JP2018502581A - ルテリオンおよびその分離・培養方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ミトコンドリア類似微細物質であるルテリオン、これの分離方法および培養方法に関し、具体的には特定の大きさの空隙を有するフィルターを利用してルテリオンを分離する方法、このような方法によって分離された特定特性を有するルテリオンおよびこれを増殖させる培養方法に関する。

Description

本発明は、ミトコンドリア類似微細物質であるルテリオン、これの分離方法および培養方法に関し、具体的には特定の大きさの空隙を有するフィルターを利用してルテリオンを分離する方法、このような方法によって分離された特定特性を有するルテリオンおよびこれを増殖させる培養方法に関する。

本出願の発明者等は、患者または健常者で既排出された体液内に存在する微細物質であるルテリアルを効果的に分離できる方法を開発して、分離されたルテリアルの特性を解明した内容を２０１４年５月９日付で特許出願した（ＷＯ２０１５／１０８２４６）。また、患者で既排出された体液内に存在する微細物質の特性を観察することによって疾病を診断および予測できることを発見してこれに対する内容を２０１４年１月１４日付で特許出願した（ＷＯ２０１５／００５５５３）。

このようなルテリアルは、（１）原核細胞と真核細胞の中間段階融合特性を有する細胞または細胞類似体であって；（２）血液、精液、腸液、唾液、細胞液などの体液に存在して；（３）免疫蛍光試験でヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）に陽性の発色反応を示して；（４）最適状態（ｐＨ７．２〜７．４）ではベータ−プロテオバクテリアとガンマ−プロテオバクテリア由来遺伝子の発現特性を示して、３０〜８００ｎｍの大きさを有し；（５）酸性化状態ではベータ−プロテオバクテリアとガンマ−プロテオバクテリア由来遺伝子だけでなく、真核細胞由来遺伝子の発現特性を示すが、主にＳｔｅｒｐｔｏｐｈｙｔａ遺伝子とＨｏｍｏｌｏｇｕｅ特徴が現れて、４００ｎｍ以上から２０００ｎｍ以上まで大きくなって；（６）正常条件でＡＴＰ生成に関与し；および（７）ミトコンドリアとは異なり、エクソソームとは全く違う細胞または細胞類似体である。

このようなルテリアルは主にヒトを含む動物の血液内に存在するのに対して、ルテリアルと類似の構造と機能を有する微細物質である主に植物または食品に存在するルテリオン（Ｌｕｔｅｒｉｏｎ）の存在を確認した。

このような技術的背景下、本出願の発明者は、ルテリオンを臨床に適用することができるように効果的に分離および培養するために鋭意努力した結果、植物または食品に溶媒を添加して振盪させながら発生する気化ガスを収集した後、濾過および遠心分離を介して前記気化ガスに含まれたルテリオンを効果的に分離することができて、これから分離したルテリオンを特定条件および培地の中から培養する可能性があることを確認して、本発明を完成した。

本発明の目的は、ルテリオンを提供するところにある。
本発明の他の目的は、特定の大きさの空隙を有するフィルターを利用してルテリオンを臨床に適用することができるように効果的に分離する方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、ルテリオンの効率的な培養方法を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、下記で選択された一つ以上の特性を有するルテリオンを提供する：
（ａ）５０〜８００ｎｍ）の原形ないし楕円形で、運動性がある；
（ｂ）核酸含有；
（ｃ）免疫化学蛍光染色時ミトコンドリアと類似の反応を示す；
（ｄ）融合（ｆｕｓｉｏｎ）および／または分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）生態様式を示す；
（ｅ）融合がない場合には大きさが５００ｎｍまで成熟して、ＤＮＡ含有類似ミトコンドリアに成熟して、ＳＥＭまたはＴＥＭ電子顕微鏡写真上でミトコンドリアと類似する構造を示す；
（ｆ）エキソソームとは異なる光反応を示す；
（ｇ）ＩＲ照射時または加圧時分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）が発生する；
（ｈ）表面抗原としてＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を発現する；
（ｉ）自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す；
（ｊ）２００〜４００ｎｍ大きさでＡＴＰを産生する；
（ｋ）二重膜または多重膜構造；
（ｌ）付着性がある；
（ｍ）癌細胞のテロメラーゼ活性抑制；
（ｎ）正常細胞のテロメラーゼ活性化促進；
（ｏ）細胞透過能保有；及び
（ｐ）血液脳関門（ＢＢＢ）透過能保有。

本発明はまた、下記の段階を含むルテリオンの分離方法を提供する：
（ａ）植物または食品の水蒸気またはガス振盪抽出物を冷却して取得した凝縮液を０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して濾過する段階；
（ｂ）前記濾過された凝縮液を遠心分離する段階；および
（ｃ）前記遠心分離された上澄み液からルテリオンを分離する段階。

本発明はまた、下記の段階を含むルテリオンの分離方法を提供する：（ａ）ルテリオンを含有する抽出物にルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体またはアプタマーが固定された粒子を添加してルテリオンと粒子の結合を誘導する段階；および（ｂ）前記粒子に結合されたルテリオンを回収する段階。

本発明はまた、前記ルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射または加圧下に１８〜３０℃で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法を提供する。

本発明はまた、前記ルテリオンを糖含有培地でｐＨ５〜９および１８〜３０℃の条件で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法を提供する。

ルテリオンを共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ）で撮影した写真で、その大きさを共に示したものである。 ルテリオンをミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）で染色した後、その発色有無を観察した写真を示したものである。 ルテリオンをローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）で染色した後、その発色有無を観察した写真を示したものである。 ルテリオンの蛍光／非蛍光写真を比較して示したものである（Ａ：ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ Ｇｒｅｅｎ Ｂ） Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｂ：ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３） Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｃ：ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ） Ｒｅｄ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｄ：無染色）。 ルテリオンがローダミン１２３、ミトトラッカーレッド、ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）によって共通して染色した後、その発色有無を示したものである（Ａ：ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ Ｇｒｅｅｎ Ｂ） Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｂ：ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３） Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｃ：ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ） Ｒｅｄ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｄ：無染色）。 ルテリオンの蛍光染色部位の大きさを測定してルテリオンの大きさ（５０〜８００ｎｍ）を示したものである（Ａ：ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ Ｇｒｅｅｎ Ｂ）反応大きさ測定；Ｂ：ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３）反応大きさ測定；Ｃ：ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ） Ｒｅｄ 反応大きさ測定；Ｄ：無染色反応大きさ測定）。 正常なルテリオンのｌｉｆｅ ｃｙｃｌｉｎｇ Ａと突然変異されたルテリオンのｌｉｆｅ ｃｙｃｌｉｎｇ Ｂを示したものである。 ルテリオンが二重膜構造を有することを確認したＴＥＭ電子顕微鏡写真である。 ルテリオンが内部に核酸を含有することを確認した原子顕微鏡写真である。 ルテリオンの内部にＲＮＡが含まれているか否かを分析したバイオアナライザー結果である（Ｌ：Ｃｏｎｔｒｏｌ；１：５０ｎｍ以下、２：５０〜１００ｎｍ、３：１００〜２００ｎｍ、４：２００〜４００ｎｍ）。 ２００〜４００ｎｍのルテリオンの全体ＲＮＡを示したものである。 ５，０００ｐｓｉおよび１０−２０℃条件でルテリオンの分裂誘導結果を示したものである。 １５，０００ｐｓｉおよび１０−２０℃条件でルテリオンの分裂誘導結果を示したものである。 ３５，０００ｐｓｉおよび１０−２０℃条件でルテリオンの分裂誘導結果を示したものである。 ルテリオンをＰＫＨ２６−１、ＰＫＨ２６−２、ＰＫＨ２６−３赤色蛍光で蛍光染色して核内にルテリオンが導入される結果を示したものである。 赤色蛍光で蛍光染色されたルテリオンが細胞内核に導入されることを拡大して確認した結果を示したものである。 蛍光染色されたルテリオンを経口胃管投与した結果を示したものである。 蛍光染色されたルテリオンを腹腔内注射した結果を示したものである。 ルテリオン処理による正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）および癌細胞（肺癌、乳癌、大腸癌）におけるテロメラーゼ活性を示したものである。 ルテリオン処理濃度に応じた正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）および様々な癌細胞（肺癌、乳癌、大腸癌、肝臓癌、白血病）の細胞生存能を示したものである。 多様な由来のルテリオンを処理したすい臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１）における細胞増殖抑制を示したものである。 多様な由来のルテリオンを処理したすい肺癌細胞株（Ａ５４９）における細胞増殖抑制を示したものである。 多様な由来のルテリオンを処理したすい乳癌細胞株（ＢＴ−２０）における細胞増殖抑制を示したものである。 ルテリオン処理による正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）におけるテロメラーゼ活性を示したものである。 ルテリオン処理によるＡＴＰ生成および抑制の有無を確認するためのＡＴＰアッセイデザインに対する模式図である。 Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）でルテリオンを撮影した結果を示したものである。 Ｂｒｕｋｅｒ Ｆａｓｔ Ｓｃａｎ ＡＦＭ原子顕微鏡でルテリオンを撮影した結果を示したものである。 ルテリオンを抗−ＣＤ３９抗体結合およびミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）、ＤＡＰＩによって共通的に染色した後、その発色有無をそれぞれまたは併合して示したものである。 ルテリオンを抗−ＣＤ７３抗体結合およびミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）、Ｈｏｅｃｈｓｔによって共通的に染色した後、その発色有無をそれぞれまたは併合して示したものである。 ルテリオンが、抗−ＣＤ３３２抗体に陽性であるか否かを蛍光発光を介して確認した結果を示したものである。 ルテリオンが、抗−ＣＤ１３３抗体に陽性であるか否かを蛍光発光を介して確認した結果を示したもので、上段はＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）蛍光染色した結果を示して、下段は抗−ＦＩＴＣで蛍光染色した結果を示したものである。 ルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体が固定された粒子に炭素、カルボキシル基コートをする段階を示したものである。 ルテリオンと磁性粒子が固定されたルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体が結合された複合体を磁石を使用して分離する段階を示したものである。 ルテリオン分離後、蛍光顕微鏡で撮影した写真を示し、（ａ）はルテリオンをナノフィルターを使用して分離した後、蛍光顕微鏡で撮影した写真を示したもので、（ｂ）はルテリオンをルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体が固定された粒子を利用した分離方法を使用して分離した後、蛍光顕微鏡で撮影した写真を示したもので、（ｃ）はルテリオンをナノフィルターを使用して分離した後、電子顕微鏡で撮影した写真を示したもので、（ｄ）はルテリオンをルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体が固定された粒子を使用した分離方法を使用して分離した後、電子顕微鏡で撮影した写真を示したものである。 ルテリオンの抽出数水を示し、（ａ）はルテリオンをナノフィルターを使用して分離した後、ルテリオンの抽出数水を示したもので、（ｂ）はルテリオンをルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体が固定された粒子を利用した分離方法を使用して分離した後、ルテリオンの抽出数水を示したものである。 ルテリオンの抽出段階を具体的に図示した模式図である。 ルテリオン処理による癌細胞におけるＡＴＰ生成減少を示したものである。 ルテリオン処理による正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）におけるＡＴＰ生成を示したものである。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明で使用する用語「ルテリアル（ｌｕｔｅｒｉａｌ）」および「ルテリオン（ｌｕｔｅｒｉｏｎ）」とは、動物および植物を含むすべての生命体に存在する５０〜４００ｎｍ大きさのナノ生命体で、ウイルスと類似する程度から融合時８００〜１２００ｎｍまでの大きさを有する反面、１２００ｎｍ以上で遺伝子異常および病理現象を発現する変異体に分類される微細物質を本発明者が命名したものである。

