CN115232191A - 一种具有抗氧化活性党参糖蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种党参糖蛋白的提取方法，包括如下步骤：(a)将党参粉碎过2号筛；(b)将党参粉末在溶媒中浸提；温度为20‑80℃；浸提时党参粉末与溶媒的配比为1g∶6‑10mL，浸提时间为0.5‑2.5h；(c)将所得浸提液过滤，除去滤液中的杂质、游离蛋白与多糖，得到党参糖蛋白粗提取液；(d)将所得党参糖蛋白粗提取液冻干后得到党参粗糖蛋白。本发明所提供的党参糖蛋白提取工艺提取率高、成本低、条件简便，并在后期对粗糖蛋白及党参多糖进行体外抗氧化活性比较，通过N2型秀丽隐杆线虫对粗糖蛋白进行体内抗氧化实验，测定其抗氧化活性。本发明对党参糖蛋白的进一步研究具有一定的参考价值和实际意义，为党参药材的开发利用及标准化研究提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗氧化活性的党参糖蛋白的提取方法。
背景技术
糖蛋白是寡糖与多肽链共价连接的结合蛋白质，广泛存在于植物、动物和微生物中，近年来对糖蛋白的研究日益增多，许多研究发现它具有显著的药用功效和保健功能，如免疫调节、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等。
党参是中国传统的补益药，具有补中益气、健脾益肺的功效，党参中含有萜类、苯丙素苷类、植物甾醇、酚酸类、有机酸类、内酯类物质、生物碱、氨基酸、微量元素等。目前对党参成分含量及活性研究多集中在多糖及党参炔苷，对其糖蛋白的研究还未见报道。
糖蛋白兼具多糖和蛋白质的某些性质，大多数可溶于水、稀盐、稀酸和稀碱等溶液，因此，目前用于中药糖蛋白提取的方法主要有水提、稀盐溶液和缓冲溶液浸提、酸碱溶液提取及酶解法，其中热水浸提及缓冲液浸提最为常用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗氧化活性的党参糖蛋白提取方法。
本发明所提供的党参糖蛋白的提取方法，具体包括如下步骤：
(a)将党参粉碎过2号筛；
(b)将经步骤(a)粉碎后的党参粉末在溶媒中浸提；进行所述浸提时的温度为20-80℃；进行所述浸提时所述党参粉末与所述溶媒的配比为1g∶6-10mL，浸提时间为0.5-2.5h；
(c)将步骤(b)所得浸提液过滤，除去滤液中的杂质、游离蛋白与多糖，得到党参糖蛋白粗提取液；
(d)将步骤(c)所得党参糖蛋白粗提取液冻干后得到党参糖蛋白粗品。
在步骤(b)中，所述溶媒为含有浓度为0.05-0.25mol/LNaCl的pH为7.0-10.0的Tris-HCl缓冲液。
更加具体的，所述溶媒为含有浓度为0.1mol/LNaCl的PH＝9.0的Tris-HCl缓冲液。
在步骤(b)中，所述浸提时间为0.5-2.5h，浸提温度为20-80℃，所述党参粉末与所述溶媒的配比为1g∶6-10mL。
更加具体的，所述浸提时间为1h，浸提温度为40℃，所述党参粉末与所述溶媒的配比为1g∶8mL。
在步骤(c)中，所述除去杂质和多糖的操作为加硫酸铵至70％，4℃下静置12h后以6000r/min速度离心6min，弃去上清液，得沉淀。
在步骤(c)中，所述除去游离蛋白的方法为：将权利要求6所述沉淀加少量Tris-HCl缓冲液溶解，加入与该溶液体积比为2∶1的sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝2∶1)，剧烈振摇20min后，以6000r/min速度离心6min，倾出上清液，除去中间层沉淀和下层溶液，重复该步骤至中间层无沉淀产生。
在步骤(c)中，所述透析为，将权利要求7所述上清液置透析袋于pH＝9.0的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中透析24h后，得到党参糖蛋白粗提取液。
在步骤(d)中，所述冻干为，将权利要求8所述党参糖蛋白粗提取液经冷冻干燥48h，得到粉末状党参糖蛋白粗品。
利用本发明所提供的党参糖蛋白提取方法所得的党参糖蛋白粗提取液或党参糖蛋白粗品，及对其进行的以下实验：
(1)体外抗氧化实验：包括ABTS自由基清除率测定及与党参多糖的抗氧化活性比较；
(2)通过N2型秀丽隐杆线虫进行的体内抗氧化实验：包括氧化应激实验、热应激实验。
本发明中所述党参为素花党参Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen的干燥根。
本发明采用单因素实验对党参糖蛋白的提取工艺进行优化，确定了一套提取率高、成本低、条件简便的提取工艺，并对所得粗蛋白通过N2型秀丽隐杆线虫和自由基清除率进行体内外抗氧化实验，测定其抗氧化活性。本发明对党参糖蛋白的进一步研究具有一定的参考价值和实际意义，为党参药材的开发利用及标准化研究提供了新思路。
附图说明
图1为蛋白质含量的标准曲线。
图2为多糖含量的标准曲线。
