피세틴은 2.3%(w/w), 3,4-dihydroxybenzoic acid가 1.5%(w/w), 폴리페놀이 35.1%(w/w)로 나타났다.

분석예 2. 알러지 유발 물질의 제거 확인

본 발명의 추출물의 알러지 유발물질로 우루시올의 제거를 확인하기 위하여 생옻나무에서 얻은 칠액과 본 발명의 추출물을 HPLC/MS를 이용하여 알러지를 유발하는 것으로 알려진 우루시올의 함량을 조사하였다. 우루시올의 분석은 Korean J. Medical Crop Sci., 10(4):288-93(2002)에 따랐다. 그 결과를 다음의 표 1에 보였다.

우루시올의 함량 분석 결과

우루시올 분자량	칠액	알칼리 처리전 농축액	본발명의 최종 추출물 분말
314	1.5%(w/w)	0.3%(w/w)	불검출
316	0.1%(w/w)	0.03%(w/w)	불검출
318	0.13%(w/w)	0.1%(w/w)	불검출
320	1.1%(w/w)	0.12%(w/w)	불검출

위 표에서 알 수 있듯이 알칼리 처리공정을 통하여 얻어진 본 발명의 추출물에는 알러지를 유발하는 것으로 알려진 우루시올이 완벽하게 제거되었음을 알 수 있었다.

실시예 2. 칠액을 이용한 추출물의 제조

건조된 10년생 옻나무 목질부(칠목) 2Kg, 건조된 옻나무 겉껍질(칠피) 250g, 칠액 160g을 각각 평량하고, 칠목과 칠피를 혼합하여 분쇄한 다음 여기에 칠액을 가하여 잘 섞어 준다음 이를 50℃ 오븐에서 3시간 동안 건조시겨 2,350g을 얻었다. 이 중 1Kg에 물을 10L 가하고, 가온하여 95℃에서 3시간 동안 추출하여 물추출액을 8.9L 얻고, 남은 추출박에 다시 농도 95%(v/v)의 에탄올을 7L 가하고, 65℃에서 5시간 동안 추출하여 에탄올 추출액을 6.6L를 얻었다. 이를 물추출액과 혼합하여 1마이크론 필터로 여과하고, 얻어진 추출액을 농축하였다. 농축액의 부피가 150ml이 되었을 때 고형분 함량을 굴절률계로 측정한 결과 38Bx였다. 여기에 pH 9.0의 알칼리수를 100ml 가하고, 93℃에서 산소를 400ml/hr의 속도로 버블링(bubbling)하면서 5시간동안 잘 저어주면서 처리하고, 농축하고, 건조하여 담갈색의 건조분말로서 56g을 얻었다.

실시예 3. 추출물의 라이딩(writhing) 억제 시험

실시예 1.에서 얻어진 추출물을 4주령 ICR 마우스(체중 25g)에 각각 100, 200, 300, 500mg/Kg의 양으로 경구투여하였다. 이어서 생쥐의 복강에 0.7% 초산을 0.25ml 투여한 후 30분 동안 라이딩 반응(writhing response)을 조사하였다. 대조군(Control)로는 추출물 대신 식염수를 투여한 쥐를 사용하였다. 초산은 복막염, 급성복막염을 초래하는 것으로 장내염증의 고통모델에서 이용되며 투여 후 쥐의 몸부림치는 정도를 비교하게 된다. 그 결과를 도1에 보였다. 도1은 투여용량별 라이딩 횟수를 나타내는 그래프로서 본 발명의 추출물은 초산투여로 인한 라이딩 반응을 용량의존적으로 억제함을 알 수 있다.

실시예 4. 포르말린 시험

포르말린을 주입한 진통효과에 대한 시험은 말초신경계와 중추신경계 모두에 작용하는 것을 확인하는 시험으로 용량의존적인 효과를 확인하고자 하였다. 실시예 1에서 얻은 추출물을 이용하여 4주령 ICR 생쥐(체중 25g)에게 각각 100, 200, 300, 500mg/Kg의 양으로 경구투여하고, 30분이 경과한 후 각각의 생쥐의 뒷 발바닥에 1% 포르말린 수용액을 투여한 다음 처음 5분 동안의 제 1기 및 20~40분 동안의 제2기에 생쥐가 발바닥을 핥거나 흔드는 등의 통증반응을 보이는 시간을 측정하였다. 대조군(Control)으로는 생리식염수를 투입한 생쥐를 사용하였다. 도2에 제1기의 통증기간(초)을, 도3에 제2기의 통증기간(초)을 보였다. 도2,3에서 알 수 있듯이 본 발명의 추출물은 용량의존적으로 통증반응을 억제하였다.