ルテリアルおよびルテリオンは、ＤＮＡとＲＮＡを含み、運動性と付着性を有する点でエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）や微小小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）とは区別される。ミトコンドリアは、ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）および蛍光染色であるローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、およびＤＡＰＩによって発色が確認されるが、前記ルテリオンおよびルテリアルもミトコンドリアと同じ染色剤によって発色が確認されて（図１〜図６）、ミトコンドリアと類似して二重膜を有する膜構造として内部クリステ（ｃｒｉｓｔａｅ）構造を完成しなかった状態の構造を有して（図７）、ミトコンドリアと同じレーザー波長範囲で観察される点で「類似ミトコンドリア」、「ミトコンドリア類似体」あるいは「ミトコンドリア前駆体（ｐｒｏｔｏ−ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」とも称してもよい。

ルテリアルは、生態系で宿主体内に存在するナノ生命体を意味して、ヒトを含む動物の場合には、血液、唾液、リンパ管、精液、膣液、母乳（特に、初乳）、臍帯血、脳細胞、脊髄、骨髄に存在することができる。一方、ルテリオンは宿主が食べ物などとして使用できるナノ生命体を意味して、植物や食品に主に存在することができる。

ルテリオンは、血液由来ルテリアルとは違って室温でも速く溶解したり消滅はせず、長期間保管しても融合（ｆｕｓｉｏｎ）して突然変異化されない特性がある。

一観点において、本発明は、下記で選択された一つ以上の特性を有する分離されたルテリオンに関する：
（ａ）５０〜８００ｎｍ）の原形ないし楕円形で、運動性がある；
（ｂ）核酸含有；
（ｃ）免疫化学蛍光染色時ミトコンドリアと類似の反応を示す；
（ｄ）融合（ｆｕｓｉｏｎ）および／または分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）生態様式を示す；
（ｅ）融合がない場合には大きさが５００ｎｍまで成熟して、ＤＮＡ含有類似ミトコンドリアに成熟して、ＳＥＭまたはＴＥＭ電子顕微鏡写真上でミトコンドリアと類似する構造を示す；
（ｆ）エキソソームとは異なる光反応を示す；
（ｇ）ＩＲ照射時または加圧時分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）が発生する；
（ｈ）表面抗原としてＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を発現する；
（ｉ）自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す；
（ｊ）２００〜４００ｎｍ大きさでＡＴＰを産生する；
（ｋ）二重膜または多重膜構造；
（ｌ）付着性がある；
（ｍ）癌細胞のテロメラーゼ活性抑制；
（ｎ）正常細胞のテロメラーゼ活性化促進；
（ｏ）細胞透過能保有；及び
（ｐ）血液脳関門（ＢＢＢ）透過能保有。

本発明の一実施例によると、ルテリオンは生命因子（ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ）として、ウイルスと類似する程度から約５００ｎｍまで（正常分裂段階５０〜５００ｎｍ／異常融合段階８００ｎｍ以上）の大きさを有する微細物質を本発明者が命名したものである。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み、運動性を有する点で微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）とは区別される。また、自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｒｅｓｃｅｎｃｅ）および光合成の特性を有する。ミトコンドリアは蛍光染色剤であるローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、ＤＡＰＩ、およびヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）により発色が確認されるが、ルテリオンもミトコンドリアと同じ前記染色剤によって発色が確認されるので、前記染色剤によってルテリオンが正しく分離されたか確認することができる（図１〜図６）。

また、ＤＡＰＩおよびアクリジンオレンジ（ＡＯ）染色法によってルテリオン内にＲＮＡだけでなくＤＮＡも含まれていることを確認することができる。具体的に、ＲＮＡはアクリジンオレンジ染色剤によって励起４６０ｎｍ、放出が６５０ｎｍであるｌｅｖｅｌでオレンジに染色されて、ＤＮＡは、励起５０２ｎｍ、放出が５２５ｎｍであるｌｅｖｅｌで緑色に染色されて、ＤＡＰＩ染色法によると、ＤＮＡが含まれていることを確認することができる。本発明のルテリオンは、前記染色法を利用してルテリオン内にＲＮＡとＤＮＡが含まれていることを確認することができる。

本発明の一実施例では、ルテリオンの構造を確認した結果、二重膜または多重膜を有することを確認することができ（図８）、ルテリオンの内部に核酸、特にＲＮＡを含有することを確認した（図９および図１０）。

従来、植物または食品内にルテリオンが存在する事実が知られていなかったため、ルテリオンの分離方法や培養する方法に対する技術は皆無であると言える。本発明によるとルテリオンを効果的に分離・培養する方法を提供することができる。

他の観点において、本発明は、下記の段階を含むルテリオンの分離方法に関する：（ａ）植物または食品の水蒸気またはガス振盪抽出物を冷却して取得した凝縮液を０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して濾過する段階；（ｂ）前記濾過された凝縮液を遠心分離する段階；および（ｃ）前記遠心分離された上澄み液からルテリオンを分離する段階。

まず、前記段階（ａ）は、植物または食品の水蒸気またはガス振盪抽出物を冷却して取得した凝縮液を０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して濾過する段階である。

一実施例で、前記振盪抽出は、植物または食品に溶媒を添加して、５０〜９０℃で気体を利用して間欠的にバブリングさせながら振盪するように進行することができる。本発明で使用されるルテリオンはその密度が１以下で脂肪および地質よりは高い密度を有してタンパク質よりは低い密度を示すので、水蒸気蒸留法によって植物または食品から分離することができるが、これに限定されない。

５０〜９０℃の気体を利用して間欠的にバブリングさせながら振盪すると、ルテリオンが気体と共に水蒸気またはガス形態で遊離されるが、水蒸気またはガスと共に振盪すると、ルテリオンを含む植物または食品の沸点が落ちるようになって、ルテリオンの分解、変質または損傷を防ぐことができる。

場合により、前記（ａ）段階で８〜１０時間振盪して、２〜３時間毎に２０〜３０分間バブリングして植物または食品のルテリオンがかたまらないようにする段階を追加で行うことによって、ルテリオンの分離効率を増加させることができる。

前記段階（ａ）における抽出−濾過に対する具体的内容は図３７に示した。植物または食品に溶媒、例えば蒸溜水を添加して、振盪を介して抽出した後、約１００−２５０ｇ、好ましくは１９０ｇで一次遠心分離してスピンダウンして不純物を除去して、約１０００−５０００ｇ、好ましくは約３０００ｇで二次遠心分離して数分〜数十分（好ましくは二時間内外）の間安定させた後、上澄み液を収集することができる。場合により、この時ＣＤ３３２を染色して運動性を確認した後、ルテリオンの存在の有無を一次的に確認することができる。以後、純粋なルテリオンを得るために１００，０００−１５０，０００ｇ、好ましくは１２０，０００ｇで三次遠心分離する段階を行うことができる。