图3为缓冲液pH值对党参糖蛋白提取率的影响。
图4为温度对党参糖蛋白提取率的影响。
图5为盐浓度对党参糖蛋白提取率的影响。
图6为液料比对党参糖蛋白提取率的影响。
图7为提取时间对党参糖蛋白提取率的影响。
图8为不同浓度党参糖蛋白及党参多糖对ABTS自由基的清除率。
图9为不同浓度党参糖蛋白对N2型秀丽隐杆线虫抗热应激能力的影响。
图10为不同浓度党参糖蛋白对N2型秀丽隐杆线虫抗氧化应激能力的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例详细描述本发明，但不以任何形式限制本发明。
党参购于甘肃省陇南市文县任和农副产品有限公司，经北京中医药大学中药鉴定与资源系王晶娟教授鉴定为桔梗科植物素花党参Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen的干燥根。
1、药材预处理
(1)将党参药材润透后切2-4mm厚片，40℃烘干，得党参饮片。
(2)取党参饮片用粉碎机粉碎，过2号筛，得党参粉末。
2、含量测定
(1)党参糖蛋白蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝法测定党参糖蛋白中蛋白质的含量；考马斯亮蓝G-250试剂的制备及标准曲线的制作参考2020版药典。
结果显示，蛋白质标准曲线的回归方程为：y＝y＝22.407x+0.01(R2＝0.9991)，该回归方程具有较好的线性关系。见图1。
(2)党参糖蛋白多糖含量测定：采用苯酚-浓硫酸法测定党参糖蛋白中多糖的含量；标准曲线的制作参考[张娟娟，熊越怀，贺文彬，等.响应曲面试验优选远志糖蛋白的提取工艺[J].中华中医药杂志，2016，31(10)：4226-4229.]。
结果显示，多糖标准曲线的回归方程为：y＝35.601x+0.0014(R2＝0.9993)，该回归方程具有较好的线性关系。见图2。
3、单因素试验设计
(1)溶媒的确定：称取步骤1党参粉末各10g，分别加入去离子水、pH＝8.0Tris-HCl缓冲液(CNaCl＝0.1mol/L)80mL，于40℃水浴条件下浸提2h，抽滤，滤液加入硫酸铵至70％，4℃下静置12h后以6000r/min离心6min，除去上清液，沉淀加少量去离子水或Tris-HCl缓冲液溶解，加入溶液体积1/2的sevage试剂，剧烈振摇20min后以6000r/min离心6min，取上清液，重复操作至无沉淀产生。将上清液置透析袋于去离子水或pH＝8.0的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中透析24h后测定多糖及蛋白质含量。
表1党参糖蛋白得率
结果显示，Tris-HCl缓冲液浸提对党参糖蛋白的提取率高于热水浸提。
(2)缓冲液pH值的影响：称取步骤1党参粉末各10g，分别加入pH＝7.0、8.0、9.0、10.0的Tris-HCl缓冲液(CNaCl＝0.1mol/L)80mL，于40℃水浴条件下浸提2h，抽滤，滤液加入硫酸铵至70％，4℃下静置12h后以6000r/min离心6min，除去上清液，沉淀加少量相应pH值的Tris-HCl缓冲液溶解，加入溶液体积1/2的sevage试剂，剧烈振摇20min后以6000r/min离心6min，取上清液，重复操作至无沉淀产生。将上清液置透析袋于相应pH值的0.05mol/LTris-HCl缓冲液中透析24h后测定多糖及蛋白质含量。
结果如图3所示，由图可知，pH＝9.0时，多糖及蛋白质的提取率达到最高。
(3)提取温度的影响：称取步骤1党参粉末各10g，根据(2)的实验结果，加入pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液(CNaCl＝0.1mol/L)80mL，分别于20、40、60、80℃水浴条件下浸提2h，抽滤，滤液加入硫酸铵至70％，4℃下静置12h后以6000r/min离心6min，除去上清液，沉淀加少量Tris-HCl缓冲液溶解，加入溶液体积1/2的sevage试剂，剧烈振摇20min后以6000r/min离心6min，取上清液，重复操作至无沉淀产生。将上清液置透析袋于pH＝9.0的0.05mol/LTris-HCl缓冲液中透析24h后测定多糖及蛋白质含量。
结果如图4所示，由图可知蛋白质提取率在40℃时达到最高，随后呈下降趋势；多糖提取率则随温度升高而升高，这可能是由于温度升高在增大多糖提取率的同时会破坏蛋白质的活性，故最佳提取温度为40℃。