실시예 5. 말기암 환자의 진통 억제 효과

실시예 2의 추출물을 말기암 환자로서 진통을 위해 몰핀을 투여받고 있는 사람을 대상으로 그 효과를 시험하였다. 경구투여에 의하여 각각 다른 농도로 투여하고 몰핀 투여횟수 변화를 조사하였다. 그 결과를 표2.에 보였다. 본 발명의 추출물을 경구투여 함으로써 가장 극심한 고통을 느끼고 있는 말기암 환자에게서 몰핀의 사용을 현저히 줄일 수 있을 정도의 진통효과를 거둘 수 있었다.

환자명	병명	몰핀투여횟수(회/일)	추출물 투여농도(mg/day)	추출물 투여 후 몰핀 투여 횟수(회/일)
A	위암	3	2,500	1
B	대장암	2	3,000	0
C	위암	2	2,800	0
D	간암	3	3,200	0
E	폐암	2	2,600	1
F	췌장암	4	3,300	1
G	유방암	1	1,900	0

비교예 1. 일반 추출물과의 비교

본 발명의 제조방법에 의한 추출물의 진통효과를 일반적인 추출의 진통효과와 비교하기 위하여 옻나무에 10배수의 물을 가하여 3시간 동안 추출한 후 농축/동결건조하여 얻어진 추출물의 성분 및 알러지 유발, 진통효과를 비교하였다.

알러지 유발에 있어서는 본 발명의 추출물과 비교하였을 때 비교예의 일반추출물은 표3에 나타낸 것처럼 상당량의 우루시올을 함유하고 있어 쉽게 알러지를 유발하였다. 그 성분조성에 있어서는 푸스틴 3.2%(w/w), 피세틴 0.25%(w/w), 3,4-dihydroxybenzoic acid 0.03%(w/w), 폴리페놀이 11.1%(w/w)로 본 발명의 추출물과 매우 현격한 차이가 존재하였다. 진통효과에 있어서는 실시예 2와 같이 라이딩 시험을 한 결과 도4에 나타낸 바와 같이 거의 진통효과를 보이지 않았다.

우루시올 분자량	비교예의 추출물	본 발명의 추출물
314	0.25%(w/w)	불검출
316	0.05%(w/w)	불검출
318	0.1%(w/w)	불검출
320	0.33%(w/w)	불검출

실시예 6. 항암효과의 확인

실시예 1.에서 제조한 본 발명의 추출물의 항암효과를 알아보기 위하여 결장암, 간암, 자궁암, 위암, 직장암, 폐암 세포를 대상으로 암세포 성장 저해 효과를 조사하였다. 사용한 암세포 및 성장 저해 효과를 표 4에 나타내었다. 항암활성은 암세포를 한국 종균협회로 부터 분양 받아 계대배양 후 24-well plate에 1*10⁶cells/ml의 농도로 분주하고 여기에 옻나무 추출물을 50ppm씩 가하고, 암세포의 성장을 비교하였다. 그 결과 본 발명의 추출물은 매우 뛰어난 암세포 성장 억제효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.

옻나무 추출물의 항암효과 검증

암의 종류	균주명	암세포억제효과(%)
결장암	WiDr	63
간암	HEPG2	44
자궁암	HeLa	72
위암	SNU-5	87
직장암	SNU-1033	79
폐암	Calu-3	82

실시예 7. 항산화 효과의 확인

항산화 효과는 일반적으로 질병을 초래하는 원인으로 활성 라디칼을 언급하는 경우가 많은데 이러한 활성라디칼을 제거할 수 있는 효과로서 추출물이 가진 항산화 효과를 기준으로 하는 경우가 대부분이다. 항산화 효과는 DPPH법을 이용하여 확인하였다. DPPH는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl로 라디칼을 가지고 있어 항산화효과를 측정할때 주로 이용된다. 표5에 항산화 효과를 측정한 결과를 보였다. 본 발명의 추출물 및 상기 분석예 1에서 분리, 정제한 성분 중 푸스틴, 피세틴, 표준품으로 구입한 설푸레틴을 대상으로 항산화도를 조사하였다. 본 발명의 추출물은 50%의 라디칼을 제거하는 억제농도가 18ug/ml로 매우 뛰어난 항산화 효과를 보였다. 그리고 이러한 효능은 추출물에 함유된 성분 중 대표적인 플라보노이드 성분인 푸스틴, 피세틴, 설푸레틴 등이 가지는 뛰어난 항산화 효과에서 기인함을 알 수 있다. 가장 뛰어난 효과를 보인 것은 푸스틴이다.