以後、約８００ｎｍのフィルターで濾過された下層部を収集して、プラズマなど内部植物またはエクソソームなど細胞死骸（Ｄｅｂｒｉｓ）ペレットを除去する。以後、再び１４０，０００ｇ以上で遠心分離してペレットが含まれない上澄み液を収集することができる。上澄み液を４００ｎｍのフィルターで濾過して下層部を収集した後、再びＣＤ３３２を染色して運動性を確認することができる。さらに、５００ｎｍのフィルターで濾過して、フィルターの上にかかった上澄み液を集めてルテリオンを収集することができ、ｐＨ１または−９０℃以下の温度で固定させることができる。

一実施例で、前記植物は表１〜４で選択された薬用植物を使用することができる。ルテリオンはすべての植物に存在するので、表１〜４に記載された薬用植物に制限されない。

また、植物に含まれたルテリオンは植物の幹の方に多量分布すると予想され、幹の部分を含んでルテリオンを分離することが好ましい。

前記凝縮液は、前記振盪によって気化される水蒸気またはガスを捕集した後、冷却させて取得することができる。捕集された気化水蒸気またはガスと分離された状態のルテリオンを取得したり、これと混合された状態のルテリオンを取得することができ、気化水蒸気またはガスとルテリオンが混合された場合、別の分離手順を追加で経てルテリオンを取得することができる。

場合により、前記（ａ）段階で取得された凝縮液にＩＲ光線を照射する段階をさらに含んでもよい。例えば、ＩＲ光線を２０〜６０分、好ましくは３０〜４０分照射してルテリオンが変形されることを防止できて、段階（ｃ）を行う前にＩＲ光線照射によって運動性を有するルテリオンが集まるようにすることによって高濃度のルテリオンが取得できるようにする。

前記段階（ｂ）は、０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して前記取得された凝縮液を濾過する段階である。０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターは、ルテリオンの長径を考慮して本出願の発明者によって導き出された最適な大きさで、これにより前記（ａ）段階で取得された凝縮液中目的とするルテリオン含有溶液を濾過することができる。

前記段階（ｃ）は、前記濾過された凝縮液を遠心分離する段階である。これにより、さらに純度の高いルテリオンを取得することができる。前記遠心分離は、１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間繰り返し行われるが、純度向上のためのいかなる遠心分離条件でも調整して適用できる。

前記段階（ｃ）は、遠心分離された上澄み液からルテリオンを分離する段階である。例えば、前記遠心分離された上澄み液に２００〜６００ｕｍ波長のＩＲ光線を照射して運動性を有して集まるルテリオン粒子を分離したり、ルテリオン表面抗原ＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を認知する結合体との結合の有無を確認してルテリオン粒子を分離することができるが、これに制限されない。

このように段階（ｃ）を介してルテリオンを分離した以後にも、分離されたルテリオン粒子を５０ｎｍ未満の空隙を有するフィルターで濾過した後、フィルターにかかった部位を収集してフィルターにかかったルテリオンだけを分離することもできる。前記過程を介してルテリオン以外の微細物質は除去することができ、５０ｎｍ以上の大きさを有するルテリオンを取得することができる。

場合により、追加で２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍおよび１０００ｎｍのフィルターを順次利用して、それぞれ５０〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、４００〜６００ｎｍ、６００〜８００ｎｍおよび８００〜１０００ｎｍの大きさのルテリオンに分類することができる。本発明に係るルテリオンは、暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を介して観察が可能で、それぞれ２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍおよび８００ｎｍのフィルターを順次利用して大きさにより５０−２００ｎｍ（発生期）／２００−４００ｎｍ（成熟期）／４００−６００ｎｍ（分裂期）／６００−８００ｎｍ（過分裂期）に区分することができる（図２７および図２８）。

以後、特定ｐＨ条件および温度条件でルテリオンを固定する段階を追加で含むことができる。例えば、ｐＨ７以下および０℃以下の条件で固定させることができる。好ましくは、ｐＨ１〜５および−９０℃〜０℃で固定させることができる。本発明の一実施例で、特にｐＨ１〜３の条件で０℃以下の温度で固定する場合、運動性を有するルテリオンを固定することができることを確認した。ルテリオンを固定すると分離効率を向上させることができる。

また、追加増殖段階、例えば分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）誘導段階を含むことができる。２５，０００ｐｓｉ（ｐｏｕｎｄ ｐｅｒ ｓｑｕａｒｅ ｉｎｃｈ）以上の圧力を加えて分裂を誘導することができるが、本発明の一実施例で、特に２５，０００〜３５，０００ｐｓｉの圧力を加えると、分裂が誘導されることを確認した。この時、温度は１０〜２０℃に維持し、固定時使用したｐＨ１〜３条件を維持した。

他の観点において、本発明は、下記の段階を含むルテリオンの分離方法に関するものである：（ａ）ルテリオンを含有する抽出物にルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体またはアプタマーが固定された粒子を添加してルテリオンと粒子の結合を誘導する段階；および（ｂ）前記粒子に結合されたルテリオンを回収する段階。

本発明ではルテリオン表面に特異抗原が発現することに基づいて大量のルテリオンを効率的に分離しようと前記特異抗原に対する抗体またはアプタマーが固定された粒子を利用してルテリオンの分離を試みた。その結果、本発明の一実施例では、従来の方法より短時間で大量にルテリオンが分離できることを確認した。

前記ルテリオンを含有する抽出物は、例えば、（ｉ）植物または食品の熱水抽出物、（ｉｉ）植物または食品の溶媒抽出物、または（ｉｉｉ）溶媒の抗生剤存在下に植物または食品の加熱によって発生するガスの凝縮液であってもよい。

前記熱水抽出物は、例えば４０℃以上の水を利用して植物から生理活性物質を抽出したものであれば、特に制限されず熱水抽出を使用すると有機溶媒の毒性に起因した問題が発生しない。前記溶媒抽出物は、例えば、エーテル（ｅｔｈｅｒ）、メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）のような溶媒を使用して抽出されたものであってもよい。

前記凝縮液は、植物または食品に蒸溜水を添加して、５０〜９０℃で気体を利用して間欠的にバブリングしながら振盪して、前記振盪によって気化される水蒸気またはガスを捕集した後、冷却させて取得した凝縮液であってもよい。

本発明に係る「ルテリオン表面抗原」とは、ルテリオン膜の脂質層に置かれている疏水性アミノ酸を含有するカルボキシ末端ドメインを介して細胞表面膜に接着されていて、生物学的な抗原効果を発揮できるもので、例えばＣＤ３９（Ｅｃｔｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ １；ＥＮＴＰＤ１）、ＣＤ７３（Ｅｃｔｏ−５’ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ；ＮＴ５Ｅ）、ＨＢｓＡｇ、ＳＬＣ３Ａ２、ＣＤ１０９、ＬＹ９、ＣＤ３３２、ＣＤ１３３またはＣＤ５３であり、好ましくはＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ３９またはＣＤ７３であってもよい。

「抗体」とは、抗原性部位に対して指示されて特異的に結合するタンパク質分子を意味する。本発明は、ルテリオン表面抗原に特異的に結合できる物質に粒子を固定して使用したが、前記抗原と特異的に結合する抗体を使用することができる。本発明で利用可能な抗体は、例えば、抗−ＣＤ３３２抗体、抗−ＣＤ１３３抗体、抗−ＣＤ３９抗体または抗−ＣＤ７３抗体であってもよい。抗体は、市販中の製造されたものを使用することができる。このような抗体の代わりに前記表面発現される抗原に結合するアプタマーを利用してもよい。

「粒子」とは、特性により磁性特性、発光特性、静電気特性およびイオン性を帯びることができるものと、大きさによりマイクロまたはナノの大きさを有するものを意味して、抗体との結合を介してルテリオンを分離することができるものであれば特に制限されないが、例えば磁性粒子、シリカ粒子、量子ドット粒子、ガラス粒子、高分子粒子、繊維粒子および蛍光粒子で構成された群から選択される。また、前記粒子は磁性特性と蛍光特性を同時に有する粒子、磁性粒子に量子ドットおよび金、銀粒子を結合させた粒子を含むことができる。

前記粒子は、例えば、磁性粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ）であり、前記磁性粒子は、磁性を帯びて、磁場によって動く粒子を意味する。前記磁性とは、常磁性を有するものであり得る。磁性粒子は、例えば、金属物質（ｍｅｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）、磁性物質（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ）または磁性合金（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｌｌｏｙ）を含むことができる。磁性粒子は、磁性を帯びる粒子であるが、本発明で磁性粒子はこれに限定されず、それ自体が磁性を帯びないが、磁性を有することができるまたは磁力で引っ張られて金属粒子であってもよい。また、前記金属粒子は、例えば、鉄、アルミ、コバルト、ニッケル、マンガン、錫、亜鉛、カドミウム、マグネシウム、銅、バリウム、リチウムまたはイットリウムの酸化物で構成された群から選択されたいずれか一つで製造できる。この中好ましくは鉄が選択される。前記粒子は、マイクロメートルの大きさである場合には強磁性を帯びるが、ナノメートルの大きさの小さい粒子は、超磁性を帯びる。このような粒子は合成が容易で、大きさを容易に調節することができる。例えば、１〜１，０００ｎｍの大きさを有して、好ましくは１０〜１，０００ｎｍ、より好ましくは１０〜５００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜１００ｎｍの大きさの粒子を使用することができる。