(4)盐浓度的影响：取步骤1党参粉末各10g，根据(2)(3)的实验结果，分别加入pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液(CNaCl＝0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mol/L)80mL，于40℃条件下浸提2h，抽滤，滤液加入硫酸铵至70％，4℃下静置12h后以6000r/min离心6min，除去上清液，沉淀加少量Tris-HCl缓冲液溶解，加入溶液体积1/2的sevage试剂，剧烈振摇20min后以6000r/min离心6min，取上清液，重复操作至无沉淀产生。将上清液置透析袋于pH＝9.0的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中透析24h后测定多糖及蛋白质含量。
结果如图5所示，由图可知盐浓度为0.1mol/L时提取率最高。
(5)液料比的影响：取步骤1党参粉末各10g，根据(2)(3)(4)的实验结果，加入pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液(CNaCl＝0.1mol/L)20、40、60、80、100mL，于40℃条件下浸提2h，抽滤，滤液加入硫酸铵至70％，4℃下静置12h后以6000r/min离心6min，除去上清液，沉淀加少量Tris-HCl缓冲液溶解，加入溶液体积1/2的sevage试剂，剧烈振摇20min后以6000r/min离心6min，取上清液，重复操作至无沉淀产生。将上清液置透析袋于pH＝9.0的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中透析24h后测定多糖及蛋白质含量。
结果如图6所示，由图可知料液比为1∶8时，蛋白质的提取率最高；料液比为1∶6时多糖提取率最高，但和1∶8时相差不大，且多糖提取率受其他因素干扰较大，故综合考虑料液比选择1∶8。
(6)提取时间的影响：取步骤1党参粉末各10g，根据(2)(3)(4)(5)的实验结果，加入pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液(CNaCl＝0.1mol/L)80mL，于40℃条件下浸提0.5、1、1.5、2、2.5h，抽滤，滤液加入硫酸铵至70％，4℃下静置12h后以6000r/min离心6min，除去上清液，沉淀加少量Tris-HCl缓冲液溶解，加入溶液体积1/2的sevage试剂，剧烈振摇20min后以6000r/min离心6min，取上清液，重复操作至无沉淀产生。将上清液置透析袋于pH＝9.0的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中透析24h后测定多糖及蛋白质含量。
结果如图7所示，由图可知提取时间为1h时，提取率最高。
4、党参糖蛋白及多糖的体外抗氧化活性比较
(1)党参多糖的制备：精密称取党参2.0g，料液比1∶20回流1h，重复两次，抽滤，合并滤液。取1/2滤液浓缩，去离子水定容至5mL后，加硫酸铵至饱和，4℃静置12h，离心(8000r/min，10min)后取上清液定容至10mL，加无水乙醇至含醇量80％，静置12h后离心(8000r/min，10min)，将所得沉淀复溶后去离子水透析24h，透析内液冻干后得党参多糖冻干粉。
(2)溶液的配制：
样品溶液的配制：分别精密称取党参糖蛋白及党参多糖冻干粉各100mg，去离子水溶解，定容至5mL，稀释至0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mg/mL，即得。
维生素c溶液的配制：精密称定维生素c10mg，去离子水溶解，定容至10mL，稀释至0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20mg/mL，即得。
ABTS·+母液的配制：精密称取ABTS 35mg及过硫酸钾10mg，分别用去离子水定容至10mL，将两溶液1∶1混合，避光静置12h，得ABTS·+母液。使用时，将母液用去离子水稀释至在波长734nm处吸光度为0.7(±0.02)。
(3)清除率的测定：在96孔板中依次加入不同浓度的样品溶液10μL和ABTS水溶液200μL，充分混匀后避光静置6min，在734nm处测定吸光度，记为A，每个浓度平行3次；空白组为10μL去离子水和200μLABTS水溶液混合，吸光度记为A0；对照组为10μL样品溶液和200μL去离子水混合，吸光度记为A1。以Vc为阳性对照。
ABTS清除率％＝[1-(A-A1)/A0]*100％。
结果如图8所示，党参糖蛋白和党参多糖对ABTS自由基的清除率随浓度增大而增大，在20mg/mL时清除率均能达到99％，几乎与Vc最高清除率持平，表明党参糖蛋白、多糖均具有很强的ABTS自由基清除活性，有良好的体外抗氧化活性。此外，经数据分析，党参糖蛋白及多糖对ABTS自由基清除活性的IC50分别为3.499mg/mL及4.505mg/mL，表明党参糖蛋白对ABTS自由基的清除活性强于党参多糖。
5、以N2型秀丽隐杆线虫为模型的体内抗氧化实验
(1)N2型秀丽隐杆线虫的裂解同步化
将产卵期的线虫转移至涂OP50的有NGM培养基上，滴加裂解液裂解后于培养箱中培养，得同期化线虫。