항산화 효과의 조사

시료명	50% 억제농도(ug/ml)
비타민 E	13.1
본발명의 추출물	18.0
옻나무 물추출물	33.1
푸스틴	1.8
피세틴	2.2
설푸레틴	3.5

실시예 8. 암예방효과

본 발명의 추출물을 마우스를 대상으로 경구투여하면서 담배에 함유되어 폐암을 일으키는 것으로 알려진 NNK[4-(N-methyl-N-nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone], 간암을 유발시키는 것으로 알려진 DMN(N-nitrosodimethylamine), 방광암을 유발시키는 DBN(N-nitroso-di-n-butylamine), 림프종을 유발시키는 NMU(nitrosomethylurea), 신장암을 유발시키는 ENU(nitrosoethylurea), 백혈병을 유발시키는 NBU(nitrosobutylurea), 위암을 유발시키는 MNNG(N-methyl-N'-intro-N-nitrosoguanidine)를 투여하여 암을 유발시켰을 경우 암유발에 대한 예방 효과를 표6에 보였다. 본 발명의 추출물은 다양한 종류의 암에 대하여 그 발생을 예방하는 탁월한 효과를 보였다. 특히, 백혈병의 경우 발병율이 16%로 암발생을 억제하는 효과가 84%에 달했다.

암 유발에 대한 예방효과 - 발암율 조사(%)

시료	폐암	간암	방광암	림프종	신장암	백혈병	위암
대조군	100	100	100	100	100	100	100
본발명의 추출물 투여군	24	33	35	18	29	16	25

본 발명은 국내에 자생하는 옻나무를 적절한 원료조성으로 추출하여 추출물을 만들고, 이를 말기암 환자를 포함하는 다양한 종류의 고통에 대한 억제효과를 가지는 것 및 항암효과를 찾아낸 것으로, 건강기능식품 및 천연물 의약품으로 개발하여 국민건강증진 및 수출을 통한 외화획득의 효과를 얻을 수 있다.

Claims (10)

1) 옻나무 유래 한약재인 칠목, 칠피, 건칠을 건조하여 분말화 하는 분말화 단계,

2) 상기 분말에 물을 분말 무게의 5~20배수 가하고, 온도를 60~110℃로 올리고, 2~24시간 동안 추출하고, 여과하여 물추출액을 얻는 물추출 단계,

3) 물추출 단계에서 추출액을 여과하고 남은 박에 에탄올 순도 95%(v/v) 이상의 에탄올을 처음 원료무게의 5~10배수 가하고, 60~80℃에서 2~10시간 동안 추출하고, 여과하여 에탄올 추출액을 얻는 에탄올 추출 단계

4) 상기 물 추출단계와 에탄올 추출단계에서 얻어진 추출액을 혼합하고, 농축하여 고형분의 농도가 20~50%(w/v)가 되도록 하는 농축단계,

5) 상기 농축 단계에서 얻어진 농축액에 pH 8.0~9.5의 알칼리수를 가하여 고형분의 농도가 5~40%(w/v)가 되도록 하고, 산소가 함유된 기체를 가하여 주면서 25~110℃에서 0.1~10시간 동안 처리하여 알러지 유발 특성을 제거하는 알칼리수 처리단계,

6) 상기 알칼리수 처리단계에서 얻어진 액을 농축하고 건조하여 분말상으로 된 추출물을 얻는 분말화 단계,

로 구성되는 것을 특징으로 하는 옻나무 유래 추출물의 제조방법.

제 1항에 있어서 5)의 알칼리수 처리단계에서 산소를 함유한 기체로서 산소의 농도가 20~100%(v/v)인 것을 특징으로 하는 옻나무 유래 추출물의 제조방법.

제 1항에 있어서 5)의 알칼리수 처리단계에서 알칼리수를 만드는 방법으로서 전기분해방법 또는 가성소다, 수산화칼슘, 수산화마그네슘 으로 이루어지는 물질 중 한가지 이상을 첨가하여 제조하는 방법 중 한가지를 이용하는 것을 특징으로 하는 옻나무 유래 추출물의 제조방법.

제 1항 내지 3항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 옻나무 유래 추출물.

제 4항에 있어서 옻나무 유래 추출물을 유효성분으로 함유하는 진통용 조성물.

제 4항에 있어서 옻나무 유래 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물.

제 4항에 있어서 옻나무 유래 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물.

제 4항에 있어서 옻나무 유래 추출물을 유효성분으로 함유하는 암발생을 예방하는 암 예방용 조성물.

제 4항에 있어서 옻나무 유래 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품용 조성물.

제 4항에 있어서 푸스틴 5~26%(w/w), 피세틴 1~10%(w/w), 3,4-dihydroxybenzoic acid 0.1~10%(w/w), 폴리페놀 15~45%(w/w)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약리학적 조성물.

Images