場合により、前記磁性粒子に分散性と安全性を維持するために、磁性粒子を改質させることができて、例えば炭素をコートして改質することができる。

追加で、抗体またはアプタマー結合に適した官能基をさらに含むことができる。前記官能基は、例えば、アミド基（ａｍｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）、エステル基（ｅｓｔｅｒ ｇｒｏｕｐ）、アミン基（ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）、カルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）、チオール基（ＳＨ）、エポキシ基（ｅｐｏｘｙ ｇｒｏｕｐ）、フェニル基（ｐｈｅｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）、スルフォン基（ｓｕｌｐｈｏｎｅ ｇｒｏｕｐ）、アルコキシ基（ａｌｋｏｘｙ ｇｒｏｕｐ）、アルデヒド基（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ）、ケトン基（ｋｅｔｏｎｅ ｇｒｏｕｐ）から選択されたものであってもよい。前記アミン基（ＮＨ_２）は、モノアミン（ｍｏｎｏａｍｉｎｅ）、ジアミン（ｄｉａｍｉｎｅ）、トリアミン（ｔｒｉａｍｉｎｅ）、エチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ）またはジエチレントリアミン（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ）であってもよい。

前記粒子に結合されたルテリオンを回収する段階で、粒子が磁性粒子である場合、前記（ｂ）段階は、外部で磁性を加えてルテリオンが結合された磁性ナノ粒子を回収することを特徴とする。

前記磁性を加えてルテリオンが結合された磁性ナノ粒子を集めた後、回収する方法は、前記ルテリオンとルテリオン表面抗原に結合する抗体またはアプタマーが固定された磁性粒子が含まれた試料を混合して反応した後、常温で磁石または磁気活性細胞分離器（Ｍａｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＭＡＣＳ）を利用して収集後、上澄み液を除去して、緩衝溶液に再懸濁させた後、凝集用フィルムおよび捕獲用ろ過膜に順次通過させて結果的にルテリオン−抗体−磁性粒子複合体を確認することができる。

本発明で、前記粒子が蛍光粒子である場合、前記（ｂ）段階は、蛍光利用セルソーターを利用してルテリオンが結合された粒子を回収することを特徴とする。

前記蛍光利用セルソーターを利用した回収方法は、蛍光の種類と程度により細胞のような形態の微細物質を分類する方法で、定量的分析と分類のために蛍光を帯びる細胞が所定の管を介して流れるようにする「流れ制御系（ｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）」と、流れ制御システムに制御により流れる微細物質を観察するための「光学系（ｏｐｔｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ）」と光学系の光信号を電気信号に変えて処理する「電子系（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）」からなる。蛍光活性細胞分類装置は、種々の細胞を特性により効率的に分類収集する装置であり、生命科学（動物学、植物学、微生物学、農学、水産学、林学など）と医学研究において多く活用される装置である。本発明の蛍光粒子に含まれる蛍光物質は、生体イメージングに使用できる蛍光物質ならいずれも使用可能である。前記蛍光物質は、これに制限されないが、ローダミンとその誘導体、フルオレセインとその誘導体、クマリンとその誘導体、アクリジンとその誘導体、ピレンとその誘導体、エリトロシンとその誘導体、エオシンとその誘導体、および４−アセトアミド−４’−イソシオチアナトスチルベン−２、２’ジスルホン酸で構成された群から選択されるものであってもよい。蛍光物質をより具体的に例示すると、下記のとおりである：
ローダミンおよびその誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウムキレート誘導体、Ａｌｅｘａ誘導体、Ａｌｅｘａ−３５０、Ａｌｅｘａ−４８８、Ａｌｅｘａ−５４７、Ａｌｅｘａ−６４７；フルオレセインおよびその誘導体：５−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４、６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオセイン（ＪＯＥ）、フルオセイン、フルオセインイソチオシアナート、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアナート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、ｏ−フタルアルデヒド；クマリンおよびその誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）、シアノサイン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’、５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏ−ｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリンジエチレントリアミンペンタアセテート、４−（４’−ジイソチオシアナトデヒドロ−スチルベン−２、２’−ジスルホン酸、４、４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２、２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−塩化スルホニル（ＤＮＳ、ｄａｎｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナート（ＤＡＢＩＴＣ）；アクリジンおよびその誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアナート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３、５ジスルホネート（ＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗ ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ；ピレンおよびその誘導体：ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ）；エリスロシンおよびその誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアナート、エチジウム；エオシンおよびその誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアナート；４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２、２’ジスルホン酸。

本発明で、前記粒子が静電気を帯びた粒子である場合、前記（ｂ）段階は、不均一な電場を形成して粒子に双極子モーメントを形成させて、静電気的引力でルテリオンが結合されたイオン性粒子を回収することを特徴とする。

前記不均一な電場を形成して粒子に双極子モーメントを形成させて、静電気的引力でルテリオンが結合されたイオン性粒子を回収する方法は、粒子分離装置の一種である電気的粒子分級装置（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｚｅｒ；ＤＭＡ）を介して可能となる。電気的粒子分級装置は、静電気力による粒子の移動度差を利用して粒子を分類する装置で、微分型電気移動度分析機または微分型静電分級機とも呼ばれる。具体的に電気的粒子分級装置は、荷電された粒子の移動速度が粒子径の関数であることを利用して、多分散（ｐｏｌｙ−ｄｉｓｐｅｒｓｅ）粒子から所望の径を有する単分散（ｍｏｎｏ−ｄｉｓｐｅｒｓｅ）粒子を選別する装備である。

本発明で、前記粒子がイオン性粒子、例えば、陰イオン性または、陽イオン性粒子である場合、前記（ｂ）段階は、静電気的引力を利用してルテリオンが結合されたイオン性粒子を回収することができる。

前記静電気的引力でルテリオンが結合された繊維粒子を回収する方法は、前記電気的粒子分級装置（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｚｅｒ；ＤＭＡ）を介して可能となる。
本発明は、粒子に結合されたルテリオンからルテリオンのみを分離する段階を追加で含むことができる。

前記粒子に結合されたルテリオンにＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝溶液を加えて２５℃でインキュベーティング（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）させた後、磁性またはイオン性を利用してＢＳＡが吸着された粒子だけを分離して、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）が吸着された粒子に再びＰＢＳを加えてインキュベーティング（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）をして粒子を脱着させてルテリオンのみを分離することができる。

さらに他の観点において、本発明は、ルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射または加圧下に１８〜３０℃で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法に関する。

一実施例で、前記培養時添加される水分は、食塩水またはＰＢＳ溶液であってもよいが、これに限定されない。

さらに他の観点において、本発明は、ルテリオンを糖含有培地でｐＨ５〜９（固定時はｐＨ１〜３）および１８〜３０℃の条件で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法に関する。

一実施例で、前記糖は、ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）またはキシロース（ｘｙｌｏｓｅ）であってもよく、好ましくはグルコースであってもよい。本発明の一実施例で、グルコースを含む培地、例えばＤＭＥＭ培地または血液培地にグルコースを約１〜１０％、好ましくは２〜８％の濃度で添加して、ｐＨ７および約２０℃の条件を維持する最適にルテリオンを培養することができることを確認した。培養されたルテリオンの数は、ルテリオン特異的表面抗原であるＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を含むルテリオンとミトトラッカーレッドに染色されたルテリオン数をカウントして確認した。

培養前のルテリオンは、その大きさが５０〜２００ｎｍであってもよいが、本発明の培養方法により培養されたルテリオンの培養後大きさは、３００〜５００ｎｍであってもよい。この時、顕微鏡で観察しながらルテリオンの大きさが５００ｎｍを越えないようにすることができ、培養が終了すると、大きさ別に分類して−８０℃に冷却して保管するか、窒素で充填して保管または０℃以上で保管でき、保管時保存剤を添加することができる。

前記の通り培養されたルテリオンは、一定期間特性への変化なしに所望の大きさ（５００ｎｍ以下）で保管が可能でルテリオンを利用した疾病の治療に効果的に活用することができる。

具体的に、本発明に係るルテリオンは、細胞内核に導入されることができる。ルテリオンを赤色蛍光で蛍光染色してルテリオンが細胞内核に導入されるか否かを確認した結果、ルテリオンがＤＡＰＩで染色された細胞内核に導入されることを確認した。

また、本発明に係るルテリオンを蛍光染色して、蛍光染色されたルテリオンを腹腔内注射（ＩＰ）および経口胃管投与法で投与した結果、経口投与時には少なくとも３時間以後、腹腔内注射時５分以内にＢＢＢを通過することを確認することができる。このような特性を活用して本発明に係るルテリオンは、退行性脳疾患などの治療に当たり血液脳関門を通過できなくて治療剤として使用できなかった薬物の限界を克服することができて、これを利用して血液脳関門通過可能な退行性脳疾患治療剤として使用したり、従来既知の薬物が血液脳関門に通過できるようにする薬物伝達体としても使用できる。

また、本発明によるルテリオンは、癌細胞でテロメラーゼ活性を阻害して、正常細胞では影響がないかまたはテロメラーゼ活性を増進させて、効果的に癌細胞の増殖だけを抑制させる抗癌効果がある。

一方、正常細胞ではルテリオン処理によってテロメラーゼ発現が増加してテロメアの長さが増加して、ルテリオンは正常細胞ではテロメラーゼ活性を増進させる抗老化活性を示すことを確認することができた。