(2)抗热应激实验
将产卵期的线虫在显微镜下挑至涂有不同浓度含药OP50的培养基上裂解同步化，发育至成虫后挑至新培养基(每板20条)，于35℃下培养，每隔1h记录存活个数，直至线虫全部死亡。
结果见图9，在高温条件下，各浓度加药组与对照组相比，线虫平均寿命延长，生存曲线明显右移，表明党参糖蛋白能增强线虫抗热应激的能力，且作用具有剂量依赖性。
(3)抗氧化应激实验
将产卵期的线虫在显微镜下挑至涂有不同浓度含药OP50的培养基上裂解同步化，发育至成虫后挑至含30％双氧水的培养基(每板20条)，每隔1h记录存活个数，直至线虫全部死亡。
结果见图10。
浓度为5mg/mL和10mg/mL的党参糖蛋白均能延长线虫平均寿命，其生存曲线较对照组都明显右移，表明党参糖蛋白具有抗氧化应激的能力。
Claims (10)
1.一种党参糖蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(a)将党参粉碎过2号筛；
(b)将经步骤(a)粉碎后的党参粉末在溶媒中浸提；进行所述浸提时的温度为20-80℃；进行所述浸提时所述党参粉末与所述溶媒的配比为1g∶6-10mL，浸提时间为0.5-2.5h；
(c)将步骤(b)所得浸提液过滤，除去滤液中的杂质、游离蛋白与多糖，得到党参糖蛋白粗提取液；
(d)将步骤(c)所得党参糖蛋白粗提取液冻干后得到党参糖蛋白粗品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述溶媒为含有浓度为0.05-0.25mol/LNaCl的pH为7.0-10.0的Tris-HCl缓冲液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述溶媒为含有浓度为0.1mol/LNaCl的PH＝9.0的Tris-HCl缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述浸提时间为0.5-2.5h，浸提温度为20-80℃，所述党参粉末与所述溶媒的配比为1g∶6-10mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于；步骤(b)中，所述浸提时间为1h，浸提温度为40℃，所述党参粉末与所述溶媒的配比为1g∶8mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(c)中，所述除去杂质和多糖的操作为加硫酸铵至70％，4℃下静置12h后以6000r/min速度离心6min，弃去上清液，得沉淀。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(c)中，所述除去游离蛋白的方法为：将权利要求6所述沉淀加少量Tris-HCl缓冲液溶解，加入与该溶液体积比为2∶1的sevage试剂，剧烈振摇20min后，以6000r/min速度离心6min，倾出上清液，除去中间层沉淀和下层溶液，重复该步骤至中间层无沉淀产生。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(c)中，所述透析为，将权利要求7所述上清液置透析袋于pH＝9.0的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中透析24h后，得到党参糖蛋白粗提取液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(d)，所述冻干为，将权利要求8所述党参糖蛋白粗提取液经冷冻干燥，得到粉末状党参糖蛋白粗品。
10.权利要求8及权利要求9所述党参糖蛋白粗提取液或党参糖蛋白粗品进行的以下实验：(1)体外抗氧化实验：党参多糖及糖蛋白ABTS自由基清除率的测定及比较；(2)通过N2型秀丽隐杆线虫进行的体内抗氧化实验：包括抗氧化应激实验、抗热应激实验。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116178583A (zh) * | 2023-03-10 | 2023-05-30 | 西北民族大学 | 党参多糖酸剪切片段cpp-1-1及其制备方法和应用 |
| CN118140999A (zh) * | 2024-05-09 | 2024-06-07 | 长春中医药大学 | 一种含有人参糖蛋白脂质体的速溶咖啡及其制备方法 |
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- 2021-04-22 CN CN202110445595.1A patent/CN115232191A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
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