本発明で「正常細胞」とは、癌細胞と共に増加したテロメラーゼ活性を有して、無限増殖をする表現型を有する細胞でなく正常な老化プロセスを有する細胞を意味する。

本発明の用語「テロメラーゼ」とは、テロメアの末端に対するテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）反復の添加を触媒するリボ核酸タンパク質を意味する。テロメアは、染色体の末端を覆う反復配列の長い拡張であり、染色体を安定させるものであると考えられる。人において、テロメアは、典型的に長さが７−１０ｋｂで、配列−ＴＴＡＧＧＧ−の多重反復を含む。テロメラーゼは多くの成人細胞で発現されず、テロメアの長さは、連続的な原形の複製を減少させる。細胞複製が特定回数以上になると、テロメアは次第に縮小されて、細胞が末端崩壊段階に入ることになり、これによって細胞は老化することになる。テロメラーゼは、体細胞で不活性であるが、癌細胞の９０％では活性であり、テロメラーゼ抑制剤は癌と戦うのに有用であり得る。

さらに、健常者線維芽細胞にルテリオンを処理した結果、前記ヒト正常細胞のテロメラーゼ発現が増加して、ＡＴＰ生成が増加することを確認することができた。すなわち、ルテリオンが正常細胞のテロメラーゼ活性増加を介して老化を抑制できることを確認することができた。従って、本発明に係るルテリオンは、増大されたテロメラーゼ発現および／またはテロメラーゼ活性によって影響されやすい疾患または症状の治療に使用でき、治療が必要な患者に投与することを含む患者の細胞または組織内テロメラーゼ活性を増加させることができる。

「老化に伴う疾病または疾患」とは、腫瘍形成及び癌の悪性発展、心筋梗塞（臓内麻痺）、小脳梗塞、脳卒中、パーキンソン病、心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧、白内障、老化に伴う視力減退、筋減少症、骨関節炎、骨粗鬆症、骨髄損失、多発性硬化症、シェーグレン症候群、リュウマチ性関節炎、免疫機能低下、糖尿病、特発性肺線維症、及び神経退行性疾病、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びテストステロン、エストロゲン、成長ホルモン、ＩＧＦ−Ｉ、またはエネルギー生成の減少によりもたらされた障害を意味する。

「老化防止効果」とは、増加されたミトコンドリア生物発生および機能、減少されたＲＯＳレベル、老化細胞およびニューロン細胞のような体細胞分裂後細胞の延びた寿命、腫瘍形成、癌の悪性発展、小脳梗塞および心筋梗塞といった老化に伴う現象の防止を含む表現型を意味する。

細胞の発電所であるミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）は、呼吸作用が最も活発な酸素消耗処としてすべての細胞が新陳代謝活動を行う場所であり、この活動は細胞外他のすべての活動に必要なエネルギーを供給する（Ｂｏｖｅｒｉｓ Ａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３４：７０７−７１６、２９７３）。ミトコンドリアの酸素で運搬される電子伝達過程で生成されるＯ２・−またはＯＨ・のようなｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）は、ミトコンドリアの構造と成分を破壊して、これは呼吸率と酸化的リン酸化反応に変化を誘発して結果的に細胞代謝を決定するＡＴＰ生成やＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比に影響を与えるようになる。高等動物の多くのエネルギーは、ミトコンドリアで合成されるＡＴＰに充てて、ミトコンドリアで起きるエネルギー代謝作用は、老化と密接な関係にあるとされている（Ｌｅｅ ＪＷ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ．５２（１０）：１００７−１９、２００９）。

ルテリオン処理による正常細胞におけるＡＴＰ生成増加を確認した。本明細書で使用された、用語「老化に伴う疾病または症状を予防すること」とは、それが発生する場合を減らし、老化に関連した疾病を遅延させたりひっくり返すことを指し示す。

本明細書で使用された、用語「老化」または「老化細胞」とは、テロメア機能障害、ＤＮＡ損傷、または腫瘍遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）活性化によって誘発され得る、有糸分裂細胞における細胞サイクル停止状態を示す。出芽酵母で、テロメア機能障害によってもたらされた老化細胞が細胞サイクルのＧ２／Ｍ期に停止している。哺乳類細胞では、老化細胞が細胞サイクルの外部の非−分裂期であるＧ０期に停止している。ＷＩ−３８線維芽細胞における老化は、顕微鏡で観察時パッセージ以後１０日間その数が増加せずβ−ガラクトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）陽性着色を示す細胞を意味する。

本明細書で使用された、用語「細胞分裂以後細胞」とは、細胞サイクル外部の非−分裂期であるＧ０期に停止しているが、残りの生物の生命のためにその主な機能は行う細胞のグループを指し示す。体細胞分裂以後細胞はニューロン細胞、心臓筋肉細胞、および筋肉細胞を含む。肝および腎臓の組織実質（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）細胞のように、成熟した生物の一部細胞の種類は半−永久的にＧ０期に入って、非常に特別な環境でだけ再び分裂を始めるように誘発されることができる。このような種類の細胞は、それらがＧ０期にある時体細胞分裂以後細胞と考慮される。

前記老化に伴う疾病または症状は、ミトコンドリア機能損失、テロメア機能障害、老化細胞退化および寿命−依存的（ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）細胞損失、またはミトコンドリア退化または体細胞分裂後細胞の細胞サイクル停止状態と関連する。

一実施様態で、ルテリオンは、テロメラーゼ酵素と相互作用して、個体の組織または細胞でテロメラーゼ発現および／または活性を刺激および／または増加させる。一部実施様態で、このような活性は減少されるかないことがあり、これによって個体の疾患、または症状と関連した病因または症候群の増大または発達を招く。このような疾患または症状は、特に、健康な組織におけるテロメラーゼ発現および／または活性を増加させることによって、個体の寿命を延ばすと共に個体の健康を維持するか／して、本願に記載されたような「治療」とは、用語に含まれる任意の実施様態をはじめとする臨床治療および／または診断分野を含むことができる。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：ルテリオンの分離
（１）ルテリオン抽出
薬用植物である漆（Ｒｈｕｓ ｖｅｒｎｉｃｉｆｌｕａ ｓｔｏｋｅｓ）１００ｇを２０−３０倍の大きさ、すなわち２−３リットル容器の大きさに合わせて切断して容器に入れて、植物の５〜８倍である５００〜８００ｇ（好ましくは植物の６倍、すなわち６００ｇ）の蒸溜水を容器に投入した後、８０℃以下で全湯を行った。約８時間程度全湯をするが、約３時間毎に２０〜３０分間酸素でバブルリングを加えて植物のルテリオンがかたまらないようにした。前記バブリング後抽出時スチームされる気化した水蒸気をフラスコに収集した。前記収集した水蒸気を冷却して凝縮させて取得した凝縮液にＩＲ光線（波長：３〜１０００ｕｍ内外、好ましくは２００〜６００ｕｍ）を１−２時間照射してルテリオンが変異されず分裂が誘導されるようにした。このような過程を図３７に模式的に示した。

（２）遠心分離および濾過による分離
（１）で収集した凝縮液を１９０ｇで一次遠心分離してスピンダウンして不純物を除去して、３０００ｇで二次遠心分離して数分〜数十分（好ましくは二時間内外）の間安定させた後、上澄み液を収集した。この時ＣＤ３３２を染色して運動性を確認した後、ルテリオンの存在の有無を一次的に確認した。以後、純粋なルテリオンを得るために、１２０，０００ｇで三次遠心分離した。

約８００ｎｍのフィルターで濾過された下層部を収集して、プラズマなど内部植物またはエクソソームなど細胞死骸（Ｄｅｂｒｉｓ）ペレットを除去した後、再び１４０，０００ｇ以上で遠心分離してペレットが含まれない上澄み液を収集した。上澄み液を４００ｎｍのフィルターで濾過して下層部を収集した後、再びＣＤ３３２を染色して運動性を確認した。５００ｎｍのフィルターで濾過して、フィルターの上にかかった上澄み液を集めてルテリオンを収集して、ｐＨ１または−９０℃以下の温度で固定させた。

前記過程によって長径５０〜８００ｎｍのルテリオンを取得することができ、これは暗視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を介して観察確認が可能であった。前記取得したルテリオンは大きさにより５０〜２００ｎｍ（発生期）／２００〜４００ｎｍ（成熟期）／４００〜６００ｎｍ（分裂期）／６００〜８００ｎｍ（過分列期）に区分した。
同様の方法で表１〜４に記載された薬用植物、当帰、漆皮およびキウィからルテリオンを取得した。

（３）表面抗原特異的抗体による分離
３−１）ルテリオン表面抗原確認
植物から分離したルテリオンに抗−ＣＤ３９抗体（ｓｃ−１８７６６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−ＣＤ７３抗体（ｓｃ−２５６０３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または抗−ＣＤ３３２抗体（ＢＳ−０６７５Ｒ、Ｂｉｏｓｓ Ｉｎｃ）を結合させて、抗−ＦＩＴＣを結合させて発色有無を観察（青色蛍光：ＣＤ１３３／１−ＶＩＯＢＲＩＧＨＴ−ＦＩＴＣ製造）した。赤色蛍光は、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｔｅｃｈ ＧｍｂＨ製造）で染色した。また、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）とＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色した後、その発色有無を蛍光顕微鏡を介して観察した。

その結果、ミトトラッカーとＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔによって染色されたルテリオンに抗−ＣＤ３９抗体、抗−ＣＤ７３抗体、抗−ＣＤ１３３抗体または抗−ＣＤ３３２抗体が結合することを確認することによって、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２がルテリオンの表面抗原であることを確認することができた（図２９乃至図３２）。

３−２）抗体が固定された粒子製造
段階１．炭素がコートされた鉄（Ｆｅ）磁性ナノ粒子の製造
鉄アセチルアセトネートヒドレート（０．５）ｍｍｏｌをオクチルエーテル１０ｍＬが入っている三角フラスコに入れて撹はんしながら金属前駆体溶液を製造した後、超音波照射機を利用して１０分間２０ｋＨｚ（５０％）強度で超音波を照射した。金属前駆体溶液に超音波を照射するにつれ初期に橙色であった溶液が時間が過ぎると黒褐色に変わることを観察することができたが、前記のような変化は酸化鉄（Ｆｅ_２Ｏ_３）磁性ナノ粒子が成功的に製造されたことを意味する。前記酸化鉄磁性ナノ粒子が製造された混合溶液に過量のエタノールを添加して生成された磁性ナノ粒子を析出した後、遠心分離を行って磁性ナノ粒子と上澄み液を分離して、上澄み液は除去した。前記の洗浄過程を３回以上繰り返した後、磁性ナノ粒子を５０℃の温度で１２時間乾燥して３００ｎｍの大きさを有する酸化鉄磁性ナノ粒子を製造した。前記製造された酸化鉄磁性ナノ粒子を６００℃で３時間アルゴン（Ａｒ）雰囲気下で熱処理して炭素がコートされた鉄−磁性ナノ粒子を得た。

段階２．カルボキシル基がコートされた磁性ナノ粒子製造
段階１で得た炭素がコートされた鉄−磁性ナノ粒子（０．５ｇ）とｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ １ｇをシランポリエチレングリコールカルボキシル酸５ｍｌと共にエタノール２５ｍｌに分散させた後、２４時間反応した。反応が終了した後、遠心分離して得られた沈殿物はエタノールを利用して洗浄した後、真空オーブンで乾燥して炭素とカルボキシル基が二重コートされた鉄−磁性ナノ粒子を得た。前記二重コートされた粒子製造段階を模式図で示した（図３３の前方）。

段階３：抗体が固定された粒子製造
抗−ＣＤ３９抗体、抗−ＣＤ７３抗体、抗−ＣＤ１３３抗体または抗−ＣＤ３３２抗体をチオール反応性試薬と反応させてチオール化させた。段階２で製造されたカルボキシル基官能基が導入された鉄磁性ナノ粒子と前記チオール基を有する抗体を反応させて前記鉄磁性ナノ粒子に前記抗体を付着させた。前記抗体が固定された粒子を模式図で示した（図３３の後方）。

３−３）植物または食品由来ルテリオンの分離
１００〜２００ｕｌ植物抽出物と５ｕｌ ＣＤ３９抗体−鉄磁性ナノ粒子またはＣＤ７３抗体−鉄磁性ナノ粒子をビーカーに入れて、３０分間結合させた後、磁石分離器に１〜２分置いてルテリオン−磁性ナノ粒子を集めて上澄み液を捨てて洗浄した。前記ルテリオンと結合された鉄磁性ナノ粒子に０．０３３ｗｔ％ ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）／ＰＢＳ緩衝溶液を加えて、２５℃で１時間インキュベーティング（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）させた後、磁石を利用してＢＳＡが吸着された鉄磁性ナノ粒子のみを分離して、ＢＳＡが吸着された鉄磁性ナノ粒子に再び一定量のＰＢＳを加えてインキュベーティング（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）を介して脱着させた。吸着されたＢＳＡは、ＦＰ−６４０分光蛍光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）（ＪＡＳＣＯ）により２８０ｎｍで標準検量線法を利用して定量分析を行った（放出スリット：０．５ｎｍ、吸収スリット：０．５ｎｍ）。前記鉄磁性ナノ粒子を使用した植物または植物のルテリオン分離段階を模式図で示した（図３４）。

３−４）分離されたルテリオンの確認
前記３−３）で分離したルテリオンと（２）濾過による分離方法で分離したルテリオンの中でＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２に結合する抗体に抗−ＦＩＴＣを結合させて発色有無を観察した（図３５の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ））。蛍光活性化セルソーターを介して前記二つの分離方法の抽出収を比較した。

その結果、ナノフィルタリング方法を利用して分離した場合、ルテリオン数は１．５×１０^８個／ｍｌである反面、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２表面抗原に結合する粒子を利用して分離した場合ルテリオンの数は７．１８×１０^８個／ｍｌでナノフィルタリング方法に比べてルテリオンの数が４倍以上増加したことを確認した（図３６の（ａ）および（ｂ））。

表５に示された通り、ナノフィルタリング方法を利用する場合、５０〜４００ｎｍの大きさのルテリオン最終抽出率は４０〜４５％、紛失率は５０〜６０％である反面、本発明のＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２表面抗原に結合する抗体−鉄ナノ粒子分離方法を利用する場合、５０〜４００ｎｍの大きさのルテリオン最終抽出率は９０〜９５％以上であり、紛失率は１０％以下で、抽出率および効率が非常に高まることを確認することができた。

このような結果から、ナノフィルターを使用した従来のルテリオン分離方法より本発明のルテリオン表面抗原に結合する抗体またはアプタマーが固定された粒子を利用した分離方法が最終抽出率は増加し分離過程中生じる紛失率は低下することを確認することができた。

（４）植物ミトコンドリアとルテリオンの差確認
表６でのように植物ミトコンドリアは、ＣＤ３３２、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３およびＣＤ３２６中いずれか一つの表面抗原も発現できないだけでなく、１４０，０００ｇ以上で遠心分離時ミトコンドリアは裂けるが、ルテリオンは形状を維持したまま存在することを確認した。また、分裂を誘導するための加圧、例えば、３５，０００ｐｓｉ以上を適用すると、ミトコンドリアは裂けるが、ルテリオンは形状を維持したまま存在することを確認した。

実施例２：ルテリオンの固定
運動性があるルテリオンおよびＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２を表面抗原として含むルテリオンを固定して数を確認した。ＩＲを照射して集まるルテリオンを確認して、ルテリオンに抗−ＣＤ３３２、抗−ＣＤ３９、抗−ＣＤ１３３または抗−ＣＤ７３抗体を結合させて、抗−ＦＩＴＣを結合させて発色が確認されたルテリオン、ミトトラッカーで染色して染色されたルテリオンの数をカウトした。この時、ｐＨ１〜３、０℃以下、−９０〜０℃条件でルテリオンを固定してルテリオン数をカウントした結果をｐＨおよび温度条件により下記の表７および８に示した（＋はカウントされたルテリオンの数を示す）。

表７および８によると、ｐＨ１〜３および−９０〜０℃条件で１〜３ヶ月維持する場合、ルテリオン数に影響せず固定されたまま保存できることを確認することができる。

実施例３：圧力を利用したルテリオンの分裂誘導
実施例１で分離されたルテリオンに表９のようにフレンチプレス（ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ）を介して圧力を加えた。また、温度によりルテリオンの分裂誘導への影響を確認した（＋は分裂程度を示す）。

表９および図１１乃至１３によると、ｐＨ１〜３、２５０００〜３５，０００ｐｓｉ、１０〜２０℃の温度条件で分裂が誘導されて、ルテリオンの増殖が行われることを確認することができる。

実施例４：ルテリオンの特性
（１）構造
実施例１で取得されたルテリオン中約５０〜４００ｎｍの大きさを有するルテリオンを共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ）、透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、原子力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）および共焦点スキャナ（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＳＰ８）で撮影して、ルテリオンもミトコンドリアと類似するように二重膜または多重膜を有する膜構造として内部クリステ（ｃｒｉｓｔａｅ）構造を完成しなかった状態の構造を有して、ミトコンドリアと同じレーザー波長範囲で観察されることを確認した。また、その形態は原形ないし楕円形であることを観察することができた（図６）。

さらに、実施例１で分離されたルテリオンをＴＥＭ電子顕微鏡で撮影した結果、図８に示された通り、二重膜または多重膜構造を有することを確認することができた。

（２）染色特性
実施例１で取得されたルテリオン中約５０〜８００ｎｍの大きさを有するルテリオンをミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）、ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）で染色した後、その発色有無を観察した。その結果、ルテリオンもミトトラッカー、ローダミン１２３、ヤヌスグリーンＢによって発色が確認されることを確認した（図２、図３および図５参照）。

（３）自家蛍光
実施例１で取得されたルテリオン中約５０〜８００ｎｍの大きさを有するルテリオンは、光反応を示すことを蛍光写真で確認した（図４参照）。

（４）ルテリオンにＲＮＡ含有の有無分析
実施例１で分離された２００〜４００ｎｍのルテリオンの原子顕微鏡撮影結果、図９に示された通り、ルテリオンにＲＮＡやＤＮＡのような核酸が含まれていると推定することができる。

実施例１で分離された２００〜４００ｎｍのルテリオンから総ＲＮＡとＤＮＡを分離するために、ＱＩＡＧＥＮキット（ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｉｃｒｏ ｋｉｔ：Ｃａｔ ８０２８４）を使用して分離した後、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ ＲＮＡ（ＤＮＡ） ＳｔｄＳｅｎｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）チップを利用して定量した。

ルテリオンを遠心分離（８０００ｇ、１時間３０分）して回収した後、キット内分解緩衝液ＲＬＴ ｐｌｕｓ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｃａｎａｔｅ、ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）５０ｕｌにベーターメルカプトエタノール３．５ｕｌを添加して２０ゲージ針付き注射器を利用して５〜１０回通過させてルテリオンを溶解させた。サンプル分解緩衝液をＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ ｓｐｉｎカラムに移した後、遠心分離（≧８０００ｇ、１５秒）してカラムにかかっているＤＮＡとカラムを通過したＲＮＡが含まれたバッファーでそれぞれ分離した。

まずカラムを通過したバッファーに同じ体積の３５０ｕｌ ７０％エタノールを入れてよく混ぜた後、７００ｕｌの混合液をＲＮｅａｓｅ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｓｐｉｎカラムに移して遠心分離（≧８０００ｇ、１５秒）してカラムを通過したバッファーは除去した。それぞれの７００ｕｌ ＲＷ１、５００ｕｌのＲＰＥバッファーと８０％エタノールを利用して段階的にカラム洗浄を進行した。前記で使用されたすべての遠心分離（≧８０００ｇ、１５秒）は、同じ条件で進行した。ＲＮＡを得るために、１４ｕｌ ＲＮｅａｓｙ−ｆｒｅｅ溶液をカラムに入れた後、遠心分離（≧８０００ｇ、６０秒）してルテリオンＲＮＡを分離した。

ゲノムＤＮＡは前記最初の過程でＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ ｓｐｉｎカラムに付着されたＤＮＡをそれぞれの５００ｕｌ ＡＷ１と５００ｕｌ ＡＷ２バッファーを利用して洗浄した。前記使用されたすべての遠心分離（≧８０００ｇ、１５秒）速度と時間は、ＲＮＡ分離過程と同じ条件下で進行した。５０ｕｌ ＥＢバッファーをカラムに入れた後、室温に２〜５分間放置後、遠心分離（≧８０００ｇ、６０秒）してルテリオンＤＮＡを分離した。Ｅｘｐｅｒｉｏｎ ＲＮＡ（ＤＮＡ）ＳｔｄＳｅｎｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）チップを利用して定量した結果、図１０Ａおよび図１０Ｂに示された通り、ルテリオンにＲＮＡが含まれているだけでなく、図１０Ｃに示された通り、ＤＮＡも含まれていることを確認することができた。特に、２００〜４００ｎｍのルテリオンにＲＮＡとＤＮＡが含まれていることを確認することができた。

実施例５：ルテリオンの培養
（１）実施例１で取得されたルテリオン中大きさが約５０〜２００ｎｍのルテリオンにＰＢＳを添加してＩＲ光線を照射した後、約３時間１８〜３０℃で培養した。ＩＲ光線を照射した直後から約１時間間隔でルテリオンの大きさを顕微鏡で確認した。約１〜６時間後、培養前のその大きさが約２００ｎｍであるルテリオンが約５００ｎｍに成長していることを確認することができた。これにより、ルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射下に１８〜３０℃で培養する場合、その大きさを５００ｎｍ程度まで成長させることができることが分かった。

（２）実施例１で取得されたルテリオン中大きさが約４００〜８００ｎｍのルテリオンにＰＢＳを添加してＩＲ光線を照射した後、約３時間１８〜３０℃で培養した。ＩＲ光線を照射した直後から約１時間間隔でルテリオンの大きさと状態を顕微鏡で確認した。約１〜６時間後、培養前のその大きさが約４００〜８００ｎｍのルテリオンが成長はせず分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）されることを確認した。

（３）グルコースを５％濃度で添加した培地（ＤＭＥＭまたは血液培地）を使用して、ｐＨ７および２０℃条件でルテリオンを培養した。ＩＲを照射して集まるルテリオンを確認して、ルテリオンに抗−ＣＤ３３２、抗−ＣＤ７３、抗−ＣＤ１３３、抗−ＣＤ３９抗体を結合させて、抗−ＦＩＴＣを結合させて発色が確認されたルテリオン、ミトトラッカーで染色して染色されたルテリオンの数をカウントした。その結果を下記の表１０に示した（＋はルテリオン数の相対的比を示す）。

実施例６：細胞内導入の有無確認
ルテリオンをＰＫＨ２６−１、ＰＫＨ２６−２、ＰＫＨ２６−３赤色蛍光で蛍光染色して、Ａ５４９ヒ素細胞性肺癌細胞（ＡＴＣＣ♯：ＣＣＬ−１８５）と２４時間インキュベーションした。細胞を固定して形態を顕微鏡で観察した。その結果を図１４乃至図１６に示した。

図１４を参照すると、ＰＫＨ２６−１、ＰＫＨ２６−２、ＰＫＨ２６−３赤色蛍光で染色されたルテリオンがＤＡＰＩで染色された細胞内核に導入されることを確認することができ、図１５および１６の拡大イメージを確認した結果、細胞内核にルテリオンが導入されることをより具体的に確認することができる。

実施例７：ＢＢＢ（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）透過の有無確認
マウスにＰＫＨ２６で蛍光染色されたルテリオンを腹腔内注射（ＩＰ）および経口胃管投与法で投与して、投与されたルテリオンがＢＢＢを通過するか否かを確認した。図１７によると、経口胃管投与時少なくとも３時間以後ＢＢＢを通過することを確認することができる。

また、図１８によると、腹腔内注射時５分以内にＢＢＢを通過することを確認することができ、図１９によると、腹腔内注射後２４時間経過後にも心臓、肺、脾臓、肝、すい臓、腎臓、睾丸、腹部および臓前身に分布することを確認することができる。

実施例８：ルテリオンの坑癌（テロメア／テロメラーゼ活性）効果確認
（１）癌細胞のテロメラーゼ活性阻害
正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）および癌細胞（ＮＣｌ−Ｈ１９７５、ＭＤＡ−ＭＡ−４６８、ＷｉＤｒ）１×１０^６細胞／ｍｌをそれぞれ６０ｍｍプレートに接種した後、約１２時間後に実施例１で分離されたルテリオンを５０μｇ／ｍｌの濃度で処理して培養した。細胞培養は、抗生剤ＰＳＦ（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）がない条件で、１％ＦＢＳ条件で３７℃、５％ＣＯ_２培養器で行って、１％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地を使用して細胞接種４８ｈｒ後にそれぞれ収穫してテロメラーゼ活性を測定した。

ＴＲＡＰ分析で（ＴＲＡＰｅｚｅ（登録商標） Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））テロメラーゼ活性を分析した結果、ルテリオン処理によって癌細胞（ＮＣｌ−Ｈ１９７５、ＭＤＡ−ＭＡ−４６８、ＷｉＤｒ）のテロメラーゼ発現および活性が減少することを確認することができた（図２０のＢ）。

また、正常細胞であるＦｉｂｒｏｂｌａｓｔを対象に、同じ実験と分析を行った結果、ヒト正常細胞では対照群（ルテリオン未処理群）に比べてテロメラーゼ発現および活性が増加することを確認することができた（図２０のＡ）。

（２）ルテリオン処理による癌細胞増殖抑制
種々のヒト癌細胞株（肺癌（ＮＣＩ−Ｈ１９７５）、大腸癌（ＷｉＤｒ）、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−４８６）、肝臓癌（ＨＣＣ３８）、白血病（ＡＧＨ−７７））および正常細胞株（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）でルテリオンの癌細胞に対する細胞毒性を測定するためにＭＴＴ分析を実施した。

５×１０^４細胞／ｍｌ（８×１０^３／ｗｅｌｌ）の細胞浮遊物を９６−ウェル（ｗｅｌｌ）底が平らなマイクロタイター板の各ウェル（ｗｅｌｌ）に１００ｕｌずつ接種して２４時間培養させた後、様々な濃度のルテリオンを含んでいる培地に取り替えた後、さらに４８時間培養させた。その後、各ウェルに培地で１０倍希釈された非水溶性の黄色ＭＴＴ（３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙｌ）−２、５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液１００ｕｌを添加する。細胞内のホルマザン結晶が生成されるように、３７℃温度および５％二酸化炭素濃度のインキュベーターに保管した。約４時間後、余分の培地を除去した後、細胞内形成された非水溶性のホルマザンを溶解させるために各ウェルにＤＭＳＯを２００ｕｌずつ添加した後、マイクロプレートリーダーを利用して５９５ｎｍで吸光度を分析した。

ルテリオンを処理しなかった対照群の吸光度を１００％にして、各濃度に対する癌細胞の生存率を測定した結果、濃度依存的に癌細胞の生存率を減少させた。一方、正常細胞では細胞毒性がなかった（図２１）。

さらに、前記癌細胞株の他にＡｓＰＣ−１すい臓癌細胞株、Ａ５４９肺癌細胞株、ＢＴ−２０乳癌細胞株で多様な由来のルテリオンの癌細胞増殖抑制効果を確認した。細胞生存率測定は、前記ＭＴＴ分析法と同様に行って、実施例１の方法で分離した多様な由来のルテリオンは、癌細胞に対して細胞増殖抑制効果を示した（図２２乃至図２４）。

従って、本発明のルテリオンは、癌細胞の増殖を抑制して癌を予防または治療することができることが分かった。

実施例９：ルテリオンの正常細胞でテロメラーゼ活性増加
正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）１×１０^６細胞／ｍｌをそれぞれ６０ｍｍプレートに接種した後、約１２時間後に実施例１で分離されたルテリオンを５０μｇ／ｍｌの濃度で処理して培養した。細胞培養は抗生剤ＰＳＦ（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）がない条件で、１％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地を使用して３７℃、５％ＣＯ_２培養器で行った。細胞接種４８時間後に収穫してテロメラーゼ活性を測定した。

ＴＲＡＰｅｚｅ（登録商標） Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を利用したＴＲＡＰ分析でテロメラーゼ活性を分析した結果、ルテリオン処理によって正常細胞であるＦｉｂｒｏｂｌａｓｔのテロメラーゼ発現および活性が増加することを確認することができた（図２５）。

実施例１０：ルテリオンのＡＴＰ生成への影響
ルテリオン処理による癌細胞およびＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ正常細胞におけるＡＴＰ生成増加を確認するために、癌細胞３種Ａ５４９、ＷＴＭ２６６−４およびＡｓＰＣ−１および正常細胞（ＭＲＣ−５）１×１０^６細胞／ｍｌを一般ＤＭＥＭ培地の６０ｍｍプレートに接種して１日間培養した後、抗生剤ＰＳＦ（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）がない条件で、０．１％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地を使用して栄養飢餓（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）状態で再び１日間培養した。次に３日目、実施例１で分離したルテリオンを５０μｇ／ｍｌの濃度で処理した後、０、１０、３０、１２０分にＡＴＰ生成を測定した（図２６）。ＡＴＰ測定ｋｉｔは、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）社から購入して使用した。

その結果、ルテリオンを処理した正常細胞でＡＴＰの生成が顕著に増加したことを確認した（図３９）。また、ルテリオンを処理した癌細胞でＡＴＰ生成が低下することを確認した（図３８）。

従って、本発明のルテリオンは、正常細胞のエネルギー生成を増加させて老化を抑制することができることが分かった。また、癌細胞のエネルギー生成を低下させて癌治療に適用することができる。これにより、正常細胞には影響を及ぼすことなく癌細胞特異的坑癌治療を考慮することができる。

本発明によると、植物または食品内に存在する微細物質であるルテリオンを効果的に分離することができ、前記分離されたルテリオンを一定の大きさに成長するように培養することができて、疾病の予防および治療のための様々な用途開発に利用することができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims (35)

1. 下記で選択された一つ以上の特性を有するルテリオン：
   （ａ）５０〜８００ｎｍの原形ないし楕円形で、運動性がある；
   （ｂ）核酸含有；
   （ｃ）免疫化学蛍光染色時ミトコンドリアと類似の反応を示す；
   （ｄ）融合（ｆｕｓｉｏｎ）および／または分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）生態様式を示す；
   （ｅ）融合がない場合には大きさが５００ｎｍまで成熟して、ＤＮＡ含有類似ミトコンドリアに成熟して、ＳＥＭまたはＴＥＭ電子顕微鏡写真上でミトコンドリアと類似する構造を示す；
   （ｆ）エキソソームとは異なる光反応を示す；
   （ｇ）ＩＲ照射時または加圧時分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）が発生する；
   （ｈ）表面抗原としてＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を発現する；
   （ｉ）自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す；
   （ｊ）２００〜４００ｎｍ大きさでＡＴＰを産生する；
   （ｋ）二重膜または多重膜構造；
   （ｌ）付着性がある；
   （ｍ）癌細胞のテロメラーゼ活性抑制；
   （ｎ）正常細胞のテロメラーゼ活性化促進；
   （ｏ）細胞透過能保有；及び
   （ｐ）血液脳関門（ＢＢＢ）透過能保有。
2. ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ）、ＤＡＰＩ、およびヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ ｇｒｅｅｎ Ｂ）で構成される群から選択される一つ以上の染色剤で染色する場合、陽性に染色される特性を有することを特徴とする請求項１に記載のルテリオン。
3. 下記の段階を含むルテリオンの分離方法：
   （ａ）植物または食品の水蒸気またはガス振盪抽出物を冷却して取得した凝縮液を０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して濾過する段階；
   （ｂ）前記濾過された凝縮液を遠心分離する段階；および
   （ｃ）前記遠心分離された上澄み液からルテリオンを分離する段階。
4. 前記植物は、表１〜４で選択される薬用植物であることを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
5. 前記植物は、当帰、漆皮およびキウィで構成された群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
6. 前記段階（ａ）の振盪抽出は、植物または食品に溶媒を添加して、５０〜９０℃で気体を利用して間欠的にバブリングさせながら振盪するように進行することを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
7. 前記振盪抽出は、８〜１０時間振盪して、２〜３時間毎に２０〜３０分間バブリングして植物または食品のルテリオンがかたまらないようにすることを特徴とする請求項６に記載の分離方法。
8. 前記（ａ）段階で取得された凝縮液にＩＲ光線を照射する段階をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
9. 前記遠心分離は、１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間繰り返し行われることを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
10. 前記段階（ｃ）は、遠心分離された上澄み液に２００〜６００ｕｍ波長のＩＲ光線を照射して運動性を有して集まるルテリオン粒子を分離すること、またはルテリオン表面抗原ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２を認知する結合体との結合の有無を確認してルテリオン粒子を分離することを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
11. 前記分離されたルテリオン粒子を５０ｎｍフィルターで濾過した後、フィルターにかかった部位を収集する段階をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
12. ２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍおよび１０００ｎｍのフィルターを順次利用して、それぞれ５０〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、４００〜６００ｎｍ、６００〜８００ｎｍおよび８００〜１０００ｎｍの大きさのルテリオンに分類することをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の分離方法。
13. ｐＨ７以下および０℃以下の条件で固定させる段階をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
14. ｐＨ１〜５および−９０℃〜０℃で固定させる段階をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
15. ２５，０００〜３５，０００ｐｓｉ（ｐｏｕｎｄ ｐｅｒ ｓｑｕａｒｅ ｉｎｃｈ）以上の圧力を加えて分裂を誘導する段階をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
16. ｐＨ１〜３および１０〜２０℃で分裂を誘導して増殖させる段階をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
17. 下記の段階を含むルテリオンの分離方法：
    （ａ）ルテリオンを含有する抽出物にルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体またはアプタマーが固定された粒子を添加してルテリオンと粒子の結合を誘導する段階；および
    （ｂ）前記粒子に結合されたルテリオンを回収する段階。
18. （ｃ）粒子に結合されたルテリオンからルテリオンのみを分離する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
19. 前記ルテリオンを含有する抽出物は、植物抽出物または食品抽出物であることを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
20. 前記ルテリオンを含有する抽出物は、（ｉ）植物または食品の熱水抽出物、（ｉｉ）植物または食品の溶媒抽出物、または（ｉｉｉ）溶媒存在下に植物または食品の加熱によって発生するガスの凝縮液であることを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
21. 前記凝縮液は、下記段階を経て製造されたことを特徴とする請求項２０に記載の分離方法：
    （ａ）植物または食品に溶媒を添加して、５０〜９０℃で気体を利用して間欠的にバブリングしながら振盪する段階；および
    （ｂ）前記振盪によって気化される水蒸気またはガスを捕集した後、冷却させて凝縮液を取得する段階。
22. 前記ルテリオン表面抗原は、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２であることを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
23. 前記粒子は、磁性粒子、シリカ粒子、量子ドット粒子、ガラス粒子、高分子粒子、繊維粒子および蛍光粒子で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
24. 前記磁性粒子は、鉄、アルミニウム、コバルト、ニッケル、マンガン、錫、亜鉛、カドミウム、マグネシウム、銅、バリウム、リチウムまたはイットリウムの酸化物で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載のルテリオンの分離方法。
25. 前記磁性粒子は、炭素および抗体またはアプタマー結合のための官能基で二重コーティングされたことを特徴とする請求項２３に記載のルテリオンの分離方法。
26. 前記官能基は、アミド基（ａｍｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）、エステル基（ｅｓｔｅｒ ｇｒｏｕｐ）、アミン基（ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）およびカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載のルテリオンの分離方法。
27. 前記粒子の大きさは、１０〜１，０００ｎｍであることを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
28. 前記粒子は、磁性ナノ粒子であり、前記（ｂ）段階は、外部から磁力を加えてルテリオンが結合された磁性ナノ粒子を集めた後、回収することを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
29. 前記粒子は、蛍光粒子であり、前記（ｂ）段階は、蛍光利用セルソーターを利用してルテリオンが結合された蛍光粒子を回収することを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
30. 前記粒子は、静電気を帯びた粒子であり、前記（ｂ）段階は、不均一な電場を形成して静電気的引力でルテリオンが結合された粒子を回収することを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
31. 前記粒子は、イオン性粒子であり、前記（ｂ）段階は、静電気的引力を利用してルテリオンが結合された粒子を回収することを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
32. 請求項１に記載のルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射または加圧下に１８〜３０℃で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法。
33. 請求項１に記載のルテリオンを糖含有培地でｐＨ５〜９および１８〜３０℃の条件で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法。
34. 前記糖は、ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）またはキシロース（ｘｙｌｏｓｅ）であることを特徴とする請求項３３に記載の培養方法。
35. 前記培養前および後のルテリオンの大きさは、それぞれ５０〜２００ｎｍおよび３００〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項３２または請求項３３に記載の培養方法。